YAP的用途的制作方法

本发明涉及生物医疗技术领域，尤其涉及yap的用途。

背景技术：

间充质干细胞是最初从骨髓中分化而来的多向分化潜能干细胞，可分化为多种不同种类的细胞，包括成骨细胞、软骨细胞、肌细胞以及脂肪细胞等。越来越多的证据证明间充质干细胞可存在于非骨髓组织中。多数成人的间充质干细胞可用于细胞介导的组织工程。源于骨髓、骨膜、以及脂肪组织等不同组织的间充质干细胞拥有相似的表面标记特征，但是不同组织来源的间充质细胞在分化、增殖以及迁移等方面存在着显著差异。在过去的几十年里，基于其干细胞的特性，一类新的干细胞从口腔颌面组织中分离出来，包括源于牙周膜、牙髓以及根尖乳头等组织的干细胞。这些细胞具有多向分化潜能、成骨/成牙本质分化及自我更新能力。将其移植到小鼠或小型猪体内，可以生成骨样/牙本质样矿化组织并具有修复牙体组织缺损的能力。相比较源于骨髓的间充质干细胞，这类干细胞更易获得，而且与牙体组织有着更紧密的联系。因此牙源性间充质干细胞为牙齿组织的再生提供了可靠的细胞来源，但是其成牙定向分化的分子机制尚未明确，限制了其潜在的应用。

yap蛋白(yesassociatedprotein)是hippo信号通路中一个起中心作用的开关蛋白，yap作为一种基因转录共抑制因子，在维持干细胞自我更新及分化方面起着重要作用。然而，yap在牙源性间充质干细胞中的作用及作用机制尚不明确。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供提供yap的用途，本发明研究表明，yap基因能够调控通过调控与成骨、成牙相关基因的表达，实现对间充质干细胞成骨/成牙定向分化的调控。

本发明提供了yap在制备调控间充质干细胞成牙相关基因表达的制剂中的应用。本发明实施例中，成牙相关基因为dspp、dmp1和/或osx。一些实施例中，所述间充质干细胞为根尖牙乳头间充质干细胞、脐带间充质干细胞或骨髓间充质干细胞。

本发明还提供了yap在制备调控间充质干细胞内成骨相关基因的制剂中的应用。本发明实施例中，所述成骨相关基因为bsp和/或osx。一些实施例中，所述间充质干细胞为根尖牙乳头间充质干细胞、脐带间充质干细胞或骨髓间充质干细胞。

本发明所述调控具体为：过表达yap基因，抑制bsp基因、osx基因、dspp基因和/或dmp1基因的表达。敲除yap基因，促进bsp基因、osx基因、dspp基因和/或dmp1基因的表达。

本发明所述yap为yap蛋白、yap基因序列、能够过表达间充质细胞中yap基因的物质，或者能够敲除间充质细胞中yap基因的物质。

所述yap基因核苷酸序列的登录号为geneid:10413，所述yap蛋白氨基酸序列有登录号为geneid:10413的核苷酸序列翻译而来。

所述能够过表达间充质细胞中yap基因的物质为包含yap基因的表达载体；或者由包含yap基因的表达载体转染的逆转录病毒。所述逆转录病毒的表达载体为pqcxih。

所述能够敲除间充质细胞中yap基因的物质为baxr1的sirna，序列为gcttcaggtcctcttcctgat。或者为将baxr1的sirna插入慢病毒的shrna载体上构建而成baxr1的shrna质粒。

本发明实施例中，过表达根尖牙乳头间充质干细胞中的yap基因，培养后以成骨诱导培养液诱导干细胞分化，2～3周后，在mrna水平检测与成骨相关、成牙相关基因。结果表明，过表达yap抑制根尖牙乳头间充质干细胞bsp基因、dspp基因、osx基因和dmp1基因的表达。结果中，所述抑制与未经过表达的正常根尖牙乳头间充质干细胞相比，具有显著性差异(p<0.05或p<0.01)。

本发明实施例中，敲除脐带间充质干细胞中的yap基因，培养后以成骨诱导培养液诱导干细胞分化，2～3周后，在mrna水平检测与成骨相关、成牙相关基因。结果表明，敲除yap促进脐带间充质干细胞bsp基因、dspp基因、osx基因和dmp1基因的表达。结果中，所述促进与未经敲除的正常脐带充质干细胞相比，具有显著性差异(p<0.05或p<0.01)。

本发明实施例中，敲除骨髓间充质干细胞中的yap基因，培养后以成骨诱导培养液诱导干细胞分化，2～3周后，在mrna水平检测与成骨相关、成牙相关基因。结果表明，敲除yap促进骨髓间充质干细胞bsp基因、dspp基因、osx基因和dmp1基因的表达。结果中，所述促进与未经敲除的正常骨髓充质干细胞相比，具有显著性差异(p<0.05或p<0.01)。

本发明还提供了yap在制备调控间充质干细胞内barx1基因表达的制剂中的应用。

前期研究表明，ap2a可以促进间充质干细胞成骨/成牙分化。本发明通过实时定量rt-pcr检测结果表明，基因敲除yap，能够促进barx1在间充质干细胞的表达，染色质免疫共沉淀(chip)结果证实了yap和ap2a在间充质干细胞可以形成蛋白复合体，通过ap2a结合到barx1基因启动子序列，共同抑制barx1基因的表达，从而调节间充质干细胞的分化功能。具体的，所述yap通过与ap2a形成蛋白复合体，抑制barx1表达。

本发明还提供了yap基因在制备调控间充质干细胞矿化能力的制剂中的应用。

所述调控具体为敲除yap基因促进骨髓间充质干细胞或脐带间充质干细胞的体外矿化能力；所述矿化指钙化结节的形成。

本发明实施例中，过表达根尖牙乳头间充质干细胞中的yap基因，培养后以成骨诱导培养液诱导干细胞分化，定期在光镜下观察钙结节形成情况。结果表明过表达yap促进根尖牙乳头间充质干细胞体外矿化能力。

本发明实施例中，敲除脐带或骨髓间充质干细胞中的yap基因，培养后以成骨诱导培养液诱导干细胞分化，定期在光镜下观察钙结节形成情况。结果表明敲除yap促进脐带或骨髓间充质干细胞体外矿化能力。

本发明还提供了yap在制备调控间充质干细胞成牙和/或成骨分化的制剂中的应用。

本发明实施例中，间充质干细胞为根尖牙乳头间充质干细胞、脐带间充质干细胞或骨髓间充质干细胞。

如前所述，本发明实验表明，过表达yap基因能够抑制间充质干细胞内成牙相关基因的表达；且抑制成骨相关基因的表达。而敲除yap基因能够促进间充质干细胞内成牙相关基因的表达；且促进成骨相关基因的表达。最终结果表明，过表达yap基因能够抑制间充质干细胞成牙分化，抑制成骨分化。敲除yap基因能够促进间充质干细胞成牙分化，促进成骨分化。

为了验证过表达yap对根尖牙乳头干细胞牙向/骨向分化的影响，将scaps与ha/tap混合，植入裸鼠皮下，观察过表达yap后在体内环境中对scaps分化的影响。结果显示，实验组根尖牙乳头干细胞成矿化组织能力显著弱于对照组，实验组矿化组织形成面积较对照组明显减小。

本发明还提供了一种促进间充质干细胞成骨分化，或成牙分化的制剂，其包括yap表达抑制剂或能够敲除yap基因的物质。本发明实施例中，该制剂包括能够敲除yap基因的物质；具体为yap的sirna插入慢病毒的shrna载体上构建而成yap的shrna质粒。

本发明还提供了一种抑制间充质干细胞成骨分化，或成牙分化的制剂，其包括yap蛋白或能够过表达yap基因的物质。本发明实施例中，钙制剂包括能够过表达yap基因的物质，具体的为：由包含yap基因的表达载体转染的逆转录病毒。所述逆转录病毒的表达载体为pqcxih。

本发明还提供了一种促进间充质干细胞成骨分化，或成牙分化的方法，其为敲除间充质干细胞的yap基因，或以含有yap表达抑制剂的诱导液对间充质干细胞进行诱导。

本发明还提供了一种抑制间充质干细胞成骨分化，或成牙分化的方法，其为过表达间充质干细胞的yap基因，或以含有yap的诱导液对间充质干细胞进行诱导。

促进间充质干细胞成牙分化亦可称为促进牙组织再生；促进间充质干细胞成骨分化可称为促进骨组织再生。

本发明研究结果表明，yap能够通过调控成骨、成牙基因的表达，影响间充质干细胞向成骨、成牙的分化，从而影响间充质干细胞体外内矿化能力。本发明为制备含有yap基因的骨组织或牙组织再生药物提供技术支持。

附图说明

图1是过表达yap抑制根尖牙乳头间充质干细胞成骨分化、抑制成牙分化；其中图1-a示qrt-pcr结果显示osx的表达；图1-b示qrt-pcr结果显示bsp的表达；图1-c示qrt-pcr结果显示dspp的表达；图1-d示qrt-pcr结果显示dmp1的表达；

图2是基因敲除yap促进脐带间充质干细胞成骨分化、促进成牙分化；其中图2-a示基因敲除yap的qrt-pcr结果；图2-b示茜素红染色；图2-c示钙离子定量分析；图2-d示qrt-pcr结果显示osx的表达；图2-e示qrt-pcr结果显示bsp的表达；图2-f示qrt-pcr结果显示dspp的表达；图2-g示qrt-pcr结果显示dmp1的表达；

图3是基因敲除yap促进骨髓间充质干细胞成骨分化、促进成牙分化；其中图3-a示基因敲除yap的qrt-pcr结果；图3-b示茜素红染色；图3-c示qrt-pcr结果显示barx1的表达；图3-d示qrt-pcr结果显示osx的表达；图3-e示qrt-pcr结果显示bsp的表达；图3-f示qrt-pcr结果显示dspp的表达；图3-g示qrt-pcr结果显示dmp1的表达；

图4是过表达yap抑制根尖牙乳头间充质干细胞体内成骨/成牙分化，标尺100μm；4-a示he染色显示ha/tcp复合空载体根尖牙乳头干细胞(scaps-pqcxih+ha/tcp)裸鼠背部皮下回植结果，图4-b示he染色显示ha/tcp复合过表达yap根尖牙乳头干细胞(scaps-myc-yap+ha/tcp)裸鼠背部皮下回植结果；图4-c示实验组与对照组的新生矿化组织面积与回植物总面积的百分比；

图5是ap2a或yap在间充质干细胞抑制barx1的表达；其中图5-a示flag-bcor的westernblot结果；图5-b示qrt-pcr结果显示barx1的表达；图5-c示flag-ap2a的westernblot结果；图5-d示qrt-pcr结果显示barx1的表达；图5-e示myc-yap的westernblot结果；图5-f示qrt-pcr结果显示barx1的表达；图5-g示qrt-pcr结果显示yap的表达；图5-h示qrt-pcr结果显示barx1的表达；图5-i示chip结果显示barx1启动子上ap2a蛋白的结合；

图6是yap和ap2a在间充质干细胞形成蛋白复合体；其中图6-a示co-ip结果显示过表达yap后yap-ap2a蛋白复合体的形成；图6-b示co-ip结果显示基因敲除yap后yap-ap2a蛋白复合体的形成；图6-c示co-ip结果显示过表达ap2a后yap-ap2a蛋白复合体的形成；图6-d示qrt-pcr结果显示ap2a在非牙源性间充质干细胞(wjcmscs、adscs、bmscs)与牙源性间充质干细胞(scaps、dpscs、pdlscs)中的表达；图6-e示qrt-pcr结果显示yap在非牙源性间充质干细胞(wjcmscs、adscs、bmscs)与牙源性间充质干细胞(scaps、dpscs、pdlscs)中的表达；图6-f示co-ip结果显示wjcmscs与scaps中yap-ap2a蛋白复合体的形成；

图7是runx2与ap2a竞争性结合yap；其中图7-a示co-ip结果显示过表达yap后yap-runx2蛋白复合体的形成；图7-b示co-ip结果显示基因敲除yap后yap-runx2蛋白复合体的形成；图7-c示co-ip结果显示过表达ap2a后yap-runx2蛋白复合体的形成。

具体实施方式

本发明提供了yap的用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

1)干细胞的分离、培养与鉴定

人体组织的利用得到首都医科大学伦理委员会的批准，志愿者均知情同意术前签订知情同意书。获取了人恒牙根尖牙乳头组织，按照以往文献报道的方法分离和培养根尖牙乳头干细胞。

将拔除的牙齿立即放入无菌装有预冷pbs的离心管，移送进细胞室，在24h内分离培养根尖牙乳头干细胞。轻轻剥离牙齿周围的牙周组织，取根尖牙乳头组织，用pbs反复清洗，剪碎，置于含ⅰ型胶原酶(3g/l)和dispase(4g/l)的消化液，37℃下消化1小时，过70μm细胞筛收集细胞，1000rpm离心10min，用培养液重新悬浮成单细胞悬液。将细胞接种于25cm²细胞培养瓶中，在α-mem培养基(含15％胎牛血清、2mmol/l谷氨酰胺、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中37℃、5％co2培养，每2～3天换液1次。

每天在倒置显微镜下观察细胞生长状况。当细胞生长至80％汇合状态时，用0.25％胰蛋白酶按1:2消化传代。通过检测间充质干细胞的表面标志物cd44、cd90、cd146、stro-1和干细胞的多向分化能力、克隆形成能力等方法鉴定间充质干细胞。购买脐带间充质干细胞。购买脐带间充质干细胞。

2)构建病毒质粒

通过ncbi数据库查询yap的基因序列(geneid:10413)，应用whitehead提供的程序设计yap的sirna(序列为gcttcaggtcctcttcctgat)，将其插入慢病毒的shrna载体上，测序鉴定，最终构建成yap的shrna的质粒。设计yap基因全长的pcr引物，用pcr的方法得到yap的全长并加表面标记myc，将其连接到逆转录病毒的表达载体(pqcxih)上，测序鉴定，最终构建成myc-yap的质粒。然后进行病毒包装、收集，病毒滴度鉴定，分装后保存在-80度冰箱。

3)稳定转染细胞系的建立

对照scramble的shrna，yap的shrna转染根尖牙乳头干细胞、脐带干细胞，转染48小时后，用puromycin筛选7天后得到对照scramble和yap基因敲除的稳定转染干细胞，提取细胞的mrna和蛋白，在mrna水平和蛋白水平检测shrna的敲除效果。

对照质粒及myc-yap的病毒转染根尖牙乳头干细胞、脐带干细胞，转染48小时后，用药物筛选得到yap过表达的稳定转染干细胞，在mrna和蛋白水平检测myc的表达鉴定外源性yap的表达。结果表明yap基因敲除及过表达稳定转染细胞的建立。

本实施例中所采用的具体方法：

1)实时反转录聚合酶链式反应的过程为：

1.引物设计，primer3及oligo6等生物软件；

2.rna提取：

2.1培养皿细胞弃上清，pbs冲洗2遍，加700ulqiazol，吹打混匀，收于ep管，室温孵育5min，加140ul氯仿，强力震荡混匀15s，室温孵育3min，4℃12000g离心15min，收上清于新ep管；

2.2取700ul样本至rneasyminicolumn，4℃8000g离心15s，弃下层液体；

2.3加700ulbufferrwt至rneasyminicolumn，4℃8000g离心15s，弃下层液体；

2.4加500ulbufferrpe至rneasyminicolumn，4℃8000g离心15s，弃下层液体；

2.5重复步骤2.4；

2.6转移rneasyminicolumn至一新2mlcollectiontube，4℃1000g离心1min，弃下层液体；

2.7转移rneasyminicolumn至一新2mlcollectiontube，加30-50ulrnase-freewater，4℃8000g离心15s，收集下层液体于新ep管，测rna浓度，-80℃保存。

3.反转录pcr

3.1microtube管中配制下列模板rna/引物混合液：模板rna：1ng～5ug；oligo(dt)(500μg/ml)：1μl；10mmdntp：1μl；加入灭菌蒸馏水至12ul。

3.265℃保温5分钟后迅速在冰上冷冻1分钟以上。

3.3离心数秒使模板rna/引物的变性溶液聚集于microtube管底部。

3.4在上述microtube管中配制加入下列反转录反应液：5×firststrandbuffer：4ul；0.1mdtt：2ul；rnaseout：1ul。

3.5混匀各组分，37℃保温2分钟后冰上冷却。

3.6加入1ulm-mlv逆转录酶，轻轻吹打混匀。

3.737℃保温2分钟，70℃保温15分钟，4℃保温，样本收于-20℃。

4.实时定量荧光pcr

配置real-timepcr反应体系如下：5×sybrmix：5μl；pcrprimer(5pmol)：0.5μl；ddh2o：5μl；cdna：10.5μl；total21μl。

反应体系如表1：

表1反应体系

2)westernblot的过程为：

1.细胞总蛋白的提取

1.1弃培养基，用4℃预冷的5mlpbs漂洗细胞两次，加入5mlpbs后，用细胞刮下培养皿中的细胞，收于15ml离心管，1100rpm离心6min；弃上清，加入1mlpbs重悬细胞，收于ep管，7200rpm离心2min；

1.2弃上清，以1:5(细胞：裂解液)体积比加裂解液(100ulripa+1ulpmsf+1ulpic)，冰上15min，每2-3min混悬一次；

1.34℃，14000rpm离心15min，收集上清液于新ep管中，-80℃保存。

2.bradford法测定蛋白浓度

2.1bsa蛋白标准品按说明依次用双蒸水稀释，使终浓度分别为1000μg/ml，750μg/ml，500μg/ml，250μg/ml，125μg/ml，62.5μg/ml，0μg/ml；

2.2根据样品和标准品数量，按每孔加200ul1x考马斯亮蓝液，取1ul样品和标准品加入96孔板中，室温孵育5min，设副孔和空白孔；

2.3测定595nm波长的吸光度。根据标准曲线计算蛋白浓度；

2.4根据蛋白浓度计算上样体积，每组蛋白的上样量为25μg。

3.聚丙烯酰胺凝胶电泳

3.1准备预成胶；

3.2变性：每孔25μg蛋白量上样,用蒸馏水将待测样本体积稀释至20ul，每样本加入5ulloadingbuffer(溴酚蓝)，95℃加热10min；

3.3上样，以80v电压电泳至溴酚蓝电泳至分离胶，将电压调到100v，直至溴酚蓝到达分离胶底部，终止电泳。

4.转膜

4.1准备预成膜；

4.2将电泳胶转移至预成膜中，使用biorad半干转进行转膜；

4.3取出pvdf膜，tbst漂洗5min。

5.westernblot滤膜杂交

5.1将转印后的pvdf膜用5％脱脂奶粉室温摇床封闭1小时；

5.2tbst漂洗10min×3次；

5.3将滤膜取出，放入5％脱脂奶粉稀释的一抗稀释液中，4℃摇床过夜；

5.4tbst洗膜，10min×3次；

5.5将滤膜放入5％脱脂奶粉稀释的hrp标记的二抗中，室温摇床孵育1小时；

5.6tbst洗膜，10min×3次。

6.显色

将pvdf膜胶面朝上放在保鲜膜上，加入1:1混合的显影液，使其均匀覆盖膜，暗室曝光，扫描。

实施例2yap对间充质干细胞成骨/成牙分化功能影响的体外研究

1)取实施例1构建的过表达yap的根尖牙乳头间充质干细胞，以2×10³/cm²的浓度接种于6孔板中，待细胞生长至80％融合后，用成骨诱导培养液将干细胞在体外向成骨/成牙本质方向分化诱导，每3天换1次液。

在mrna水平检测相关核心转录因子osx，结果表明过表达yap抑制根尖牙乳头间充质干细胞osx的表达(图1-c)。

并在诱导0，3，7，14和21天的不同时间点收获细胞，在mrna水平检测成骨分化指标-骨涎蛋白(bsp，图1-d)，结果表明过表达yap抑制根尖牙乳头间充质干细胞bsp的表达。

在mrna水平检测成牙本质分化指标-牙本质涎蛋白(dspp，图1-e)、牙本质基质酸性磷酸化蛋白1(dmp1，图1-f)，结果表明过表达yap抑制根尖牙乳头间充质干细胞dspp和dmp1的表达。

上述结果表明过表达yap抑制根尖牙乳头间充质干细胞成骨分化，抑制成牙分化。

2)取实施例1构建的敲除yap的脐带间充质干细胞被使用慢病毒介导shrna(yapsh)感染，2μg/ml嘌呤霉素筛选后，实时定量rt-pcr检测结果表明，yap可以被yapsh有效的敲除(图2-a)；取脐带干细胞以2×10³/cm²的浓度接种于6孔板中，待细胞生长至80％融合后，用成骨诱导培养液将干细胞在体外向成骨/成牙本质方向分化诱导，每3天换1次液，在光镜下观察钙结节形成情况。

3周后检测茜素红染色及测定钙离子浓度来检测晚期成骨指标-细胞矿化能力，结果表明基因敲除yap促进脐带间充质干细胞体外矿化能力(图2-b,2-c)。在mrna水平检测相关核心转录因子osx，结果表明基因敲除yap促进脐带间充质干细胞osx的表达(图2-d)。

并在诱导0，3，7，14和21天的不同时间点收获细胞，在mrna水平检测成骨分化指标-bsp(图2-e)，结果表明基因敲除yap促进脐带间充质干细胞bsp的表达。

在mrna水平检测成牙本质分化指标-dspp(图2-f)、dmp1(图2-g)，结果表明基因敲除yap促进脐带间充质干细胞dspp和dmp1的表达。

上述结果表明基因敲除yap促进脐带间充质干细胞成骨分化，促进成牙分化。

3)取实施例1构建的敲除yap的骨髓间充质干细胞被使用慢病毒介导shrna(yapsh)感染，2μg/ml嘌呤霉素筛选后，实时定量rt-pcr检测结果表明，yap可以被yapsh有效的敲除(图3-a)；

取骨髓干细胞以2×10³/cm²的浓度接种于6孔板中，待细胞生长至80％融合后，用成骨诱导培养液将干细胞在体外向成骨/成牙本质方向分化诱导，每3天换1次液，在光镜下观察钙结节形成情况。

3周后检测茜素红染色来检测晚期成骨指标-细胞矿化能力，结果表明基因敲除yap促进骨髓间充质干细胞体外矿化能力(图3-b)。

在mrna水平检测下游基因barx1，结果表明基因敲除yap促进骨髓间充质干细胞barx1的表达(图3-c)。

在mrna水平检测相关核心转录因子osx，结果表明基因敲除yap促进骨髓间充质干细胞osx的表达(图3-d)。

并在诱导0，3，7，10和14天的不同时间点收获细胞，在mrna水平检测成骨分化指标-bsp(图3-e)，结果表明基因敲除yap促进骨髓间充质干细胞bsp的表达。

在mrna水平检测成牙本质分化指标-dspp(图3-f)、dmp1(图3-g)，结果表明基因敲除yap促进骨髓间充质干细胞dspp和dmp1的表达。

上述结果表明基因敲除yap促进骨髓间充质干细胞成骨分化，促进成牙分化。

具体过程为：

1.茜素红染色

1.1弃掉培养基，pbs洗2次；

1.270％乙醇固定，4℃，1h；

1.3双蒸水洗2次；

1.440mm茜素红溶液(ph4.2)室温染色1-10min，肉眼观察着色情况；

1.5双蒸水洗5次，轻轻吹打；

1.6扫描仪透摄模式采集图像。

2.ca²⁺浓度检测

2.1茜素红染色后，加入10％w/vcpc，室温放置30min(ar-s被溶解至cpc中)；

2.2以1:10稀释溶液，在酶标仪中以562nm波长测定其吸光度值(od)；

2.3以ar-s标准曲线计算ca²⁺的相对浓度。

3.real-timert-pcr

步骤同实施例1。rt-pcr引物序列为：

osx-f：cctcctcagctcaccttctc(seqidno:1)；

osx-r：gttgggagcccaaatagaaa(seqidno:2)；

barx1-f：cgcttcgagaagcagaagta(seqidno:3)

barx1-r：cttcatcctccgattctggt(seqidno:4)

bsp-f：caggccacgatattatctttaca(seqidno:5)；

bsp-r：ctcctcttcttcctcctcctc(seqidno:6)；

dspp-f：cgacataggtcacaatgaggatgtcg(seqidno:7)；

dspp-r：ttgcttccagctacttgaggtc(seqidno:8)；

dmp1-f：gacagcctctcactggattcgctgtc(seqidno:9)；

dmp1-r：ctcgcacacactctcccactc(seqidno:10)；

gapdh-f：cggaccaatacgaccaaatccg(seqidno:11)；

gapdh-r：agccacatcgctcagacacc(seqidno:12)。

实施例3过表达yap抑制根尖牙乳头干细胞体内矿化组织生成能力的研究

为了验证过表达yap对根尖牙乳头干细胞牙向/骨向分化的影响，将scaps与ha/tap混合，植入裸鼠皮下，观察过表达yap后在体内环境中对scaps分化的影响。

取5只裸鼠，分别在其后肢皮下植入scaps与ha/tcp混合物，植入8周后，取出组织标本进行切片染色分析(图4)标尺100um。，图4-a为对照组(scaps-pqcxih+ha/tcp)，图4-b示实验组(scaps-myc-yap+ha/tcp)。结果显示，实验组根尖牙乳头干细胞成矿化组织能力显著弱于对照组，实验组矿化组织形成面积较对照组明显减小(图4-c)。

具体过程为：

1.细胞移植

1.1分别取生长状态良好的第4代细胞，以1×10⁵个/皿的密度接种于10cm培养皿，待细胞长至80％汇合度时弃掉培养基，用pbs漂洗(为保证细胞状态，细胞汇合度不宜过大)；

1.2每皿细胞加3ml不含edta的胰酶，于37℃孵育2min，将细胞从培养皿上洗脱，加入4ml含15％fbs、1％双抗和1％l-谷氨酰胺的α-mem培养基中和胰酶作用，之后将细胞悬液转移至50ml的离心管中；

1.3于1000rpm，离心6min。

1.4用上述含15％fbs、1％双抗和1％l-谷氨酰胺的α-mem培养基重悬细胞，计数，然后取1ml细胞悬液(约4×10⁶个/ml)至含有40mg羟基磷灰石/磷酸三钙(ha/tcp)的2ml圆底ep管中(要保证每组细胞量一致，约4×10⁶个细胞/样本)。

1.537℃旋转摇床孵育1.5h。

1.6短时离心，使ha沉于管底，吸弃上清，细胞与ha混合物待用。

1.8裸鼠称重，4％水合氯醛腹腔注射麻醉。75％酒精消毒背部皮肤，在背部中线处剪一2-3cm的切口。

1.9钝性分离皮下结缔组织，将细胞与ha/tcp混合物植入裸鼠皮下，每只裸鼠可植入2个部位，左侧为对照组，右侧为实验组，缝合皮肤。

2.标本固定，脱钙，脱水包埋，制作石蜡切片

在体内移植8周后处死裸鼠，取出组织标本，置于4％多聚甲醛中固定，之后转至ph值等于7(7.4-7.6)的10％edta内，完全脱钙后流水冲洗24小时，随后将组织脱水包埋。

脱水步骤：75％乙醇ⅰ：10min；75％乙醇ⅱ：10min；85％乙醇ⅰ：10min；85％乙醇ⅱ：10min；95％乙醇ⅰ：10min；95％乙醇ⅱ：10min；无水乙醇ⅰ：30min；无水乙醇ⅱ：30min；二甲苯ⅰ：30min；二甲苯ⅱ：30min；浸蜡ⅰ：30min；浸蜡ⅱ：过夜。

包埋：浸蜡结束后，将组织转到预热的包埋框中，迅速倾入熔蜡，用温热的镊子调整组织块的位置，制冷机上放置，使熔蜡凝固。

切片：修整蜡块后在轮转切片机切5μm厚连续切片，将切片裱于多聚赖氨酸处理的玻片上，37℃干燥过夜。

石蜡切片he染色步骤：二甲苯ⅰ：10min；二甲苯ⅱ：10min；无水乙醇ⅰ：3min；无水乙醇ⅱ：3min；95％乙醇ⅰ：3min；95％乙醇ⅱ：3min；85％乙醇：3min；75％乙醇：3min；流水冲洗：3min；蒸馏水洗：1min；苏木精液染色：2min；流水洗去苏木精液：30s；1％盐酸-乙醇：3s；流水冲洗返蓝：10min；蒸馏水洗：1min；0.5％伊红液染色：1min；蒸馏水稍洗：2s；80％乙醇：10s；95％乙醇ⅰ：10s；95％乙醇ⅱ：10s；无水乙醇ⅰ：10s；无水乙醇ⅱ：10s；二甲苯ⅰ：2min；二甲苯ⅱ：2min；中性树胶封固。

实施例4在间充质干细胞yap和ap2a形成蛋白复合体调节barx1基因表达

前期研究表明bcor为ap2a上游基因，负向调控ap2a的表达，而ap2a可以促进间充质干细胞成骨/成牙分化。为了揭示yap调节barx1的分子机制，间充质干细胞利用表达flag标签的野生型bcor和ap2a的逆转录病毒，在2微克/毫升嘌呤霉素筛选后，western印迹结果表明bcor、ap2a在间充质干细胞异位表达(图5-a、5-c)。实时定量rt-pcr结果显示，过表达bcor促进barx1在间充质干细胞的表达(图5-b)，过表达ap2a抑制barx1在间充质干细胞的表达(图5-d)。

进一步，间充质干细胞利用表达myc标签的野生型yap的逆转录病毒，在2微克/毫升嘌呤霉素筛选后，western印迹结果表明yap在间充质干细胞异位表达(图5-e)；实时定量rt-pcr结果显示，过表达yap抑制barx1在间充质干细胞的表达(图5-f)。另外，间充质干细胞被使用慢病毒介导shrna(yapsh)感染，2μg/ml嘌呤霉素筛选后，实时定量rt-pcr检测结果表明，yap可以被yapsh有效的敲除(图5-g)；实时定量rt-pcr检测结果表明，基因敲除yap促进barx1在间充质干细胞的表达(图5-h)。

此外，生物信息学分析发现了barx1的转录启动子上游2kb的保守序列区域存在着转录因子ap2a的蛋白结合位点，推测barx1可能是转录因子ap2a的下游基因，其表达和功能受ap2a的调控，染色质免疫共沉淀(chip)结果证实了barx1启动子上ap2a蛋白的结合(图5-i)(横坐标为ap2abindingsite的缩写即ap2abs，共有5个，5kb-down代表基因编码区下游5kb，作为阴性对照)。

对ap2a和yap进行结构分析发现，ap2a存在py结构域，yap存在ww功能域，以往研究证实蛋白的py结构域和ww功能域可以结合，免疫共沉淀(co-ip)结果表明yap和ap2a在间充质干细胞可以形成蛋白复合体(图6-a、6-b、6-c)。

在mrna水平检测ap2a、yap在非牙源性间充质干细胞(wjcmscs、adscs、bmscs)与牙源性间充质干细胞(scaps、dpscs、pdlscs)中的表达情况，结果显示相比牙源性间充质干细胞，ap2a在非牙源性间充质干细胞中表达升高(图6-d)，而yap在两种间充质干细胞中表达没有明显差异(图6-e)，此外co-ip结果显示yap-ap2a蛋白复合体在非牙源性间充质干细胞wjcmscs中多于牙源性间充质干细胞scaps(图6-f)。

上述结果表明在间充质干细胞中yap和ap2a可以形成蛋白复合体，通过ap2a结合到barx1基因启动子序列，共同抑制barx1基因的表达，从而调节间充质干细胞的分化功能。

具体过程为：

1.westernblot：

步骤同实施例1。

2.real-timert-pcr

步骤同实施例1。rt-pcr引物序列为：

yap1-f：cacagcatgttcgagctcat(seqidno:13)

yap1-r：gactactccagtgggggtca(seqidno:14)

ap2a-f：actgagactcccgtcaatgg(seqidno:15)

ap2a-r：gcgtgttccttaatccgtgt(seqidno:16)

3.chip

3.1培养皿细胞中加入甲醛，终浓度为1％，37℃，15min；

3.2弃含甲醛的培养基，用4℃预冷的5mlpbs漂洗细胞两次，加入5mlpbs后，用细胞刮刮下培养皿中的细胞，收于50ml离心管，4℃2000rpm离心4min；

3.3弃上清，每样本加入含蛋白酶抑制剂的室温sds裂解液200ul(100ulsds裂解液+1ulpmsf+1ulpic)，冰上10min；

3.4超声破碎，功率75％，3次，每次7-8s，间隔90s；

3.54℃，13000rpm离心10min，收集上清液于新ep管中；

3.6测dna浓度，将各样本制成同浓度、同体积样本；

3.7用chip稀释缓冲液(含蛋白酶抑制剂)将上述样本稀释10倍；取1％稀释后的样本作为input，加入20ul5mnacl，65℃，4h，-20℃保存待用；

3.8将剩余样本分组，目的蛋白组中加入免疫沉淀抗体2ug，阴性对照组中加入igg2ug，4℃旋转摇床孵育1h；

3.9加入60ul蛋白a琼脂糖珠子，4℃旋转摇床孵育过夜；

3.10轻柔离心，小心去除上清液，得到琼脂糖凝胶/抗体/组蛋白复合体，分别加入1ml下列缓冲液清洗上述复合体：

1)低盐免疫沉淀复合体清洗缓冲液，1次，1min/次，4℃5000rpm离心；

2)高盐免疫沉淀复合体清洗缓冲液，1次，3min/次，4℃5000rpm离心；

3)氯化锂免疫沉淀复合体清洗缓冲液，1次，1min/次，4℃5000rpm离心；

4)te缓冲液，2次，1min/次，4℃5000rpm离心；

3.11在清洗后的复合体中加入250ul洗脱液(1％sds，0.1mnahco3)，旋转摇床室温孵育15min，4℃5000rpm离心，将上清液转入新的ep管内，再重复一遍，共得到500ul洗脱后的样本；

3.12在洗脱样本中加入20ul5mnacl65℃4h；

3.13dna纯化：

3.13.1在input和洗脱样本中加入10ul0.5medta，20ul1mtris-hcl(ph6.5)和1ul20mg/ml蛋白酶k，45℃，1h；

3.13.2加入500ul酚/氯仿，涡旋混匀，静置5min，4℃14000rpm5min离心；

3.13.3收集上清液至新ep管，加入1ml乙醇+1‰糖原，-20℃30min-1h，4℃14000rpm10min离心；

3.13.4弃上清液，室温晾干，加入100-200ul双蒸水重悬。

3.14real-timepcr:

步骤同实施例1。real-timepcr引物序列为：

barx1-1-f：ggagagacagtgggctcttg(seqidno:17)

barx1-1-r：gcctggagtgaggacaaaga(seqidno:18)

barx1-2-f：caggtgccagggactgag(seqidno:19)

barx1-2-r：aagtcctttctccagctcca(seqidno:20)

barx1-3-f：tcccaccagagtttggtctt(seqidno:21)

barx1-3-r：actgttactgggcggagttg(seqidno:22)

barx1-4-f：ctctgtgccctccgtcac(seqidno:23)

barx1-4-r：agaccaaaagaggcgtgaga(seqidno:24)

barx1-5-f：ctcctttttggcctcccttc(seqidno:25)

barx1-5-r：cccaacccctaggctgag(seqidno:26)

barx1-nc-f：gggatctgaccagcatcagt(seqidno:27)

barx1-nc-r：aagattcgcaaggcagctaa(seqidno:28)

4.co-ip

4.1弃培养基，用4℃预冷的5mlpbs漂洗细胞两次，加入5mlpbs后，用细胞刮刮下培养皿中的细胞，收于50ml离心管，1100rpm离心6min；弃上清，加入1mlpbs重悬细胞，收于ep管，7200rpm离心2min；

4.2弃上清，加入1mlip裂解液，冰上15min，每2-3min混悬一次；

4.34℃，14000rpm离心15min，收集上清液于新ep管中；

4.4bradford法测定蛋白浓度，步骤同实施例1；

4.5根据蛋白样本的浓度将样本配制成同浓度同体积样本，取25ug蛋白样本作为input，蛋白变性，步骤同实施例1；

4.6将剩余样本平均分为两组，目的蛋白组中加入免疫沉淀抗体2ug，阴性对照组中加入igg2ug，4℃旋转摇床孵育1h；

4.7加入40ul蛋白a琼脂糖珠子，4℃旋转摇床孵育过夜；

4.8轻柔离心，小心去除上清液，加入1ml20％免疫共沉淀洗脱液清洗，4℃5000rpm离心30s，去除上清液，重复3-4次；

4.9加入30ul2×loadingbuffer(溴酚蓝)，95℃加热5min变性；

4.10input与免疫共沉淀样本一起进行westernblot，步骤同实施例1。

实施例5在间充质干细胞中，ap2a与runx2竞争性结合yap形成蛋白复合体，调节间充质干细胞的分化

为了阐明yap抑制间充质干细胞成骨分化的作用，通过查阅文献发现成骨相关转录因子runx2也存在py功能域，在成骨细胞中可以和yap形成蛋白复合体；过表达和基因敲除yap的co-ip结果表明yap和runx2在间充质干细胞也是可以形成蛋白复合体的(图7-a、7-b)。此外，过表达ap2a的co-ip结果显示yap-runx2蛋白复合体减少(图7-c)，说明ap2a与runx2(成骨相关的转录因子)竞争性结合yap。

以上结果说明在间充质干细胞中，yap-runx2蛋白复合体调控干细胞成骨分化，而ap2a与runx2竞争性结合yap，通过调控barx1的表达，调节干细胞成牙分化。

具体过程为：

1.co-ip

步骤同实施例4。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

sequencelisting

<110>首都医科大学附属北京口腔医院

<120>yap的用途

<130>mp1619298

<160>28

<170>patentinversion3.3

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列

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cctcctcagctcaccttctc20

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<212>dna

<213>人工序列

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caggccacgatattatctttaca23

<210>6

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<212>dna

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ctcctcttcttcctcctcctc21

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<212>dna

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<212>dna

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