本发明涉及一种活性人参皂苷的制取方法。本发明旨在批量制取活性人参。活性人参在人体内具有较高的吸收能力。本发明也与食品生产的方法相关。
背景技术：
本发明中人参系指高丽参、野生人参、栽培野生人参、中国人参(三七人参)、西洋参、生晒参中的一种、两种或两种以上的人参组合。
人参皂苷和非皂苷物质包括人参萜、多糖、氨基酸衍生物和酚类化合物。该物质具有很好的药理活性。对清除自由基、抗肿瘤、血压调节、降脂及抗肝损害等方面有重要作用。
人参皂苷分为两类：ppd(原人参二醇)和ppt(原人参三醇)。ppd型皂苷在基本结构ppd上有多种不同取代基团，典型的有rb1、rb2、rc、rd、f2、rg3和人参皂苷化合物k等。ppt型皂苷以ppt为基本结构，包含re、rf、rg1和rh1。
一般来说，自然界中许多含糖类化合物，糖酵解后的产物(糖苷配基)表现出增强的生物活性(med.pharm.soc.1992，9：1-13)。如果人参皂苷含糖类侧链(人参皂苷rb1、rb2、rb和re)发生水解并形成人参皂苷rg3、rh1、rh2、f2、cy和ck，它们在体内会产生更佳效应(ginsengres.2003，27：129-134)。
人参皂苷被称为非活性型皂苷，是一种糖类复合物，只有极少量的非活性型皂苷在小肠被吸收并进入体内。人类粪便中提取到的肠道微生物当中，关于其人参皂苷rb1的水解能力的实验结果表明，21％的肠道微生物不具水解能力。并且现已证实，70％具有一定程度的水解作用的肠道微生物，在分解人参皂苷的能力上有很大的差异(plantamedica.1998，64：696-700)。
一般的人参产品由高水溶性(非活性皂苷组分)的人参皂苷组成，然而这种高水溶性和低肠道吸收性的成分对人体无益。但是，如果活性组分变为不溶于水，其吸收能力和有效性也得以增强。
本发明的皂苷或人参加工产品的性质主要有：
通过使糖类从皂苷中移除，本发明中的活性组分提高了在人体的口服吸收(与天然人参相比)。人参皂苷rb1、rb2、rd和re与三个或三个以上的单糖耦合。本发明通过糖类的水解作用，生成人参皂苷rg3、rh1、rh2、f2、cy和ck。rg3、rh1、rh2、f2、cy和ck是典型的具有更高级效应的皂苷，即在人体内有更好的吸收能力或生理活性的活性人参皂苷。
红参是活化人参的典型代表，在现代意义上是指在90℃条件下加工六小时的人参。某些活性组分(尤其是化合物ck)是由某些肠道细菌产生(化合物ck在自然界中是不存在的)。而化合物ck难以合成。然而，利用菌株发酵生产化合物ck的方法仍然不够成熟。一般来说，与酶法转换相比，菌株发酵的生产量很低。但是，发酵生产比酶法转换更有可能生产出各种活性皂苷。
乳酸菌在37℃左右条件下难以发酵，其发酵温度应不低于42℃。高温改变了菌株产酶的三级结构，因此该酶无法发挥作用。当温度升高10℃时，酶的能力也随之提高两倍。但高温也不利于菌株生存。因此本发明者采用的是耐高温、可以产生多种酶的菌株。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有更好效果的活性人参皂苷的制取方法，该皂苷在活体内有更好的吸收能力或生理活性。
本发明采用的发酵温度高于42℃。该温度不利于一般细菌的生长。本发明从人参皂苷中分离出附加的糖，然后利用发酵方法获得化合物ck、rd、rg3等形式的活性组分。
本发明实现上述目标的技术方案包括如下步骤：
1)用蒸汽热处理人参；
2)破碎，利用乙醇萃取人参，得到人参皂苷提取液；
3)将莫哈韦芽孢杆菌kjs-3(moja-3)培养液和聚酵素芽孢杆菌kjs-2(bp-2)培养液添加至人参皂苷提取液中发酵；
4)离心发酵后的人参皂苷溶液，分离并保留上清液；回收沉淀物，使用乙醇复溶，过滤，收集滤液；
5)将滤液浓缩后，冷冻干燥，得到活性人参皂苷；上清液继续培养后，浓缩，冷冻干燥，也得到活性人参皂苷。
上述方案中，步骤3)的发酵温度在42℃-50℃范围内；作为一种优选，发酵温度为45℃。
步骤5)中，上层清液发酵温度在45～60℃。作为一种优选，发酵温度为55℃。
步骤1)中，人参加工温度为110℃，蒸汽压强为1.1kg/cm2，持续时间为10分钟。重复三次。
步骤2)中，将热处理后的人参切碎放至高速搅拌器搅拌，然后静置于80vol％酒精中，萃取皂苷组分。
本发明具有以下效果。
通过热处理制备活性皂苷成分。提取皂苷后，在发酵过程中，使用两种菌株，依次利用两种温度处理，可制备得到高产量的含化合物ck的活性皂苷。由于活性物质是由发酵产生的，可在食物中使用。
具体实施方式
申请人将具体描述本发明问题的解决方法。本发明将不详细描述与已知技术相关的详细信息，以免混淆本发明主题。
一般来说，在保证酶的二级结构不被破坏的条件下，菌株在增加10℃时的酶产量是原先的两倍。
本发明涉及的菌株被发现在高于普通菌的最适生长温度下生长得很好。通过大量的研究发现，莫哈韦芽孢杆菌kjs-3(moja-3，2008年8月22日保藏于韩国微生物保藏中心，保藏编号为kccm10961p。该菌的生长条件为：20～50℃，ph＝6～7.5)。在42-45℃温度范围内展现出最大生长量。我们还选择了生长温度可能达到60℃的bp-2(2006.08.16保藏于韩国微生物保藏中心，保藏编号为kccm10769p)。bp-2的最宜生长温度为45℃至55℃，发酵最高温度为55℃。在该温度条件下，大部分细菌无法生长，从而阻止由杂菌污染造成的中途抑制。
本发明将在下文中根据实施例进行详细描述。
本发明的热处理过程中，具体来说，人参加工温度为110℃，蒸汽压强为1.1kg/cm2，持续时间为10分钟。重复三次。
然后切碎放至高速搅拌器，然后静置于80vol％酒精中，萃取皂苷组分。原人参二醇(ppd)比原人参三醇((ppt)更容易在80％的乙醇溶液中提取得到。集中皂苷提取液后，将其复溶于水中。这将作为活性ppd的原料使用。
使用软管泵将一定量的moja-3、bp-2菌株的发酵溶液注入到ppd的悬浮液中。该发酵液用于分解皂苷的糖类侧链，然后生成含化合物ck的活化ppd溶液。
如果不是逐滴添加少量原料，会使得反应不能很好发生，致使产量较低。因此，本发明是将预定量的反应原料通过软管泵注入到moja3、bp2菌株的发酵液，发酵后，制备含活性组分的ppd溶液，内含化合物ck(即cks溶液)。
cks溶液离心完成后，在乙醇中再次静置沉淀物，过滤，滤液集中回收cks溶液。
实施例1活性ppd的制取
将人参装入反应室内的多孔架子。通过自动温度及湿度控制装置，向反应室通入蒸汽，排除空气，直接由蒸汽进行热处理，蒸汽压力1.1kg/cm2。保持温度121℃，时间10分钟，去除人参多余的水分。
将热处理过的人参冷却至90℃以下，打开排气阀注入空气，继续重复以上操作两次。
将热处理过的人参磨碎成粒径不超过1毫米的颗粒，干燥后加入80vol％乙醇，加热充分提取人参皂苷。通过滤纸过滤掉500微米以上的固体颗粒，收集经过滤纸的乙醇溶液，称之为热处理皂苷乙醇溶液。
使用旋转蒸发仪浓缩热处理皂苷乙醇溶液。用少量乙醇溶解热处理过的浓缩皂苷，再加入灭菌蒸馏水制备悬浮液用于保存。浓缩过程可以防止有害细菌滋生，是因为造成污染的杂菌在50℃以上不易存活。
实施例2moja-3菌株发酵(45℃)生成活性皂苷
取实施例1中制备的含rg3等活性ppd的人参皂苷，干燥后，取24克，用于以下实验。
首先，用胰蛋白大豆肉汤(tsb)培养mojia-3菌株，温度45℃，时间不低于16小时。取100毫升培养液加至1000毫升新鲜tbs中传代培养，45℃条件下培养60分钟。培养完成后，加入100毫升10％(w/v)活性ppd悬浮溶液，软管泵速率为20毫升/分钟。在45℃条件下再次培养6小时，得到cks溶液。
cks溶液离心得到上清液，称为溶液a。离心后的沉淀物集中，再次溶于少量乙醇中。过滤，取滤液，浓缩得到浓度较高的cks溶液。冷冻干燥cks溶液，得到0.054克cks(初级反应cks)。
45℃条件下继续培养溶液a，时间为6小时。与初级cks制取方法相同，浓缩、冷冻干燥得到0.18克cks(次级反应cks)。初级和次级反应cks总量为0.234g。
实施例3bp-2发酵(55℃)生成活性皂苷
取实施例1中制备的含rg3等活性ppd的人参皂苷，干燥后，取24克，用于以下实验。
首先，用胰蛋白大豆肉汤(tsb)培养bp-2菌株，温度45℃，时间不低于16小时。取100毫升培养液加至1000毫升新鲜tbs中传代培养，55℃条件下培养60分钟。培养完成后，加入100毫升10％(w/v)活性ppd悬浮溶液，软管泵速率为20毫升/分钟。在55℃条件下再次培养6小时，得到cks溶液。
cks溶液离心得到上清液，称为溶液b。用少量乙醇溶解沉淀物，过滤，取滤液，浓缩得到浓度较高的cks溶液。冷冻干燥cks溶液，得到0.0645gcks(cks初级反应)。
55℃条件下继续培养溶液b，时间为6小时。与初级cks制取方法相同，浓缩、冷冻干燥得到0.139克cks(次级反应cks)。主级和次级反应cks总量为0.2035克。
实施例4moja-3(45℃)和bp-2(55℃)发酵生成活性皂苷化合物
取实施例1中制备的含rg3等活性ppd的人参皂苷，干燥后，取24克，用于以下实验。
首先，用胰蛋白大豆肉汤(tsb)培养bp-2菌株和moja-3菌株温度45℃，时间不低于16小时。取100毫升培养液加至1000毫升新鲜tbs中传代培养，45℃条件下培养60分钟。培养完成后，加入100毫升10％(w/v)活性ppd悬浮溶液，软管泵速率为20毫升/分钟。在45℃条件下再次培养6小时，得到cks溶液。
cks溶液离心得到上清液，称为溶液c。用少量乙醇溶解沉淀物。过滤，取滤液，浓缩得到浓度较高的cks溶液。冷冻干燥cks溶液，得到1.04克cks(cks初级反应)。
55℃条件下继续培养溶液c，时间为6小时。与初级cks制取方法相同，浓缩、冷冻干燥得到0.2747克cks(次级反应cks)。初级和次级反应cks总量为1.3147g。
现已证实，在高温条件下利用两种菌株共同作用，有可能产生大量活性皂苷。
实施例5moja-3(45℃)和bp-2(55℃)发酵生成活性皂苷化合物
取实施例1中制备的含rg3等活性ppd的人参皂苷，干燥后，取24克，用于以下实验。
首先，用胰蛋白大豆肉汤(tsb)培养bp-2菌株和moja-3菌株温度45℃，时间不低于16小时。取100毫升培养液加至1000毫升新鲜tbs中传代培养，55℃条件下培养60分钟。培养完成后，加入100毫升10w/v％活性ppd悬浮溶液，软管泵速率为20毫升/分钟。在45℃条件下再次培养12小时，得到cks溶液。cks溶液离心得到上清液，称为溶液d。用少量乙醇溶解沉淀物。过滤，取滤液，浓缩得到浓度较高的cks溶液。冷冻干燥cks溶液，得到1.02克cks(cks初级反应)。
55℃条件下继续培养溶液d，时间为12小时。与初级cks制取方法相同，浓缩、冷冻干燥得到0.210克cks(次级反应cks)。初级和次级反应cks总量为1.23克。
现已证实，在高温条件下利用两种菌株共同作用，有可能产生大量活性皂苷。发酵时间超过6小时后，不再产生cks。
实施例6皂苷测定条件
使用kinetexc18进行色谱分离，温度35℃，检测波长为203纳米。水(dw)和乙腈(acn)作为流动相，梯度洗脱包括以下步骤，百分比为体积比。运行前使色谱柱重新缓冲平衡20分钟。进样体积为20微升。分析条件详情见下表1，流动相中百分比为体积比。
表1，色谱分析条件
生产皂素的结果阐释：
对实施例1至实施例4的具有代表性的cks皂苷进行分析。采用高效液相色谱电雾式检测器法(hplc-cad)进行皂苷分析。分析典型皂苷中的化合物ck、rg3、rd、rb1和rf成分。由于每个实施例都取24克生晒参进行发酵，结果有比较意义。每种皂苷含量以绝对数形式表示，结果如表2所示，moja-3和bp2发酵的cks产量分别为234毫克和203毫克。但是，混合菌株(moja3和bp2)发酵的cks产量达到1315毫克。实现了批量生产cks的目标。rg3是红参的重要指标。moja3生成了8.39毫克rg3，bp2生成了12.48毫克rg3。但是混合菌株(moja3和bp-2)发酵生产的rg3高于单菌株发酵。其产量是原先的两倍(32.64毫克)。自然界中不存在的化合物ck，它仅由肠道细菌或酶生成。moja3和bp2发酵的化合物k产量分别为0.04毫克和0.14毫克。而混合菌株(moja-3和bp-2)发酵生产的化合物ck高于单菌株发酵(0.26毫克)。
表2色谱分析结果