BARX1的用途的制作方法

本发明涉及生物医疗技术领域，尤其涉及barx1的用途。

背景技术：

间充质干细胞是最初从骨髓中分化而来的多向分化潜能干细胞，可分化为多种不同种类的细胞，包括成骨细胞、软骨细胞、肌细胞以及脂肪细胞等。越来越多的证据证明间充质干细胞可存在于非骨髓组织中。多数成人的间充质干细胞可用于细胞介导的组织工程。源于骨髓、骨膜、以及脂肪组织等不同组织的间充质干细胞拥有相似的表面标记特征，但是不同组织来源的间充质细胞在分化、增殖以及迁移等方面存在着显著差异。在过去的几十年里，基于其干细胞的特性，一类新的干细胞从口腔颌面组织中分离出来，包括源于牙周膜、牙髓以及根尖乳头等组织的干细胞。这些细胞具有多向分化潜能、成骨/成牙本质分化及自我更新能力。将其移植到小鼠或小型猪体内，可以生成骨样/牙本质样矿化组织并具有修复牙体组织缺损的能力。相比较源于骨髓的间充质干细胞，这类干细胞更易获得，而且与牙体组织有着更紧密的联系。因此牙源性间充质干细胞为牙齿组织的再生提供了可靠的细胞来源，但是其成牙定向分化的分子机制尚未明确，限制了其潜在的应用。

同源盒转录因子barx基因族通过对细胞粘附分子调控及对ii型胶原蛋白的调节参与间充质凝聚及形成。其中，转录因子barx1在磨牙始基的间充质中表达，不仅参与牙齿形态发生的调控，也在牙齿及源于神经嵴的颌面部间充质细胞的发育中发挥着重要作用。在小鼠体内，barx1表达于间充质凝聚位点，包括咽弓、肢芽、发育中的关节、磨牙乳头以及胃壁。异位表达barx1基因会导致小鼠下颌培养中的切牙转变为异常的磨牙样的形态。在人类，罕见的barx1基因重复或缺失会导致颌面部及关节的畸形。这些研究结果表明barx1调节细胞粘附分子的表达并参与牙齿发育及形态的控制。然而，barx1在牙源性间充质干细胞中的作用及作用机制尚不明确。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供barx1的用途，本发明证明，barx1基因能够调控通过调控与成骨、成牙相关基因的表达，实现对间充质干细胞成骨/成牙定向分化的调控。

本发明提供了barx1在制备调控间充质干细胞成牙相关基因表达的制剂中的应用。本发明实施例中，成牙相关基因为dspp、dmp1和/或osx。

所述间充质干细胞为根尖牙乳头间充质干细胞、脐带间充质干细胞或骨髓间充质干细胞。

所述调控具体为：过表达barx1基因，促进dspp基因、dmp1基因和/或osx基因的表达；敲除barx1基因，抑制dspp基因、dmp1基因和/或osx基因的表达。

本发明还提供了barx1在制备调控间充质干细胞内成骨相关基因的制剂中的应用。本发明实施例中，成骨相关基因为bsp和/或osx。

所述间充质干细胞为根尖牙乳头间充质干细胞、脐带间充质干细胞或骨髓间充质干细胞。

所述调控具体为：过表达barx1基因，促进osx基因的表达，抑制bsp基因的表达；敲除barx1基因，抑制osx基因的表达，促进bsp基因的表达。

本发明所述barx1为barx1蛋白、barx1基因序列、能够过表达间充质细胞中barx1基因的物质，或者能够敲除或敲低间充质细胞中barx1基因的物质。

所述barx1基因核苷酸序列的登录号为geneid:56033，所述barx1蛋白氨基酸序列有登录号为geneid:56033的核苷酸序列翻译而来。

所述能够过表达间充质细胞中barx1基因的物质为包含barx1基因的表达载体；或者由包含barx1基因的表达载体转染的逆转录病毒。所述逆转录病毒的表达载体为pqcxip。

所述能够敲除间充质细胞中barx1基因的物质为baxr1的sirna，序列为tcctgctcagtaagctgctcg。或者为将baxr1的sirna插入慢病毒的shrna载体上构建而成baxr1的shrna质粒。

本发明实施例中，过表达脐带间充质干细胞中的barx1基因，培养后以成骨诱导培养液诱导干细胞分化，3周后，在mrna水平检测与成骨相关、成牙相关基因。结果表明，过表达barx1抑制脐带间充质干细胞bsp的表达；促进脐带间充质干细胞dspp和dmp1的表达；促进脐带间充质干细胞osx的表达。结果中，所述促进或抑制与未经过表达的正常脐带间充质干细胞相比，具有显著性差异(p<0.05或p<0.01)。

本发明实施例中，过表达根尖牙乳头间充质干细胞中的barx1基因，培养后以成骨诱导培养液诱导干细胞分化，3周后，在mrna水平检测与成骨相关、成牙相关基因。结果表明，过表达barx1抑制根尖牙乳头间充质干细胞bsp的表达；促进根尖牙乳头间充质干细胞dspp和dmp1的表达；促进根尖牙乳头间充质干细胞osx的表达。结果中，所述促进或抑制与未经过表达的正常根尖牙乳头间充质干细胞相比，具有显著性差异(p<0.05或p<0.01)。

本发明实施例中，过表达骨髓间充质干细胞中的barx1基因，培养后以成骨诱导培养液诱导干细胞分化，3周后，在mrna水平检测与成骨相关、成牙相关基因。结果表明，过表达barx1抑制骨髓间充质干细胞bsp的表达；促进骨髓间充质干细胞dspp的表达。结果中，所述促进或抑制与未经过表达的正常骨髓间充质干细胞相比，具有显著性差异(p<0.05或p<0.01)。

本发明还提供了barx1基因在制备调控间充质干细胞矿化能力的制剂中的应用。

所述调控具体为过表达barx1基因抑制间充质干细胞的体外矿化能力。

所述间充质干细胞为根尖牙乳头间充质干细胞或脐带间充质干细胞。

所述矿化指钙化结节的形成。

本发明实施例中，过表达脐带间充质干细胞中的barx1基因，培养后以成骨诱导培养液诱导干细胞分化，定期在光镜下观察钙结节形成情况。结果表明过表达barx1抑制脐带间充质干细胞体外矿化能力。

本发明实施例中，过表达根尖牙乳头间充质干细胞中的barx1基因，培养后以成骨诱导培养液诱导干细胞分化，定期在光镜下观察钙结节形成情况。结果表明过表达barx1抑制根尖牙乳头间充质干细胞体外矿化能力。

本发明还提供了barx1在制备调控间充质干细胞成牙和/或成骨分化的制剂中的应用。

本发明实施例中，间充质干细胞为根尖牙乳头间充质干细胞、脐带间充质干细胞或骨髓间充质干细胞。

如前所述，本发明实验表明，过表达barx1基因能够促进间充质干细胞内成牙相关基因的表达；抑制成骨相关基因的表达。最终结果表明，过表达barx1基因能够促进间充质干细胞成牙分化，抑制成骨分化。

并且，为了验证过表达barx1对根尖牙乳头干细胞牙向/骨向分化的影响，本发明通过携带过表达barx1载体的病毒感染根尖牙乳头干细胞(scaps)，植入小型猪牙本质缺损模型，观察过表达barx1后在体内环境中对scaps分化的影响。根尖牙乳头干细胞成牙本质样组织能力强于对照组，实验组新生牙本质组织形成面积较对照组增加。

本发明研究表明，过表达barx1能够促进干细胞成骨/成牙相关转录因子osx的表达，而基因敲除barx1则会抑制osx在间充质干细胞的表达。本发明通过osx启动子分析及染色质免疫共沉淀(chip)表明，barx1直接结合osx启动序列，正向调控osx的基因转录。此外，免疫共沉淀(co-ip)结果表明barx1和osx在间充质干细胞中可以形成蛋白复合体。上述结果表明在间充质干细胞中barx1不但可以直接调控osx的表达，而且可以和osx形成蛋白复合体，共同调节间充质干细胞的分化功能。

osx基因在调控间充质干细胞内成牙本质相关基因和/或成骨相关基因表达中的应用；所述成骨相关基因为bsp；所述成牙本质相关基因为dspp和/或dmp1。

本发明研究结果表明，基因敲除osx抑制根尖牙乳头间充质干细胞bsp、dspp和dmp1的表达。进而能够抑制根尖牙乳头间充质干细胞早期体外矿化能力。基因敲除osx抑制根尖牙乳头间充质干细胞体外矿化能力。

本发明还提供了一种促进间充质干细胞成牙分化的制剂，包括barx1蛋白或能够过表达barx1基因的物质。

本发明实施例中，促进间充质干细胞成牙分化的制剂包括能够过表达barx1基因的物质。具体的为：由包含barx1基因的表达载体转染的逆转录病毒。所述逆转录病毒的表达载体为pqcxip。

本发明还提供了一种促进间充质干细胞成骨分化的制剂，包括barx1表达抑制剂或能够敲除或敲低barx1基因的物质。

本发明实施例中，促进间充质干细胞成骨分化的制剂包括能够敲除或敲低barx1基因的物质。能够敲除baxr1基因的物质为baxr1的sirna插入慢病毒的shrna载体上构建而成baxr1的shrna质粒。

本发明还提供了一种促进间充质干细胞成牙分化的方法，过表达间充质干细胞的barx1基因，或以含有barx1的诱导液对间充质干细胞进行诱导。

本发明还提供了一种促进间充质干细胞成骨分化的方法，敲除间充质干细胞的barx1基因，或以含有barx1表达抑制剂的诱导液对间充质干细胞进行诱导。

促进间充质干细胞成牙分化亦可称为促进牙组织再生；促进间充质干细胞成骨分化可称为促进骨组织再生。

本发明研究结果表明，barx1能够通过调控成骨、成牙基因的表达，影响间充质干细胞向成骨、成牙的分化，从而影响间充质干细胞体外内矿化能力，。本发明为制备含有barx1基因的骨组织或牙组织再生药物提供技术支持。

附图说明

图1是过表达barx1抑制脐带间充质干细胞成骨分化、促进成牙分化；图1-a示ha的表达；图1-b示茜素红染色；图1-c示钙离子定量分析；图1-d示qrt-pcr结果显示osx的表达；图1-e示qrt-pcr结果显示bsp的表达；图1-f示qrt-pcr结果显示dspp的表达；图1-g示qrt-pcr结果显示dmp1的表达；

图2是过表达barx1抑制根尖牙乳头间充质干细胞成骨分化、促进成牙分化；图2-a示barx1的表达；图2-b示barx1的表达；图2-c示茜素红染色；图2-d示钙离子定量分析；图2-e示qrt-pcr结果显示bsp的表达；图2-f示qrt-pcr结果显示dspp的表达；图2-g示qrt-pcr结果显示dmp1的表达；图2-h示qrt-pcr结果显示barx1的表达；

图3是过表达barx1抑制骨髓间充质干细胞成骨分化、促进成牙分化；图3-a示qrt-pcr结果显示过表达barx1；图3-b示qrt-pcr结果显示bsp的表达；图3-c示qrt-pcr结果显示dspp的表达；

图4是过表达barx1促进根尖牙乳头间充质干细胞体内成牙分化；图4-a示he染色显示单纯β-tcp牙本质缺损处回植结果，图4-a-1为40×镜下图像，图4-a-2为100×镜下图像；图4-b示he染色显示β-tcp复合空载体根尖牙乳头干细胞(scaps-pqcxip+β-tcp)牙本质缺损处回植结果，图4-b-1为40×镜下图像，图4-b-2为100×镜下图像；图4-c示he染色显示β-tcp复合过表达barx1的根尖牙乳头干细胞(scaps-ha-barx1+β-tcp)牙本质缺损处回植结果，图4-c-1为40×镜下图像，图4-c-2为100×镜下图像；

图5是barx1调控osx的表达，并与osx形成蛋白复合体；图5-a示qrt-pcr结果显示过表达barx1后osx的表达；图5-b示qrt-pcr结果显示基因敲除barx1；图5-c示qrt-pcr结果显示基因敲除barx1后osx的表达；图5-d示chip结果显示osx启动子上barx1蛋白的结合；图5-e示co-ip结果显示过表达barx1后barx1-osx蛋白复合体的形成；图5-f示co-ip结果显示基因敲除barx1后barx1-osx蛋白复合体的形成；图5-g示多肽微阵列结果显示barx1与osx结合的肽段；

图6是基因敲除osx抑制根尖牙乳头干细胞成骨分化及成牙分化；图6-a示westernblot结果显示基因敲除osx；图6-b示碱性磷酸酶染色；图6-c示碱性磷酸酶活性测定；图6-d示茜素红染色；图6-e示钙离子定量分析；图6-f示qrt-pcr结果显示bsp的表达；图6-g示qrt-pcr结果显示dspp的表达；图6-h示qrt-pcr结果显示dmp1的表达。

具体实施方式

本发明提供了barx1的用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

骨涎蛋白(bsp)具有促进骨的形成及分化、成骨细胞的趋化、黏附等功能,在骨转换方面起着非常重要的作用。

核心转录因子(osx)是调控骨形成和牙形成的核心转录因子,在细胞成骨分化、成牙分化过程中发挥着关键作用

牙本质涎蛋白dspp是唯一由成牙本质细胞合成和分泌的牙本质特异性非胶原蛋白，分泌至矿化前沿，起着启动牙本质矿化及调节羟基磷灰石晶体的大小和生长速度的作用。

牙本质基质酸性磷酸化蛋白1(dmp1)是骨、软骨、釉质、牙骨质和牙本质生物矿化所必需的一种酸性非胶原蛋白，dmp-1全基因序列是生物矿化的启动因子。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

1)干细胞的获得

1.1根尖牙乳头间充质干细胞的分离、培养与鉴定

人体组织的利用得到首都医科大学伦理委员会的批准，志愿者均知情同意术前签订知情同意书。获取了人恒牙根尖牙乳头组织，按照以往文献报道的方法分离和培养根尖牙乳头干细胞。

将拔除的牙齿立即放入无菌装有预冷pbs的离心管，移送进细胞室，在24h内分离培养根尖牙乳头干细胞。轻轻剥离牙齿周围的牙周组织，取根尖牙乳头组织，用pbs反复清洗，剪碎，置于含ⅰ型胶原酶(3g/l)和dispase(4g/l)的消化液，37℃下消化1小时，过70μm细胞筛收集细胞，1000rpm离心10min，用培养液重新悬浮成单细胞悬液。将细胞接种于25cm²细胞培养瓶中，在α-mem培养基(含15％胎牛血清、2mmol/l谷氨酰胺、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中37℃、5％co2培养，每2～3天换液1次。每天在倒置显微镜下观察细胞生长状况。当细胞生长至80％汇合状态时，用0.25％胰蛋白酶按1:2消化传代。通过检测间充质干细胞的表面标志物cd44、cd90、cd146、stro-1和干细胞的多向分化能力、克隆形成能力等方法鉴定间充质干细胞。结果表明：所获得的间充质干细胞符合干细胞特性，其分化能力和克隆形成能力也符合要求。

1.2购买脐带间充质干细胞和脊髓间充质干细胞。

2)构建病毒质粒

通过ncbi数据库查询baxr1的基因序列(geneid:56033)，应用whitehead提供的程序设计baxr1的sirna(如seqidno:19所示，序列为tcctgctcagtaagctgctcg)，将其插入慢病毒的shrna载体上，测序鉴定，最终构建成baxr1的shrna的质粒。

设计baxr1基因全长的pcr引物，用pcr的方法得到baxr1的全长并加表面标记hatag，将其连接到逆转录病毒的表达载体(pqcxip)上，测序鉴定，最终构建成ha-baxr1的质粒。然后进行病毒包装、收集，病毒滴度鉴定，分装后保存在-80℃冰箱。

3)稳定转染细胞系的建立

对照scramble的shrna，baxr1的shrna转染根尖牙乳头干细胞、脐带干细胞、骨髓间充质干细胞，转染48小时后，用puromycin筛选7天后得到对照scramble和baxr1基因敲除的稳定转染干细胞，提取细胞的mrna和蛋白，在mrna水平和蛋白水平检测shrna的敲除效果。

对照质粒及ha-baxr1的病毒转染根尖牙乳头干细胞、脐带干细胞、骨髓干细胞，转染48小时后，用药物筛选得到baxr1过表达的稳定转染干细胞，在mrna和蛋白水平检测ha的表达鉴定外源性barx1的表达。

结果表明：本发明成功构建了baxr1基因敲除及过表达的根尖牙乳头干细胞、脐带干细胞、骨髓干细胞。

本实施例中所采用的具体方法：

1)实时反转录聚合酶链式反应(real-timert-pcr)的过程为：

1.引物设计，primer3及oligo6等生物软件；

2.rna提取：

2.1培养皿细胞弃上清，pbs冲洗2遍，加700ulqiazol，吹打混匀，收于ep管，室温孵育5min，加140ul氯仿，强力震荡混匀15s，室温孵育3min，4℃12000g离心15min，收上清于新ep管；

2.2取700ul样本至rneasyminicolumn，4℃8000g离心15s，弃下层液体；

2.3加700ulbufferrwt至rneasyminicolumn，4℃8000g离心15s，弃下层液体；

2.4加500ulbufferrpe至rneasyminicolumn，4℃8000g离心15s，弃下层液体；

2.5重复步骤2.4；

2.6转移rneasyminicolumn至一新2mlcollectiontube，4℃1000g离心1min，弃下层液体；

2.7转移rneasyminicolumn至一新2mlcollectiontube，加30-50ulrnase-freewater，4℃8000g离心15s，收集下层液体于新ep管，测rna浓度，-80℃保存。

3.反转录pcr

3.1microtube管中配制下列模板rna/引物混合液：模板rna：1ng～5ug；oligo(dt)(500μg/ml)：1μl；10mmdntp：1μl；加入灭菌蒸馏水至12ul。

3.265℃保温5分钟后迅速在冰上冷冻1分钟以上。

3.3离心数秒使模板rna/引物的变性溶液聚集于microtube管底部。

3.4在上述microtube管中配制加入下列反转录反应液：5×firststrandbuffer：4ul；0.1mdtt：2ul；rnaseout：1ul。

3.5混匀各组分，37℃保温2分钟后冰上冷却。

3.6加入1ulm-mlv逆转录酶，轻轻吹打混匀。

3.737℃保温2分钟，70℃保温15分钟，4℃保温，样本收于-20℃。

4.实时定量荧光pcr

配置real-timepcr反应体系如下：5xsybrmix：5μl；pcrprimer(5pmol)：0.5μl；ddh2o：5μl；cdna：10.5μl；total21μl。

反应体系如表1：

表1反应体系

2)westernblot的过程为：

1.细胞总蛋白的提取

1.1弃培养基，用4℃预冷的5mlpbs漂洗细胞两次，加入5mlpbs后，用细胞刮刮下培养皿中的细胞，收于15ml离心管，1100rpm离心6min；弃上清，加入1mlpbs重悬细胞，收于ep管，7200rpm离心2min；

1.2弃上清，以1:5(细胞：裂解液)体积比加裂解液(100ulripa+1ulpmsf+1ulpic)，冰上15min，每2-3min混悬一次；

1.34℃，14000rpm离心15min，收集上清液于新ep管中，-80℃保存。

2.bradford法测定蛋白浓度

2.1bsa蛋白标准品按说明依次用双蒸水稀释，使终浓度分别为1000μg/ml，750μg/ml，500μg/ml，250μg/ml，125μg/ml，62.5μg/ml，0μg/ml；

2.2根据样品和标准品数量，按每孔加200ul1x考马斯亮蓝液，取1ul样品和标准品加入96孔板中，室温孵育5min，设副孔和空白孔；

2.3测定595nm波长的吸光度。根据标准曲线计算蛋白浓度；

2.4根据蛋白浓度计算上样体积，每组蛋白的上样量为25μg。

3.聚丙烯酰胺凝胶电泳

3.1准备预成胶；

3.2变性：每孔25μg蛋白量上样,用蒸馏水将待测样本体积稀释至20ul，每样本加入5ulloadingbuffer(溴酚蓝)，95℃加热10min；

3.3上样，以80v电压电泳至溴酚蓝电泳至分离胶，将电压调到100v，直至溴酚蓝到达分离胶底部，终止电泳。

4.转膜

4.1准备预成膜；

4.2将电泳胶转移至预成膜中，使用biorad半干转进行转膜；

4.3取出pvdf膜，tbst漂洗5min。

5.westernblot滤膜杂交

5.1将转印后的pvdf膜用5％脱脂奶粉室温摇床封闭1小时；

5.2tbst漂洗10min×3次；

5.3将滤膜取出，放入5％脱脂奶粉稀释的一抗稀释液中，4℃摇床过夜；

5.4tbst洗膜，10min×3次；

5.5将滤膜放入5％脱脂奶粉稀释的hrp标记的二抗中，室温摇床孵育1小时；

5.6tbst洗膜，10min×3次。

6.显色

将pvdf膜胶面朝上放在保鲜膜上，加入1:1混合的显影液，使其均匀覆盖膜，暗室曝光，扫描。

实施例2barx1对间充质干细胞成骨/成牙分化功能影响的体外研究

1)取实施例1构建的过表达barx1的脐带干细胞，以2×10³/cm²的浓度接种于6孔板中，待细胞生长至80％融合后，用成骨诱导培养液(invitrogen公司)将干细胞在体外向成骨/成牙本质方向分化诱导，每3天换1次液，在光镜下观察钙结节形成情况。

3周后检测茜素红染色及测定钙离子浓度来检测晚期成骨指标-细胞矿化能力，结果表明过表达barx1抑制脐带间充质干细胞体外矿化能力(图1-a,图1-b)。并在诱导0，3，7，14和21天的不同时间点收获细胞，在mrna水平检测成骨分化指标-骨涎蛋白(bsp，图1-c)，结果表明过表达barx1抑制脐带间充质干细胞bsp的表达。

在mrna水平检测成牙本质分化指标-牙本质涎蛋白(dspp，图1-d)、牙本质基质酸性磷酸化蛋白1(dmp1，图1-e)，结果表明过表达barx1促进脐带间充质干细胞dspp和dmp1的表达。

在mrna水平检测相关核心转录因子osx，结果表明过表达barx1促进脐带间充质干细胞osx的表达(图1-f)。

上述结果表明过表达barx1抑制脐带间充质干细胞成骨分化，促进成牙分化。

2)取取实施例1构建的过表达barx1的根尖牙乳头间充质干细胞以2×10³/cm²的浓度接种于6孔板中，待细胞生长至80％融合后，用成骨诱导培养液将干细胞在体外向成骨/成牙本质方向分化诱导，每3天换1次液，在光镜下观察钙结节形成情况。

2、3周后检测茜素红染色及测定钙离子浓度来检测晚期成骨指标-细胞矿化能力，结果表明过表达barx1抑制根尖牙乳头间充质干细胞体外矿化能力(图2-a,图2-b)。

并在诱导0，3，7，14和21天的不同时间点收获细胞，在mrna水平检测成骨分化指标-bsp(图2-c)，结果表明过表达barx1抑制根尖牙乳头间充质干细胞bsp的表达。

在mrna水平检测成牙本质分化指标-dspp(图2-d)、dmp1(图2-e)，结果表明过表达barx1促进根尖牙乳头间充质干细胞dspp和dmp1的表达。

在mrna水平检测相关核心转录因子osx，结果表明过表达barx1促进根尖牙乳头间充质干细胞osx的表达(图2-f)。

上述结果表明过表达barx1抑制根尖牙乳头间充质干细胞成骨分化，促进成牙分化。

3)取实施例1构建的过表达barx1的骨髓间充质干细胞被使用表达有野生型barx1的慢病毒感染，2μg/ml嘌呤霉素筛选后，实时定量rt-pcr结果显示，barx1在骨髓间充质干细胞异位表达(图3-a)。

取骨髓间充质干细胞以2×10³/cm²的浓度接种于6孔板中，待细胞生长至80％融合后，用成骨诱导培养液将干细胞在体外向成骨/成牙本质方向分化诱导，每3天换1次液，在光镜下观察钙结节形成情况。

诱导0，3，7和10天的不同时间点收获细胞，在mrna水平检测成骨分化指标-骨涎蛋白(bsp，图3-b)，结果表明过表达barx1抑制骨髓间充质干细胞bsp的表达。

在mrna水平检测成牙本质分化指标-牙本质涎蛋白(dspp，图3-c)结果表明过表达barx1促进骨髓间充质干细胞dspp的表达。

上述结果表明过表达barx1抑制骨髓间充质干细胞成骨分化，促进成牙分化。

具体过程为：

1.茜素红染色

1.1弃掉培养基，pbs洗2次；

1.270％乙醇固定，4℃，1h；

1.3双蒸水洗2次；

1.440mm茜素红溶液(ph4.2)室温染色1-10min，肉眼观察着色情况；

1.5双蒸水洗5次，轻轻吹打；

1.6扫描仪透摄模式采集图像。

2.ca²⁺浓度检测

2.1茜素红染色后，加入10％w/vcpc，室温放置30min(ar-s被溶解至cpc中)；

2.2以1:10稀释溶液，在酶标仪中以562nm波长测定其吸光度值(od)；

2.3以ar-s标准曲线计算ca²⁺的相对浓度。

3.real-timert-pcr

步骤同实施例1。rt-pcr引物序列为：

osx-f：cctcctcagctcaccttctc(seqidno:1)；

osx-r：gttgggagcccaaatagaaa(seqidno:2)；

bsp-f：caggccacgatattatctttaca(seqidno:3)；

bsp-r：ctcctcttcttcctcctcctc(seqidno:4)；

dspp-f：cgacataggtcacaatgaggatgtcg(seqidno:5)；

dspp-r：ttgcttccagctacttgaggtc(seqidno:6)；

dmp1-f：gacagcctctcactggattcgctgtc(seqidno:7)；

dmp1-r：ctcgcacacactctcccactc(seqidno:8)；

gapdh-f：cggaccaatacgaccaaatccg(seqidno:9)；

gapdh-r：agccacatcgctcagacacc(seqidno:10)。

实施例3barx1对间充质干细胞成骨/成牙分化功能影响的体内研究

为了验证过表达barx1对根尖牙乳头干细胞牙向/骨向分化的影响，将scaps与ha/tcp混合，植入小型猪牙本质缺损模型，观察过表达barx1后在体内环境中对scaps分化的影响。

取4只小型猪，在其下颌第一、二前磨牙上开髓，随机植入scaps与β-tcp混合物或单植入β-tcp，共15个位点，其中空白对照组(β-tcp)3个(图3-a)，对照组(scaps-pqcxip+β-tcp)6个(图3-b)，实验组(scaps-ha-barx1+β-tcp)6个(图3-c)。植入8周后，取出组织标本进行切片染色分析，结果显示，实验组根尖牙乳头干细胞成牙本质样组织能力强于对照组，实验组新生牙本质组织形成面积较对照组增加(图4-a～图4-c)。

具体过程为：

1.细胞移植

1.1分别取生长状态良好的第4代细胞，以1×10⁵个/皿的密度接种于10cm培养皿，待细胞长至80％汇合度时弃掉培养基，用pbs漂洗(为保证细胞状态，细胞汇合度不宜过大)。

1.2每皿细胞加3ml不含edta的胰酶，于37℃孵育2min，将细胞从培养皿上洗脱，加入4ml含15％fbs、1％双抗和1％l-谷氨酰胺的α-mem培养基中和胰酶作用，之后将细胞悬液转移至50ml的离心管中。

1.3于1100rpm，离心6min。

1.5用上述含15％fbs、1％双抗和1％l-谷氨酰胺的α-mem培养基重悬细胞，计数，然后取5×10⁵个细胞置于12孔板中直径3-3.5mm、厚1mm的β-磷酸三钙(β-tcp)片上，37℃，5％co2条件下孵育2h，每加入2ml的含15％fbs、1％双抗和1％l-谷氨酰胺的α-mem培养基，继续于37℃，5％co2条件下孵育3天待用。不含细胞的β-tcp也于2ml相同培养基、相同条件下培养3天。

1.6小型猪称重，麻醉。

1.7于小型猪下颌第一、二前磨牙上开髓(直径3-4mm开髓孔)，随机选取不同小型猪个体上的3颗牙放入1.5中所述的不含细胞的β-tcp，6颗牙放入1.5中所述孵育有对照组细胞(scap-pqcxip)的β-tcp(scaps-pqcxip+β-tcp)，6颗牙放入1.5中所述孵育有实验组细胞(scaps-ha-barx1)的β-tcp(scaps-ha-barx1+β-tcp)，共15颗前磨牙，玻璃离子水门汀暂封。

2.标本固定，脱钙，脱水包埋，制作石蜡切片

在体内移植10周后处死小型猪，取出组织标本，置于4％多聚甲醛中固定，之后转至ph值等于7(7.4～7.6)的10％edta内，完全脱钙后流水冲洗24小时，随后将组织脱水包埋。

脱水步骤：75％乙醇ⅰ：10min；75％乙醇ⅱ：10min；85％乙醇ⅰ：10min；85％乙醇ⅱ：10min；95％乙醇ⅰ：10min；95％乙醇ⅱ：10min；无水乙醇ⅰ：30min；无水乙醇ⅱ：30min；二甲苯ⅰ：30min；二甲苯ⅱ：30min；浸蜡ⅰ：30min；浸蜡ⅱ：过夜。

包埋：浸蜡结束后，将组织转到预热的包埋框中，迅速倾入熔蜡，用温热的镊子调整组织块的位置，制冷机上放置，使熔蜡凝固。

切片：修整蜡块后在轮转切片机切5μm厚连续切片，将切片裱于多聚赖氨酸处理的玻片上，37℃干燥过夜。

3.石蜡切片he染色步骤：二甲苯ⅰ：10min；二甲苯ⅱ：10min；无水乙醇ⅰ：3min；无水乙醇ⅱ：3min；95％乙醇ⅰ：3min；95％乙醇ⅱ：3min；85％乙醇：3min；75％乙醇：3min；流水冲洗：3min；蒸馏水洗：1min；苏木精液染色：2min；流水洗去苏木精液：30s；1％盐酸-乙醇：3s；流水冲洗返蓝：10min；蒸馏水洗：1min；0.5％伊红液染色：1min；蒸馏水稍洗：2s；80％乙醇：10s；95％乙醇ⅰ：10s；95％乙醇ⅱ：10s；无水乙醇ⅰ：10s；无水乙醇ⅱ：10s；二甲苯ⅰ：2min；二甲苯ⅱ：2min；中性树胶封固。

实施例4在间充质干细胞中barx1正向调控osx的基因表达，且与osx形成蛋白复合体。

为了揭示barx1促进间充质干细胞成牙分化、抑制成骨分化的分子机制，通过候选基因筛查发现，过表达barx1促进干细胞成骨/成牙相关转录因子osx的表达(图5-a)。为了进一步证实barx1对osx的调控，间充质干细胞被使用慢病毒介导shrna(barx1sh1、barx1sh2)感染，2μg/ml嘌呤霉素筛选后，实时定量rt-pcr检测结果表明，barx1可以被barx1sh1、barx1sh2有效的敲除(图5-b)；实时定量rt-pcr检测结果表明，基因敲除barx1抑制osx在间充质干细胞的表达(图5-c)。osx启动子分析及染色质免疫共沉淀(chip)结果表明，barx1直接结合osx启动序列，正向调控osx的基因转录(图5-d)。

此外，免疫共沉淀(co-ip)结果表明barx1和osx在间充质干细胞中可以形成蛋白复合体(图5-e，图5-f)；多肽微阵列实验结果显示了barx1蛋白结合osx的多肽序列(图5-g)。

上述结果表明在间充质干细胞中barx1不但可以直接调控osx的表达，而且可以和osx形成蛋白复合体，共同调节间充质干细胞的分化功能。

具体过程为：

1.real-timert-pcr

步骤同实施例1。rt-pcr引物序列为：

barx1-f：cgcttcgagaagcagaagta(seqidno:11)

barx1-r：cttcatcctccgattctggt(seqidno:12)

2.chip

2.1培养皿细胞中加入甲醛，终浓度为1％，37℃，15min；

2.2弃含甲醛的培养基，用4℃预冷的5mlpbs漂洗细胞两次，加入5mlpbs后，用细胞刮刮下培养皿中的细胞，收于50ml离心管，4℃2000rpm离心4min；

2.3弃上清，每样本加入含蛋白酶抑制剂的室温sds裂解液200ul(100ulsds裂解液+1ulpmsf+1ulpic)，冰上10min；

2.4超声破碎，功率75％，3次，每次7-8s，间隔90s；

2.54℃，13000rpm离心10min，收集上清液于新ep管中；

2.6测dna浓度，将各样本制成同浓度、同体积样本；

2.7用chip稀释缓冲液(含蛋白酶抑制剂)将上述样本稀释10倍；取1％稀释后的样本作为input，加入20ul5mnacl，65℃，4h，-20℃保存待用；

2.8将剩余样本分组，目的蛋白组中加入免疫沉淀抗体2ug，阴性对照组中加入igg2ug，4℃旋转摇床孵育1h；

2.9加入60ul蛋白a琼脂糖珠子，4℃旋转摇床孵育过夜；

2.10轻柔离心，小心去除上清液，得到琼脂糖凝胶/抗体/组蛋白复合体，分别加入1ml下列缓冲液清洗上述复合体：

1)低盐免疫沉淀复合体清洗缓冲液，1次，1min/次，4℃5000rpm离心；

2)高盐免疫沉淀复合体清洗缓冲液，1次，3min/次，4℃5000rpm离心；

3)氯化锂免疫沉淀复合体清洗缓冲液，1次，1min/次，4℃5000rpm离心；

4)te缓冲液，2次，1min/次，4℃5000rpm离心；

2.11在清洗后的复合体中加入250ul洗脱液(1％sds，0.1mnahco3)，旋转摇床室温孵育15min，4℃5000rpm离心，将上清液转入新的ep管内，再重复一遍，共得到500ul洗脱后的样本；

2.12在洗脱样本中加入20ul5mnacl65℃4h；

2.13dna纯化：

2.13.1在input和洗脱样本中加入10ul0.5medta，20ul1mtris-hcl(ph6.5)和1ul20mg/ml蛋白酶k，45℃，1h；

2.13.2加入500ul酚/氯仿，涡旋混匀，静置5min，4℃14000rpm5min离心；

2.13.3收集上清液至新ep管，加入1ml乙醇+1‰糖原，-20℃30min-1h，4℃14000rpm10min离心；

2.13.4弃上清液，室温晾干，加入100-200ul双蒸水重悬。

2.14real-timepcr:

步骤同实施例1。rt-pcr引物序列为：

osx-1-f：ggtatgtattagggcatgtgtca(seqidno:13)

osx-1-r：ggtatgtattagggcatgtgtca(seqidno:14)

osx-2-f：agggaggaagggagtgttga(seqidno:15)

osx-2-r：gaaaggggagccaagaacca(seqidno:16)

osx-nc-f：gaaaggggagccaagaacca(seqidno:17)

osx-nc-r：ggcagggacctaaaagacca(seqidno:18)

3.co-ip

3.1弃培养基，用4℃预冷的5mlpbs漂洗细胞两次，加入5mlpbs后，用细胞刮刮下培养皿中的细胞，收于50ml离心管，1100rpm离心6min；弃上清，加入1mlpbs重悬细胞，收于ep管，7200rpm离心2min；

3.2弃上清，加入1mlip裂解液，冰上15min，每2-3min混悬一次；

3.34℃，14000rpm离心15min，收集上清液于新ep管中；

3.4bradford法测定蛋白浓度，步骤同实施例1；

3.5根据蛋白样本的浓度将样本配制成同浓度同体积样本，取25ug蛋白样本作为input，蛋白变性，步骤同实施例1；

3.6将剩余样本平均分为两组，目的蛋白组中加入免疫沉淀抗体2ug，阴性对照组中加入igg2ug，4℃旋转摇床孵育1h；

3.7加入40ul蛋白a琼脂糖珠子，4℃旋转摇床孵育过夜；

3.8轻柔离心，小心去除上清液，加入1ml20％免疫共沉淀洗脱液清洗，4℃5000rpm离心30s，去除上清液，重复3-4次；

3.9加入30ul2×loadingbuffer(溴酚蓝)，95℃加热5min变性；

3.10input与免疫共沉淀样本一起进行westernblot，步骤同实施例1。

4.多肽微阵列

4.1合成barx1重组蛋白；

4.2根据根据osx蛋白的序列合成多肽芯片，431个氨基酸，overlapping设计，间隔3个氨基酸，多肽长度15个氨基酸，一个芯片140条多肽；

4.3多肽阵列合成：活化的膜放置于全自动合成仪上，根据程序自动转移fmoc-氨基酸溶液到活化膜上的特定位置与膜进行反应。膜按序浸入封闭液i中和封闭液ii中，进行侧链封闭，dmf洗膜。膜放入去保护溶液中，用于移除氨基端的fmoc保护基团，去保护之后，用dmf洗膜，而后再用乙醇干燥。重复以上步骤，直至多肽阵列全部合成完毕。全部合成后,用溶液去除侧链保护基团，再用ch2cl2洗膜，而后用乙醇干燥,立即使用或-20℃保存用于下一步实验；

4.4多肽阵列与目标蛋白结合反应

4.4.1目标蛋白生物素标记：4℃操作，取1mlbarx1蛋白溶液，用生物素标记试剂0.266umol，约13.3ul与蛋白溶液混匀，室温孵育60min；将孵育完成的蛋白溶液通过过滤柱，1000xg离心2min收集蛋白溶液即为生物素标记的barx1蛋白溶液；

4.4.2封闭：阵列膜活化后加入封闭液，室温震荡封闭4h，洗膜；

4.4.3蛋白样品孵育：封闭液稀释的标记barx1蛋白样品(终浓度0.1ug/ml)与阵列膜4℃孵育过夜；

4.4.4显色试剂孵育：显色试剂为hrp标记的链霉亲和素，封闭液稀释(1:10000)后，室温震荡2h，洗膜；

4.4.5显色：加入ecl发光试剂，数字成像；

4.5芯片扫描及显色点数据分析：显色芯片使用bio-radchemidocxrs+化学发光成像系统425nm扫描成像，显色时长300s。成像图片使用totallab图像分析软件分析显色点光密度值，使用软件中“spotedgeaverage”算法，以每个显色点周边背景值为参照计算每个显色点的光密度值。

实施例5osx对根尖牙乳头间充质干细胞成骨/成牙分化功能影响

间充质干细胞被使用慢病毒介导shrna(osxsh)感染，2μg/ml嘌呤霉素筛选后，在蛋白水平检测osx的表达，结果表明根尖牙乳头间充质干细胞中osx可以被osxsh有效敲除(图6-a)。

取根尖牙乳头间充质干细胞以2×10³/cm²的浓度接种于6孔板中，待细胞生长至80％融合后，用成骨诱导培养液将干细胞在体外向成骨/成牙本质方向分化诱导，每3天换1次液，在光镜下观察钙结节形成情况。

5天后后检测碱性磷酸酶染色及测定碱性磷酸酶活性检测早期矿化指标-碱性磷酸酶，结果表明基因敲除osx抑制根尖牙乳头间充质干细胞早期体外矿化能力(图6-b,图6-c)。

3周后检测茜素红染色及测定钙离子浓度来检测晚期成骨指标-细胞矿化能力，结果表明基因敲除osx抑制根尖牙乳头间充质干细胞体外矿化能力(图6-d,图6-e)。

并在诱导0，3，7，10和14天的不同时间点收获细胞，在mrna水平检测成骨分化指标-bsp(图6-f)，结果表明过基因敲除osx抑制根尖牙乳头间充质干细胞bsp的表达。

在mrna水平检测成牙本质分化指标-dspp(图6-g)、dmp1(图6-h)，结果表明基因敲除osx抑制根尖牙乳头间充质干细胞dspp和dmp1的表达。

上述结果表明基因敲除osx抑制根尖牙乳头间充质干细胞成骨分化及成牙分化。

具体过程为：

1.westernblot

步骤同实施例1。

2.碱性磷酸酶(alp)染色

2.1弃掉培养基，pbs洗2次；

2.2柠檬酸-丙酮-甲醛固定液(25：65：8)固定，室温，0.5h；

2.3双蒸水洗2次；

2.4配置染色液：1mlsodiumnitrite溶液与1mlfrv-alkaline溶液轻柔混匀，静置2min，将其加入45ml去离子水中，最后加入1mlnaphtholas-bialkaline溶液，充分混匀；

2.5上述染色液室温染色15min，肉眼观察着色情况；

2.6双蒸水洗5次，轻轻吹打；

2.7扫描仪透摄模式采集图像。

3.碱性磷酸酶(alp)活性测定

3.1弃掉培养基，pbs洗2次；

3.2加入500ul裂解液，37℃，15min；

3.3刮刀刮净细胞，收集细胞及裂解液于ep管中，涡旋，4℃，14000rpm离心10min，收集上清液于新ep管中，冰上放置待用；

3.4于96孔板中每孔加入50ul碱性磷酸酶buffer溶液、50ulstocksubstrate溶液和10ul上述样本，37℃，15min；

3.5加和110ul0.5mnaoh中止反应；在酶标仪中以405nm波长测定其吸光度值(od)；

3.6用bradford法测定样本蛋白浓度，步骤同实施例1；

3.7以标准曲线及样本蛋白量计算alp活性。

4.茜素红染色

步骤同实施例2。

5.ca²⁺浓度检测

步骤同实施例2。

6.real-timert-pcr

步骤及引物同实施例2。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

sequencelisting

<110>首都医科大学附属北京口腔医院

<120>barx1的用途

<130>mp1619297

<160>19

<170>patentinversion3.3

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<213>人工序列

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