一种基于罗丹明衍生物的检测细胞内亚硝酰氢的荧光探针的制作方法

本发明涉及一种用于检测细胞内亚硝酰氢的新型罗丹明类荧光探针，属于分析化学技术领域。

背景技术：

亚硝酰氢（hno）是一氧化氮的单电子还原质子化产物，并在生物体内具有和一氧化氮截然不同的生理和药理作用。hno在正常浓度下，可在生物体内发挥重要的生理作用。例如，hno可以激发动物血管系统中电压控制的钾离子通道，能够直接与生物体系内的硫醇等抗氧化剂直接发生反应，进而调控生物体内的氧化/还原环境。hno还可增加正常及心力衰竭时心肌的收缩力，同时改善心肌的舒张功能。由于心力衰竭以心肌收缩力下降为主要特征，而目前临床仍然缺少理想的治疗药物，由此看来，hno可能是一种潜在具有治疗心肌衰竭的理想药物。此外，hno可以抑制血小板聚集，以及抑制乙醛脱氢酶。因此，实时检测生物体内的hno水平和分布，对于深入讨论hno生物药理作用具有很重要的意义。

传统的hno检测方法主要有电化学法、电子自旋共振波谱法、化学发光法和比色法等，但这些方法操作较为复杂，且很难进行实时原位检测，不适合直接用于检测生物体系内的原位检测。相比于这些方法，荧光成像法具有灵敏度高、操作简单、选择性好、非侵入性等特点，而且还能进行原位实时监控和观察。相比于单光子成像，双光子荧光成像具有近红外（650~900nm）激发、低背景干扰成像、低荧光漂白和光致毒、高横向分辨率与纵向分辨率、低生物组织吸等特点，可为生命科学研究提供了更为锐利的工具。同时，相比于蓝色和绿色荧光团，红色荧光团所发射的红色荧光具有较低能量，可以更为有效地降低生物组织吸收和自发荧光干扰。目前，所开发的双光子hno荧光探针大都具有蓝色或绿色荧光发射，而具有红色荧光发射的双光子hno荧光探针未见报道。因此开发新的具有高选择性、高灵敏度、光稳定性及透膜性好，能够实时快速检测生物体内亚硝酰氢，且具有双光子红色荧光发射的荧光探针具有重要的意义。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种新型检测细胞内hno的荧光探针及其应用。

本发明所述的新型检测细胞内hno的荧光探针为罗丹明衍生物，其特征在于：所述荧光探针的化学结构通式如式（）所示，其中三苯基膦部分为hno的响应位点：

式（）。

本发明所述的荧光探针的制备方法为：将式（ⅱ）所示的化合物(1mmol)、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（2mmol）、4-二甲氨基吡啶（2.2mmol）和二氯甲烷(5ml)加入到50ml单口烧瓶中，室温搅拌10小时，过滤，烘干。将所得固体进行柱层析纯化，得到白色的产物即为本发明所述检测细胞内hno的荧光探针。

式（ⅱ）。

本发明所述的荧光探针在检测细胞内hno的应用。

本发明所述的荧光探针可应用于细胞内hno的检测评价。该探针作为细胞内hno的特异性探针，在hno存在的环境下，基于斯陶丁格反应，可以将三苯基膦部分转化为羟基，生成具有高荧光发射能力的荧光物质，通过检测不同的荧光强度来测定细胞内的hno。

具体测定方法为：室温条件下，配制5μm荧光探针甲醇溶液，加入到具有不同浓度的hno溶液系中，测定溶液荧光强度作为hno浓度的评价指标。

本发明所述的荧光探针在hno存在的条件下，罗丹明衍生物染料部分的三苯基膦部分转化为羟基，此时该分子可以发射强烈的红色荧光（峰值约为638nm）。检测该探针加入hno时的双光子吸收截面，探讨该探针的双光子性质。采用荧光检测器实现产物的快速灵敏检测；检测条件为：激发波长为580nm，在590~700nm之间进行荧光发射光谱的检测。

荧光探针在生物成像应用研究主要内容包括该探针对活细胞的毒性、膜穿透能力、染色能力、活细胞的荧光成像。采用mtt比色法，通过分析细胞在加入荧光探针之后的存活率，讨论荧光探针对活细胞的生物毒性。在此基础上，将本发明所述的荧光探针对活细胞内的hno通过荧光成像进行快速检测。

本发明的有益效果为：

本发明所述的检测细胞内hno的荧光探针可经化学方法合成，制备工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，易于推广。

本发明所述的检测细胞内hno的荧光探针具有高特异性，在进行相应hno检测过程中基本不受其他组分的干扰，可用于活细胞内hno的实时测定，具有广阔的应用前景。

本发明所述的检测细胞内hno的荧光探针灵敏度高，具有良好的荧光发射光谱特性（590~700nm），可以实现对细胞中的hno快速准确检测的目的。

附图说明

图1是荧光探针的¹hnmr图谱；

图2是荧光探针在不同浓度hno条件下的荧光光谱；

图3是荧光探针与hno浓度的线性关系数据；

图4是荧光探针与不同物质反应后的荧光光谱；

图5是荧光探针加入hno时的双光子吸收截面；

图6是荧光探针在活细胞中的成像应用。

a图：只加10μm探针的细胞明场照片；b图：只加10μm探针的细胞红色通道荧光照片；c图：a图和b图的叠加照片；d图：只加10μm探针的双光子细胞红色通道荧光照片；e图：加入10μm探针和100μmhno的细胞明场照片；f图：加入10μm探针和100μmhno的细胞红色通道荧光照片；g图：d图和e图的叠加照片；h图：加入10μm探针和100μmhno的双光子细胞红色通道荧光照片。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明保护内容不仅限于此。

实施例1

本发明所述检测癌细胞内hno的荧光探针的制备

将式（ⅱ）所示的化合物(1mmol)、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（2mmol）、4-二甲氨基吡啶（2.2mmol）和二氯甲烷(5ml)加入到50ml单口烧瓶中，室温搅拌10小时，冷却至室温，加入到水中，过滤，烘干。将所得固体进行柱层析(二氯甲烷:甲醇=15:1)纯化，得到白色产物，即为本发明所述检测细胞内hno的荧光探针，产率33%。

上述检测细胞内hno的荧光探针的¹hnmr图谱见图1。

实施例2

本发明所述荧光探针在不同hno浓度下的荧光光谱

本专利采用hno在水溶液中供应hno。预先准备10份5ml的5μm探针缓冲溶液，含5%甲醇，所加入的hno浓度为0到100μm。然后进行荧光检测（λex=580nm）；计算各体系中荧光强度；通过分析638nm处的荧光强度与hno浓度的关系，评估该探针对hno的响应性能（见图2和图3）。图2表明，随着hno浓度的增大，溶液的荧光强度逐渐增强。图3表明，当hno浓度在0~60μm范围内，溶液的荧光强度和hno的浓度呈较好的线性关系，可采用公式y=4.34*x+7.50表示，其中y为638nm出的荧光强度，x为hno的浓度。

实施例3

荧光探针与不同物质反应后的荧光光谱

预先准备10份5ml的5μm探针缓冲溶液(含5%甲醇，ph=7.4)，然后分别向该体系中依次加入50μl浓度为200μm的hcys、no、h2o2、naclo、cys、gsh、nano2、vc等小分子的pbs溶液。然后进行荧光检测（λex=580nm）；计算各体系中荧光强度；评估该不同物质对荧光探针溶液的干扰性（见图4）。从图中看出，当然探针溶液中加入hcys、no、h2o2、naclo、cys、gsh、nano2、vc等小分子时，只有hno可以导致溶液产生显著的荧光，而加入其他小分子时溶液的荧光基本没有变化，这表示该探针只对hno有响应，而基本不受其他小分子的干扰。此外，检测探针加入hno之后的双光子吸收截面（见图5）。从图中看出，该探针可通过双光子荧光对hno进行检测。

实施例4

荧光探针在活细胞中的成像应用

将hela细胞放在培养基(dmem培养液和10%胎牛血清)中，放置于条件为37℃、5%co2和20%o2的培养箱中培养24-48h。用微量进样器吸取本发明所述荧光探针(10μm)注入含有hela细胞的培养基中，继续在培养箱中培养30min。加入100μμhno溶液，继续培养30min。之后用pbs(磷酸盐缓冲溶液)冲洗培养细胞3次，进行荧光成像。

结果见图6。从a、b、c和d图中看出，只加入探针时，细胞基本无荧光；从e、f、g和h图中看出，加入10μm和100μmhno探针，细胞有明显的红色荧光产生，这表示该探针可通过双光子成像检测细胞中的hno。