一种京尼平的制备方法与流程

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种京尼平的制备方法。

背景技术：

游离酶在酶反应的最适条件下进行催化，存在着容易失活、反应后不能回收等缺陷，且游离酶不易与产物分开，影响产品的提纯和质量。酶的固定化能有效地解决上述问题。固定化酶不仅具有酶的催化特性，而且反应后可用过滤或者离心的方式与反应液分离，可以反复使用。酶可以采用不同的载体和方法进行固定，酶在固定化后，酶学性质包括温度、pH、稳定性等与游离酶有很大的差别。纳米SiO₂颗粒的粒径范围在1-100nm，具有分散性好、稳定性高、比表面积大、生物相容性高等优异的性质。

京尼平是栀子苷在β-葡萄糖苷酶的作用下的水解产物，是一种新型的生物交联剂，可与多种生物大分子进行交联，如明胶、壳聚糖、蛋白质、胶原蛋白等。京尼平的药效高于栀子苷，具有抗感染、肝脏保护等作用。目前，京尼平的生物制备主要依靠游离β-葡萄糖苷酶和微生物的反应来实现。在游离酶的反应体系中，京尼平容易与氨基酸或蛋白质生成可溶性的蓝色色素，因而影响了产品质量，降低了产率(Gong G H,et al.Purification and characterization of a β-glucosidase from Aspergillus niger and its application in the hydrolysis of geniposide to genipin[J].Journal of Microbiology and Biotechnology,2014,24(6):788-794.)。在微生物的反应体系中，虽不存在京尼平与大分子的交联反应，但反应速率较慢(Dong Y,et al.Biotransformation of geniposide in Gardenia jasminoides to genipin by Trichoderma harzianum CGMCC 2979[J].Chinese Journal of Catalysis,2014,35(9):1534-1546.)。常见的固定化载体有壳聚糖、海藻酸钙等，与纳米材料相比，存在固定化酶分散性差、载酶量低等问题(Yang Y S,et al.Transformation of geniposide into genipin by immobilized β-glucosidase in a two-phase aqueous-organic system[J].Molecules,2011,16(5):4295-4304.)。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种京尼平的制备方法，利用以纳米SiO₂颗粒为载体，戊二醛为交联剂，与β-葡萄糖苷酶共价结合制备得到的纳米固定化酶，高效水解栀子苷，制备京尼平。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种京尼平的制备方法，具体步骤如下：

步骤1，将氨基化修饰的纳米SiO₂颗粒与戊二醛混合，得到Nano-SiO₂@NH₂@CHO，加入β-葡萄糖苷酶，在4℃下进行交联，交联结束后，离心收集纳米固定化酶；

步骤2，将栀子苷溶于pH为6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，加入纳米固定化酶，在50℃下反应1-3h，反应结束后离心，分离上清液得到京尼平，分离得到的纳米固定化酶重复使用。

优选地，步骤1中，交联时间为24h。

与常规载体制备的固定化酶相比，本发明的纳米固定化酶的载酶量更大、分散性更佳，对栀子苷的转化效率更高。本发明的纳米固定化酶不仅避免了京尼平和酶蛋白之间的交联反应，提高了产物的质量，而且能够重复使用，提高了酶的使用效率，降低了生产成本。

附图说明

图1为京尼平的生成量随反应时间的变化情况图。

图2为纳米固定化酶的重复使用结果图。

具体实施方式

以下通过实施例和附图对本发明作进一步说明。

实施例中所用酶和药品均购自国药集团化学试剂有限公司。

实施例1

纳米SiO₂颗粒的氨基化修饰可参考文献(Huang,J,et al.A new immobilized glucose oxidase using SiO₂nanoparticles as carrier[J].Materials Science and Engineering C,2011,31(7):1374-1378.)。

将40mg纳米SiO₂颗粒超声波分散在4mL无水乙醇中，加入80μL3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，充分混匀，在30℃、120r/min摇床中反应24h，即完成纳米SiO₂颗粒的氨基化过程，得到Nano-SiO₂@NH₂。反应结束后，将悬浊液在8000×g下离心3min，弃上清取沉淀，并将沉淀用蒸馏水洗涤5次。沉淀再用4mL磷酸缓冲液(10mM,pH 7.3)充分重悬后，加入1mL 25％的戊二醛溶液，在30℃、120r/min摇床中反应2h，即完成氨基化的载体与戊二醛的交联反应，得到Nano-SiO₂@NH₂@CHO。反应结束后，将悬浊液在8000×g下离心3min，弃上清取沉淀，同样将沉淀用蒸馏水洗涤5次后待用。将Nano-SiO₂@NH₂@CHO与过量的β-葡萄糖苷酶酶液混合，在4℃下偶联24h。反应结束后，将悬浊液在8000×g下离心3min，收集上清和纳米固定化酶，将纳米固定化酶用蒸馏水洗涤5次后待用。

在4.8mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(50mM，pH 6.0)中加入200μL，1％(w/v)的栀子苷，再加入200μL纳米固定化酶(0.5U)，在50℃水浴锅中反应1.5h，每隔10min进行取样，样品在8000×g下离心3min，利用高效液相色谱(HPLC)和薄层层析(TLC)测定上清中的栀子苷和京尼平的含量随反应时间的变化情况。反应结束后，离心回收纳米固定化酶，并进行第二个循环，测定上清中的栀子苷和京尼平的含量。重复10个循环，以第一个循环时京尼平的生成量为100％。

纳米固定化酶制备京尼平的结果如图1所示。从图中可以看出，反应速率很快，反应1h后，栀子苷的水解率为92.5％，反应1.5h后，栀子苷的水解率高达94％，京尼平的生成量为1.09mg。TLC的实验结果与HPLC的实验结果一致，随着反应时间的延长，栀子苷在纳米固定化酶的作用下逐渐生成京尼平，直到反应平衡。在文献报道的游离酶的催化反应体系中(Gong G,et al.Purification and characterization of a β-glucosidase from Aspergillus niger and its application in the hydrolysis of geniposide to genipin[J].Journal of Microbiology and Biotechnology,2014,24(6):788-794.)，随着时间的延长，京尼平的产率会下降，这是由于京尼平与酶蛋白的交联反应，而纳米固定化酶在短时间内能够催化栀子苷生成京尼平，且纳米固定化酶容易与反应液分离，能有效解决该问题。

纳米固定化酶重复使用的结果如图2所示，利用纳米固定化酶制备京尼平的过程中，当重复使用5次时，残留酶活为87.5％，重复使用10次时，残留酶活仍为55.8％。重复使用次数是关系到纳米固定化酶能否实际应用的重要问题，本发明方法能够实现产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯的工艺，另外，酶的使用效率也得到明显的提升，从而降低了生产成本。