用于抑制COX‑2的mRNA表达的倍半萜类化合物及其提取方法与流程

本发明涉及一类用于抑制COX-2的mRNA表达的倍半萜类化合物及其提取方法。

背景技术：

千年健为常用中药，系天南星科 (Araeeae)植物千年健Homalomena occulta(Lour.) Schott的干燥根茎，别名：一包针、千颗针、千年见、丝棱线，为多年生草本植物，根茎肉质，绿色，细长，直径1~2厘米，粗糙。叶互生；具长柄，柄长18~25厘米，肉质，绿色，平滑无毛，基部扩大成淡黄色叶鞘，包着根茎，叶鞘长约3~5厘米，脱落或宿存；叶片卵状箭形，长11~15厘米,宽7~11厘米，先端渐尖，基部箭形而圆，开展，全缘，表面绿色，背面淡绿色，两面平滑无毛，侧脉平行向上斜升，干后呈有规则的皱缩。花为肉穗花序；佛焰苞管部宿存，片部脱落；花单性，无花被。果实为浆果。花期3~4月。该属植物约140种，分布于热带亚洲和美洲，我国有3种：海南千年健、千年健和台湾千年健，生于林中水沟附近的阴湿地，产西南、华南和中国台湾。

该中药味辛，性温，有小毒。入肝、肺、肾经；具有祛风湿、壮筋骨、止痛、消肿等功效；主要用于治疗风湿痹痛，肢节酸痛，筋骨疹软，胃痛，痈疽疮肿。用于风湿痹痛、腰膝冷痛、下肢拘挛麻木等。临床上主要用于治疗止胃痛、痈痞疮疽、杀虫败毒、消肿排脓、祛风湿痹痛、强筋骨、治肢节酸疼、治风气痛、筋骨痪软，半身不遂。药理学研究表明，千年健在抗老年痴呆、抗骨质疏松、抗病原微生物、抗炎等方面均有良好的活性。

研究表明，千年健中分离得到的倍半萜类化合物能有效的抑制LPS诱导巨噬细胞中NO的释放，具有较好的抗炎活性 [Zhao F, Sun C, Ma L, et al. New sesquiterpenes from the rhizomes of Homalomena occulta [J]. Fitoterapia, 2015, 109: 113-118]。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一类用于抑制COX-2的mRNA表达的倍半萜类化合物及其提取方法。

用于抑制COX-2的mRNA表达的倍半萜类化合物，结构式如下：

。

上述用于抑制COX-2的mRNA表达的倍半萜类化合物的提取方法，其特征在于具体步骤为：

1）将中药千年健用体积百分数为30%～95%的乙醇、体积百分数为30%～100%的甲醇、乙酸乙酯或丙酮室温冷浸提取、加热回流提取或室温渗漉提取，减压浓缩提取液至无有机溶剂，得总浸膏A；

2）将总浸膏A溶于水后，用60-90℃的石油醚萃取，减压浓缩并回收溶剂，分别得到石油醚部位B和水部位；

3）对石油醚部位B进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯或石油醚-丙酮为洗脱剂洗脱，等份收集洗脱液，每份洗脱液采用TLC定性检测，合并含相同成分的洗脱液，得到三个不同的浸膏组分C、D和E；

4）对浸膏C进行硅胶柱层析，分别用氯仿-丙酮和石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂反复洗脱，分离纯化，得到纯化合物1和3；对浸膏D进行硅胶柱层析，用氯仿-丙酮和石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂反复洗脱，然后进行葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析，用氯仿-甲醇为洗脱剂进一步洗脱，分离纯化，得到纯化合物2；对浸膏E进行硅胶柱层析，用石油醚-氯仿和石油醚-丙酮作为洗脱剂反复洗脱，分离纯化，得到纯化合物4。

步骤1）中千年健与提取溶剂的质量体积比为1:5～1:20 kg/ L。

步骤1）中所述室温冷浸提取每次5～9天，浸提1～4次；所述加热回流提取每次1～3小时，提取1～4次。

步骤3和4）所述硅胶柱层析所用硅胶的目数为200-300目。

步骤3和4）所述硅胶柱层析所用洗脱剂石油醚-乙酸乙酯中石油醚与乙酸乙酯的体积比为30:1～1:3，石油醚-丙酮中石油醚与丙酮的体积比为30:1～2:1，氯仿-丙酮中氯仿和丙酮的体积比为30:1～3:1，石油醚-氯仿中石油醚和氯仿的体积比为10:1～2:1。

步骤4）所述葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析所用洗脱剂氯仿-甲醇中氯仿和甲醇的体积比为100:0～0:100。

对化合物1-4进行逆转录·聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）实验测试，实验证实，化合物1-4可用于抑制COX-2的mRNA表达，并呈现浓度依赖性。

本发明所述提取方法具有较高的收率，成本低、耗时短，操作简便，且所得产品纯度高，并且用于抑制COX-2的mRNA表达，适宜作为标准品及药物开发用。

附图说明

图1：RT-PCR实验测定化合物1对COX-2 的mRNA表达水平的剂量依赖性。

图2：RT-PCR实验测定化合物2对COX-2 的mRNA表达水平的剂量依赖性。

图3：RT-PCR实验测定化合物3对COX-2 的mRNA表达水平的剂量依赖性。

图4：RT-PCR实验测定化合物4对COX-2 的mRNA表达水平的剂量依赖性。

具体实施方式

下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本发明所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以与任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此，除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

实施例1：化合物1和3的提取纯化实验

①将中药千年健13.0 kg，粉碎，用130 L 85%的乙醇加热回流提取3次，每次2h，减压浓缩提取液至无有机溶剂，得总浸膏A，约410 g。

②将总浸膏A溶于1 L水后，用等体积石油醚（60-90℃）萃取三次，合并石油醚相，减压浓缩并回收溶剂，分别得到石油醚部位B约250 g和水部位；

③对石油醚部位B进行硅胶柱层析（200-300目），用石油醚: 乙酸乙酯（20:1～3:1；v:v）为洗脱剂梯度洗脱，等份收集洗脱液，每份洗脱液采用TLC定性检测，合并含相同成分的洗脱液，得到浸膏组分C；

④对浸膏C进行硅胶柱层析（200-300目），分别用氯仿-丙酮（8:1）和石油醚-乙酸乙酯（1:2）为洗脱剂反复洗脱，得到化合物1和3；经旋光、高分辨质谱、红外光谱和核磁共振波谱解析确定化合物1的结构，数据如下：

化合物1的波谱数据：[a]²⁰_D = + 15.0 (c = 0.1,CHCl₃); HR-ESI-MS (Positive: 239.2011([M+H]⁺, C₁₅H₂₇O₂; cale. 239.2006); IR(Film): 3463cm^-1; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): 3.90 (d, J = 4.8 Hz, H-1), 1.76 (2H, m, H₂-2), 1.73 (m, H-3a), 1.29 (m, H-3b), 1.81 (s, H-5), 1.74 (m, H-6), 3.15 (dd, J = 4.8, 7.2 Hz, H-7), 1.88 (m, H-8a), 1.62 (m, H-8b), 1.71 (m, H-9a), 1.31 (m, H-9b), 1.73 (m, H-11), 0.87 (3H, d, J = 6.4 Hz, H₃-12), 0.94 (3H, d, J = 6.8 Hz, H₃-13), 1.18 (3H, s, H₃-14), 1.43 (3H, s, H₃-15); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz): 85.7 (C-1), 26.8 (C-2), 30.8 (C-3), 88.0 (C-4), 65.4 (C-5), 43.7 (C-6), 80.6 (C-7), 33.1 (C-8), 33.6 (C-9), 55.8 (C-10), 30.8 (C-11), 20.3 (C-12), 1 5.4 (C-13), 29.4 (C-14), 21.9 (C-15).

经核磁共振波谱解析确定化合物3的结构，数据如下：

化合物3的波谱数据：¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): 0.65 (t, J = 9.6 Hz, H-5), 0.69 (m, H-6), 0.97 (3H, s, H₃-12), 1.09 (3H, s, H₃-13), 1.22 (3H, s, H₃-14), 1.28 (3H, s, H₃-15); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz): 54.5 (C-1), 23.7 (C-2), 40.3 (C-3), 80.2 (C-4), 47.5 (C-5), 24.9 (C-6), 26.2 (C-7), 20.3 (C-8), 44.2 (C-9), 75.4 (C-10), 19.0 (C-11), 28.8 (C-12), 16.4 (C-13), 25.7 (C-14), 19.7 (C-15).

⑤对化合物1和3进行RT-PCR实验测试，实验证实，化合物1和3可抑制COX-2的mRNA表达，并呈现浓度依赖性。

实施例2：化合物2的提取纯化实验

①将中药千年健12.0 kg，粉碎，用100 L丙酮室温冷浸提取3次，每次5天，合并提取液，减压浓缩至无有机溶剂，得总浸膏A，约350 g。

②将总浸膏A溶于1 L水后，用等体积石油醚（60-90℃）萃取三次，合并石油醚相，减压浓缩并回收溶剂，分别得到石油醚部位B约220 g和水部位；

③对石油醚部位B进行硅胶柱层析（200-300目），用石油醚: 丙酮（25:1～5:1；v:v）为洗脱剂梯度洗脱，等份收集洗脱液，每份洗脱液采用TLC定性检测，合并含相同成分的洗脱液，得到浸膏组分D；

④对浸膏D进行硅胶柱层析（200-300目），依次用氯仿-丙酮（25:l）和石油醚-乙酸乙酯（3:l）为洗脱剂反复洗脱，然后进行葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析，用氯仿-甲醇（1:l）为洗脱溶剂纯化，得到化合物2；经旋光、高分辨质谱、红外光谱和核磁共振波谱解析确定化合物2的结构，数据如下：

化合物2的波谱数据：[a]²⁰_D = + 60.0 (c = 0.1,CHCl₃); HR-ESI-MS (Positive: 239.2007 ([M+H]⁺, C₁₅H₂₇O₂; cale. 239.2006); IR(Film): 3412cm^-1; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): 2.29 (d, J = 2.8 Hz, H-1), 1.81 (m, H-2a), 1.44 (dddd, J = 2.8, 3.2, 8.8, 9.6 Hz, H-2b), 1.55 (2H, m, H₂-3), 1.84 (s, H-5), 3.66 (d, J = 9.6 Hz, H-6), 1.29 (m, H-7), 1.39 (m, H-8a), 1.18 (m, H-8b), 1.66 (dt, J = 2.8, 13.2 Hz, H-9a), 1.32 (dt, J = 2.4, 13.2 Hz, H-9b), 2.10 (m, H-11), 0.78 (3H, d, J = 6.8 Hz, H₃-12), 0.93 (3H, d, J = 6.8 Hz, H₃-13), 1.21 (3H, s, H₃-14), 1.34 (3H, s, H₃-15); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz): 46.5 (C-1), 24.6 (C-2), 36.5 (C-3), 85.0 (C-4), 62.8 (C-5), 70.5 (C-6), 48.8 (C-7), 20.0 (C-8), 41.2 (C-9), 81.5 (C-10), 27.3 (C-11), 15.1 (C-12), 21.3 (C-13), 27.1 (C-14), 17.4 (C-15).

⑤对化合物2进行RT-PCR实验测试，实验证实，化合物2可抑制COX-2的mRNA表达，并呈现浓度依赖性。

实施例3：化合物4的提取纯化实验

①将中药千年健15.0 kg，粉碎，用75 L的85%甲醇室温渗漉提取，减压浓缩提取液至无有机溶剂，得总浸膏A，410 g。

②将总浸膏A溶于1 L水后，用等体积石油醚（60-90℃）萃取三次，合并石油醚相，减压浓缩并回收溶剂，分别得到石油醚部位B约230 g和水部位；

③对石油醚部位B进行硅胶柱层析（200-300目），用石油醚: 乙酸乙酯（30:1～5:1；v:v）为洗脱剂梯度洗脱，等份收集洗脱液，每份洗脱液采用TLC定性检测，合并含相同成分的洗脱液，得到浸膏组分E；

④对浸膏E进行硅胶柱层析（200-300目），依次用石油醚-氯仿（5:l）和石油醚-丙酮（l5:1）作为洗脱剂反复洗脱，得到化合物4；经核磁共振波谱解析确定化合物4的结构，数据如下：

化合物4的波谱数据：¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): 0.33(t, J = 10.0 Hz, H-5), 0.72 (m, H-6), 0.98 (3H, s, H₃-12), 1.04 (3H, s, H₃-13), 1.14 (3H, s, H₃-14), 0.93 (3H, d, J = 7.2 Hz, H₃-15); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz): 20.3 (C-1), 30.8 (C-2), 38.4 (C-3), 40.8 (C-4), 23.4 (C-5), 25.0 (C-6), 24.6 (C-7), 39.2 (C-8), 74.6 (C-9), 53.7 (C-10), 19.2 (C-11), 28.6 (C-12), 30.5 (C-13), 16.0 (C-14), 15.4 (C-15).

⑤对化合物4进行RT-PCR实验测试，实验证实，化合物4可抑制COX-2的mRNA表达，并呈现浓度依赖性。