一种检测北美H3N8亚型犬流感病毒的引物组及其应用的制作方法

本发明涉及一种检测北美H3N8亚型犬流感病毒的引物组及其应用。

背景技术：

近年来，甲型流感病毒感染犬的报道不断出现，包括H3N8亚型流感病毒、H3N2亚型流感病毒、H5N1亚型流感病毒和H1N1亚型流感病毒，美国、英国、澳大利亚等国家均有H3N8亚型犬流感病毒疫情的报道。H3N8亚型犬流感病毒能够在犬中有效传播，引起发热、咳嗽、流鼻涕等流感样症状，严重的引起犬出血性肺炎并导致死亡。

目前，中国尚未有犬感染北美H3N8亚型犬流感病毒的报道。随着近几年宠物市场扩展，以及各国警犬、军犬引种工作的日益频繁，这增加了北美H3N8亚型犬流感病毒传入中国的可能，因此，需要建立一种针对北美H3N8亚型犬流感病毒的快速检测方法。

现有北美H3N8亚型犬流感病毒的鉴定方法为血凝抑制试验。血凝抑制试验涉及到病原的分离，操作相对繁琐，且各亚型之间容易相互影响，敏感性较低，耗时耗力。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种检测北美H3N8亚型犬流感病毒的引物组及其应用。

本发明首先提供了一种引物组，包括引物对甲和引物对乙；所述引物对甲由引物F1和引物R1组成；所述引物对乙由引物F2和引物R2组成。

所述引物F1为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物R1为如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。

所述引物F2为如下(b1)或(b2)：

(b1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；

(b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；

所述引物R2为如下(b3)或(b4)：

(b3)序列表的序列4所示的单链DNA分子；

(b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子。

本发明还保护一种特异引物对，为所述引物对甲或所述引物对乙。

所述引物组或所述特异引物对的用途为如下(c1)辅助鉴定北美H3N8亚型犬流感病毒；(c2)辅助鉴定待测样本中是否含有北美H3N8亚型犬流感病毒。

本发明还保护所述引物组或所述特异引物对在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)：(c1)辅助鉴定北美H3N8亚型犬流感病毒；(c2)辅助鉴定待测样本中是否含有北美H3N8亚型犬流感病毒。

本发明还保护一种试剂盒，包括所述引物组或所述特异引物对；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)：(c1)辅助鉴定北美H3N8亚型犬流感病毒；(c2)辅助鉴定待测样本中是否含有北美H3N8亚型犬流感病毒。

所述试剂盒还包括标准品质粒。具体来说，所述试剂盒包括标准品质粒甲和/或标准品质粒乙。所述标准品质粒甲为具有序列表的序列5所示DNA分子的质粒。所述标准品质粒甲为具有序列表的序列5第376-465位核苷酸所示DNA分子的质粒。所述标准品质粒甲为将序列表的序列5所示DNA分子插入pUC57载体的多克隆位点得到的重组质粒。所述标准品质粒甲为将序列表的序列5第376-465位核苷酸所示DNA分子插入pUC57载体的多克隆位点得到的重组质粒。所述标准品质粒乙为具有序列表的序列6所示DNA分子的质粒。所述标准品质粒乙为具有序列表的序列6第868-1012位核苷酸所示DNA分子的质粒。所述标准品质粒乙为将序列表的序列6所示DNA分子插入pUC57载体的多克隆位点得到的重组质粒。所述标准品质粒乙为将序列表的序列6第868-1012位核苷酸所示DNA分子插入pUC57载体的多克隆位点得到的重组质粒。

本发明还保护用于检测DNA分子甲的物质和用于检测DNA分子乙的物质在制备试剂盒中的应用；所述DNA分子甲为北美H3N8亚型犬流感病毒cDNA中所述引物对甲的靶序列；所述DNA分子乙为北美H3N8亚型犬流感病毒cDNA中所述引物对乙的靶序列；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)：(c1)辅助鉴定北美H3N8亚型犬流感病毒；(c2)辅助鉴定待测样本中是否含有北美H3N8亚型犬流感病毒。

本发明还保护用于检测DNA分子甲的物质或用于检测DNA分子乙的物质在制备试剂盒中的应用；所述DNA分子甲为北美H3N8亚型犬流感病毒cDNA中所述引物对甲的靶序列；所述DNA分子乙为北美H3N8亚型犬流感病毒cDNA中所述引物对乙的靶序列；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)：(c1)辅助鉴定北美H3N8亚型犬流感病毒；(c2)辅助鉴定待测样本中是否含有北美H3N8亚型犬流感病毒。

所述DNA分子甲具体如序列表的序列5第376-465位核苷酸所示。所述DNA分子乙具体如序列6第868-1012位核苷酸所示。

本发明还保护一种辅助鉴定北美H3N8亚型犬流感病毒的方法，包括如下步骤：以待测病毒的cDNA为模板，分别采用所述引物对甲和所述引物对乙进行荧光定量PCR，如果均显示阳性扩增曲线、待测病毒为候选的北美H3N8亚型犬流感病毒，如果不满足上述条件、待测病毒为候选的非北美H3N8亚型犬流感病毒。

本发明还保护一种辅助鉴定待测样本中是否含有北美H3N8亚型犬流感病毒的方法，包括如下步骤：以待测样本的cDNA为模板，分别采用所述引物对甲和所述引物对乙进行荧光定量PCR，如果均显示阳性扩增曲线、待测样本疑似含有北美H3N8亚型犬流感病毒，如果不满足上述条件、待测样本疑似不含有北美H3N8亚型犬流感病毒。

本发明还保护一种辅助鉴定北美H3N8亚型犬流感病毒的方法，包括如下步骤：以待测病毒的cDNA为模板，采用所述引物对甲或所述引物对乙进行荧光定量PCR，如果显示阳性扩增曲线、待测病毒为候选的北美H3N8亚型犬流感病毒，如果不显示阳性扩增曲线、待测病毒为候选的非北美H3N8亚型犬流感病毒。

本发明还保护一种辅助鉴定待测样本中是否含有北美H3N8亚型犬流感病毒的方法，包括如下步骤：以待测样本的cDNA为模板，采用所述引物对甲或所述引物对乙进行荧光定量PCR，如果显示阳性扩增曲线、待测样本疑似含有北美H3N8亚型犬流感病毒，如果不显示阳性扩增曲线、待测样本疑似不含有北美H3N8亚型犬流感病毒。

以上任一所述方法中，采用所述引物对甲时，荧光定量PCR的反应程序为：95℃10min；95℃15s、59℃1min，40个循环。

以上任一所述方法中，采用所述引物对乙时，荧光定量PCR的反应程序为：95℃10min；95℃15s、58℃1min，40个循环。

以上任一所述方法中，采用所述引物对甲时，荧光定量PCR的反应体系为：SYBR Premix Ex Taq(2X)10μL、引物F1 0.5μL、引物R1 0.5μL、模板2μL，加双蒸水至20μl。体系中，引物F1和引物R1在反应体系中的浓度均为0.5μM。

以上任一所述方法中，采用所述引物对乙时，荧光定量PCR的反应体系为：SYBR Premix Ex Taq(2X)10μL、引物F2 0.5μL、引物R2 0.5μL、cDNA2μL，加双蒸水至20μl。体系中，引物F2和引物R2在反应体系中的浓度均为0.5μM。

以上任一所述方法中，荧光定量PCR采用SYBR Green Ⅰ染料。SYBR Green Ⅰ是一种结合于所有双链DNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，在游离状态下，SYBR Green Ⅰ发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合，荧光强度大大增强。因此，可以根据荧光信号检测出PCR体系中存在的双链DNA数量。虽然荧光定量PCR(染料法)为非特异性检测，但只要引物设计特异，排除非特异性扩增、引物二聚体等因素，并进行反应条件优化，在不需要探针条件下即可进行检测，省钱省时省力。

采用本发明提供的引物组、试剂盒进行检测，特异性好、敏感性高，只需要4-5小时的时间即可对临床样品进行检测，操作简单、容易推广，便于基层操作和应用，对于北美H3N8亚型犬流感病毒疫病诊断和流行病学调查具有重大的应用价值。

附图说明

图1为实施例3的结果。

图2为实施例4的结果。

图3为实施例5的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

SYBR Premix Ex Taq(2X)：美国生命技术公司(Life Technologies)，货号4461693。

实施例1、引物组的设计

经过大量序列分析获得多个引物对，通过预实验对每个引物对的特异性和灵敏度进行检测，最终筛选出两个用于鉴定H3N8亚型犬流感病毒的引物对。

引物对甲(靶序列位于HA基因，退火温度为59℃)由引物F1和引物R1组成。

引物对乙(靶序列位于NA基因，退火温度为58℃)由引物F2和引物R2组成。

引物F1(序列表的序列1)：5'-TTGCTACCCATATGACATCCCTGAC-3'；

引物R1(序列表的序列2)：5'-GTGAATCCCTCTGCTGTGAATTCCA-3'。

引物F2(序列表的序列3)：5'-CCCCAATGAAGGGAAGGTGGAATGC-3；

引物R2(序列表的序列4)：5'-ATCCTCTCCCCTAGGGGTGTCAGTG-3'。

实施例2、方法的建立

1、提取待测样本的总RNA并反转录为cDNA。

待测样本可为待测组织或待测病毒。待测组织可为犬的肝组织、犬的脑组织、犬的肺组织、犬的鼻腔拭子等。

2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用实施例1设计的引物对甲进行荧光定量PCR，实时监测荧光强度。

荧光定量PCR的反应体系(20μL)：SYBR Premix Ex Taq(2X)10μL、引物F1 0.5μL、引物R1 0.5μL、cDNA 2μL，加双蒸水至20μl。

荧光定量PCR的反应程序：95℃10min；95℃15s、59℃1min，40个循环。

3、以步骤1得到的cDNA为模板，采用实施例1设计的引物对乙进行荧光定量PCR，实时监测荧光强度。

荧光定量PCR的反应体系(20μL)：SYBR Premix Ex Taq(2X)10μL、引物F2 0.5μL、引物R2 0.5μL、cDNA2μL，加双蒸水至20μl。

荧光定量PCR的反应程序：95℃10min；95℃15s、58℃1min，40个循环。

4、进行结果判断

当待测样本为待测组织时，如果步骤2和步骤3均显示阳性扩增曲线、待测样本为候选的具有北美H3N8亚型犬流感病毒的组织。

当待测样本为待测病毒时，如果步骤2和步骤3均显示阳性扩增曲线、待测病毒为候选的北美H3N8亚型犬流感病毒。

实施例3、标准曲线的建立

基因模板拷贝数＝DNA质量浓度/DNA分子量。

一、标准品质粒甲的制备

序列表的序列5所示的DNA分子为北美H3N8亚型犬流感病毒HA基因片段。将序列表的序列5所示的DNA分子插入pUC57载体的多克隆位点，得到标准品质粒甲。

二、标准品质粒乙的制备

序列表的序列6所示的DNA分子为北美H3N8亚型犬流感病毒NA基因片段。将序列表的序列6所示的DNA分子插入pUC57载体的多克隆位点，得到标准品质粒乙。

三、标准曲线甲的建立

1、用双蒸水10倍梯度稀释标准品质粒甲，得到浓度为1.0×10⁸-1.0×10³拷贝数/μL的各个稀释液。

2、以步骤1得到的稀释液为模板，采用实施例1设计的引物对甲进行荧光定量PCR，实时监测荧光强度。

荧光定量PCR的反应体系(20μL)：SYBR Premix Ex Taq(2X)10μL、引物F1 0.5μL、引物R1 0.5μL、模板2μL，加双蒸水至20μl。体系中，引物F1和引物R1在反应体系中的浓度均为0.5μM。

荧光定量PCR的反应程序：95℃10min；95℃15s、59℃1min，40个循环。

以ct值为纵坐标，以稀释液中标准品质粒甲的浓度以10为底的对数值为横坐标建立标准曲线，见图1A。标准曲线方程为：CT＝-3.051logC0+36.583(相关系数：R²＝0.988)。

四、标准曲线乙的建立

1、用双蒸水10倍梯度稀释标准品质粒乙，得到浓度为1.0×10⁹-1.0×10³拷贝数/μL的各个稀释液。

2、以步骤1得到的稀释液为模板，采用实施例1设计的引物对乙进行荧光定量PCR，实时监测荧光强度。

荧光定量PCR的反应体系(20μL)：SYBR Premix Ex Taq(2X)10μL、引物F2 0.5μL、引物R2 0.5μL、cDNA2μL，加双蒸水至20μl。体系中，引物F2和引物R2在反应体系中的浓度均为0.5μM。

荧光定量PCR的反应程序：95℃10min；95℃15s、58℃1min，40个循环。

以ct值为纵坐标，以稀释液中标准品质粒乙的浓度以10为底的对数值为横坐标建立标准曲线，见图1B。标准曲线方程为：CT＝-3.166logC0+38.797(相关系数：R²＝0.99)。

结合实施例2的方法和实施例3的标准曲线，可以计算出待测样本中H3N8亚型犬流感病毒的拷贝数。

实施例4、特异性

本实施例中所用的H3N2亚型犬流感病毒为毒株A/canine/Beijing/364/2009(H3N2)，记载于如下文献：A Multiplex RT-PCR Assay for Detection andDifferentiation of Avian-Origin Canine H3N2,Equine-Origin H3N8,Human-Origin H3N2,and H1N1/2009 Canine Influenza Viruses；Chenxi Wang,Qian Wang,Junyi Hu,Honglei Sun,Juan Pu,Jinhua Liu,Yipeng Sun；PLoSONE 12(1):e0170374。

本实施例中所用的H3N2亚型猪流感病毒为毒株A/swine/Guangdong/7/06(H3N2)，记载于如下文献：Identification of swine influenza A virus andStenotrophomonas maltophilia co-infection inChinese pigs；Dongjun Hou,Yuhai Bi,Honglei Sun,Jun Yang,Guanghua Fu,Yipeng Sun,Jinhua Liu,and Juan Pu；Virology Journal 2012,9:169。

本实施例中所用的H3N2亚型禽流感病毒为毒株A/duck/Anhui/D293/2014(H3N2)，记载于如下文献：北美H7亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法的建立；王晨曦、张谞霄、孙洪磊、蒲娟；中国兽医杂志，2016年(第52卷)第6期，28-32。

一、引物对甲的特异性

1、提取待测样本的总RNA并反转录为cDNA。

待测样本分别为：H3N2亚型犬流感病毒、H3N2亚型猪流感病毒、H3N2亚型禽流感病毒。

2、以标准品质粒甲或步骤1得到的cDNA为模板，采用实施例1设计的引物对甲进行荧光定量PCR，实时监测荧光强度。

荧光定量PCR的反应体系(20μL)：SYBR Premix Ex Taq(2X)10μL、引物F1 0.5μL、引物R1 0.5μL、模板2μL，加双蒸水至20μl。体系中，引物F1和引物R1在反应体系中的浓度均为0.5μM。

用2μL双蒸水代替cDNA，作为阴性对照。

荧光定量PCR的反应程序：95℃10min；95℃15s、59℃1min，40个循环。

结果见图2A。图2A中，1、2、3、4、5依次代表标准品质粒甲、H3N2亚型犬流感病毒、H3N2亚型猪流感病毒、H3N2亚型禽流感病毒和阴性对照。仅标准品质粒甲出现特异性扩增曲线，而H3N2亚型犬流感病毒、H3N2亚型猪流感病毒、H3N2亚型禽流感病毒以及阴性样品未出现扩增曲线，表明所建立的荧光定量PCR方法均具有较好特异性。

二、引物对乙的特异性

1、提取待测样本的总RNA并反转录为cDNA。

待测样本分别为：H3N2亚型犬流感病毒、H3N2亚型猪流感病毒、H3N2亚型禽流感病毒。

2、以标准品质粒乙或步骤1得到的cDNA为模板，采用实施例1设计的引物对乙进行荧光定量PCR，实时监测荧光强度。

荧光定量PCR的反应体系(20μL)：SYBR Premix Ex Taq(2X)10μL、引物F2 0.5μL、引物R2 0.5μL、cDNA2μL，加双蒸水至20μl。体系中，引物F2和引物R2在反应体系中的浓度均为0.5μM。

用2μL双蒸水代替cDNA，作为阴性对照。

荧光定量PCR的反应程序：95℃10min；95℃15s、58℃1min，40个循环。

结果见图2B。图2B中，1、2、3、4、5依次代表标准品质粒甲、H3N2亚型犬流感病毒、H3N2亚型猪流感病毒、H3N2亚型禽流感病毒和阴性对照。仅标准品质粒乙出现特异性扩增曲线，而H3N2亚型犬流感病毒、H3N2亚型猪流感病毒、H3N2亚型禽流感病毒以及阴性样品未出现扩增曲线，表明所建立的荧光定量PCR方法均具有较好特异性。

实施例5、灵敏度

一、引物对甲的灵敏度

1、用双蒸水10倍梯度稀释标准品质粒甲，得到2.5×10⁶copies/μL-25copies/μL的各个稀释液。

2、以步骤1得到的稀释液为模板，采用实施例1设计的引物对甲进行荧光定量PCR，实时监测荧光强度。

荧光定量PCR的反应体系(20μL)：SYBR Premix Ex Taq(2X)10μL、引物F1 0.5μL、引物R1 0.5μL、模板2μL，加双蒸水至20μl。体系中，引物F1和引物R1在反应体系中的浓度均为0.5μM。

荧光定量PCR的反应程序：95℃10min；95℃15s、59℃1min，40个循环。

结果见图3A。图3A中，1至6依次为DNA浓度由高至低的各个稀释液。结果表明，采用上述方法检测，模板中标准品质粒甲的最低检测限为25copies/μL。

二、引物对乙的灵敏度

1、用双蒸水10倍梯度稀释标准品质粒乙，得到3.7×10⁷copies/μL-37copies/μL的各个稀释液。

2、以步骤1得到的稀释液为模板，采用实施例1设计的引物对乙进行荧光定量PCR，实时监测荧光强度。

荧光定量PCR的反应体系(20μL)：SYBR Premix Ex Taq(2X)10μL、引物F2 0.5μL、引物R2 0.5μL、cDNA2μL，加双蒸水至20μl。体系中，引物F2和引物R2在反应体系中的浓度均为0.5μM。

荧光定量PCR的反应程序：95℃10min；95℃15s、58℃1min，40个循环。

结果见图3B。图3B中，1至7依次为DNA浓度由高至低的各个稀释液。结果表明，采用上述方法检测，模板中标准品质粒乙的最低检测限为37copies/μL。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 一种检测北美H3N8亚型犬流感病毒的引物组及其应用

<130> GNCYX170234

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttgctaccca tatgacatcc ctgac 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtgaatccct ctgctgtgaa ttcca 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccccaatgaa gggaaggtgg aatgc 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atcctctccc ctaggggtgt cagtg 25

<210> 5

<211> 1792

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tattcgtctc agggagcaaa agcaggggat atttctgtca atcatgaaga caaccattat 60

tttaatacta ctgacccatt gggcctacag tcaaaaccca atcagtggca ataacacagc 120

cacactgtgt ctgggacacc atgcagtagc aaatggaaca ttggtaaaaa caatgagtga 180

tgatcaaatt gaggtgacaa atgctacaga attagttcag agcatttcaa tggggaaaat 240

atgcaacaaa tcatatagaa ttctagatgg aagaaattgc acattaatag atgcaatgct 300

aggagacccc cactgtgacg cctttcagta tgagagttgg gacctcttta tagaaagaag 360

cagcgctttc agcaattgct acccatatga catccctgac tatgcaccgc tccgatccat 420

tgtagcatcc tcagggacag tggaattcac agcagaggga ttcacatgga caggtgtaac 480

tcaaaacgga agaagtggag cctgcaaaag gggatcagcc gatagtttct ttagccgact 540

gaattggcta acaaaatctg gaagctctta ccccacattg aatgtgacaa tgcctaacaa 600

taaaaatttc gacaagctat acatctgggg gattcatcac ccgagctcaa atcaagagca 660

gacaaaattg tacatccaag aatcaggacg agtaacagtc tcaacaaaaa gaagtcaaca 720

aacaataatc cctaacatcg gatctagacc gttggtcaga ggtcaatcag gcaggataag 780

catatactgg accattgtaa aacctggaga tatcctaatg ataaacagta atggcaactt 840

agttgcaccg cggggatatt ttaaattgaa cacagggaaa agctctgtaa tgagatccga 900

tgtacccata gacatttgtg tgtctgaatg tattacacca aatggaagca tctccaacga 960

caagccattc caaaatgtga acaaagttac atatggaaaa tgccccaagt atatcaggca 1020

aaacacttta aagctggcca ctgggatgag gaatgtacca gaaaagcaaa ccagaggaat 1080

ctttggagca atagcgggat tcatcgaaaa cggctgggaa ggaatggttg atgggtggta 1140

tgggttccga tatcaaaact ctgaaggaac agggcaagct gcagatctaa agagcactca 1200

agcagccatc gaccagatta atggaaagtt aaacagagtg attgaaagaa ccaatgagaa 1260

attccatcaa atagagaagg aattctcaga agtagaagga agaattcagg acttggagaa 1320

atatgtagaa gacaccaaaa tagacctatg gtcctacaat gcagaattgc tggtggctct 1380

agaaaatcaa catacaattg acttaacaga tgcagaaatg aataaattat ttgagaagac 1440

tagacgccag ttaagagaaa acgcagaaga catgggaggt ggatgtttca agatttacca 1500

caaatgtgat aatgcatgca ttgaatcaat aagaactggg acatatgacc attacatata 1560

caaagatgaa gcattaaaca atcgatttca gatcaaaggt gtagagttga aatcaggcta 1620

caaagattgg atactgtgga tttcattcgc catatcatgc ttcttaattt gcgttgttct 1680

attgggtttc attatgtggg cttgccaaaa aggcaacatc agatgcaaca tttgcatttg 1740

agtaaactga tagttaaaaa cacccttgtt tctactaata cgagacgata ta 1792

<210> 6

<211> 1478

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaattcagga gcaaagcagg agtttaaaat gaatccaaat caaaagataa tagcaattgg 60

atctgcatca ttggggatat taatcattaa tgtcattctc catgtagtca gcattatagt 120

aacagtactg gtcctcaata acaatagaac agatctgaac tgcaaaggga cgatcataag 180

agagtacaat gaaacagtaa gagtagaaaa acttactcaa tggtataata tcagtacaat 240

taagtacata gagagacctt caaatgaata ttacatgaac aacactgaac cactttgtga 300

ggcccaaggc tttgcaccat tttccaaaga taatggaata cgaattgggt cgagaggcca 360

tgtttttgtg ataagagaac cttttgtatc atgttcaccc tcagaatgta gaaccttttt 420

cctcacacag ggctcattac tcaatgacaa acattctaac ggcacaataa aggatcgaag 480

tccgtatagg actctgatga gtgtcaaaat agggcaatca cctaatgtat atcaagctaa 540

atttgaatcg gtggcatggt cagcaacagc atgccatgat ggaaaaaaat ggatgacagt 600

tggagtcaca gggcccgaca atcaagcaat tgcagtagtg aactatggag gtgttccggt 660

tgatattatc aattcatggg caggggatat tttaagaacc caagaatcat catgcacctg 720

cattaaagga gactgttatt gggtaatgac tgatggaccg gcaaataggc aagctaatta 780

taggatattc aaagcaaaag atggaagagt aattggacaa actgatataa gtttcaatgg 840

gggacacata gaggagtgtt cttgttaccc caatgaaggg aaggtggaat gcatatgcag 900

agacaattgg actggaacaa atagaccaat tctggtaata tcttctgatc tatcgtacac 960

agttggatat ttgtgtgctg gcattcccac tgacacccct aggggagagg atagtcaatt 1020

cacaggctca tgtacaagtc ctttgggaaa taaaggatac ggtgtcaaag gtttcgggtt 1080

tcgacaagga actgacgtat gggccggaag gacaattagt aggacttcaa gatcaggatt 1140

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