利用糖基转移酶的糖类化合物衍生物的制造方法与流程

本发明涉及一种利用糖基转移酶的糖类化合物衍生物的制造方法。

本发明还涉及由此方法而制得的衍生物。

背景技术：

氨基酚类一般是制造糖类化合物衍生物的重要中间产物，同时也在制造染料及其他药物的中间化学体时使用。此外，4-氨基苯酚在代谢过程中的容易氧化成细胞毒性物质，会引起肾脏邻近血管的多种疾病。(Lock etc., Studies on the mechanism of 4-aminophenol-induced toxicity to renal proximal tubules. Hum. Exp.Toxicol. 12(5), 383-388, 1993.)

现有技术中已对4-氨基苯酚衍生物的有机合成方法进行了一定的研究。例如，4-[2-(5-甲基)]-氨基噻唑-2，3-D-tert-丁基酚（日本专利，专利号：67023/1987）和3-甲基-4-羟基-5-n-丙烯-7-氟苯并呋喃（日本专利，专利号：53980/1987）是以2-乙氧甲酰或者2-甲酸苄酯作为诱导前体合成的。而且，上述两种化合物是制备治疗哮喘等过敏性疾病药物的有效成分。同时，2，6-二氯-4-氨基苯酚衍生物和2，6-二氯-4-（3，4，5-三甲氧基苯甲酰）氨基苯酚衍生物被认为是具有免疫活性的优良物质，并且能有效抵抗PCA（过敏反应）（日本专利 专利号：271268/1986）。另外，4-（十二烷基氨基苯酚）-2-乙二醇-6-tert-丁基酚，4-（十八烷基氨基苯酚）-2，6-D-tert-丁基酚被认为是具有良好的防止酸化的活性，同时也是有显著效果的稳定剂（日本专利 专利号：24782/1971）。

氨基酚类物质在食品、化妆品、医药品行业中有广泛的应用，然而这类物质往往具有水溶解性低，易被光或热分解或氧化生成有毒化合物质等缺点。因此，为了提高这类化合物的功能性，改善并增强其稳定性成为研究的热点。

此外，已知对苯二酚和熊果苷具有良好的美白效果，通过抑制细胞内酪氨酸酶的活性来抑制黑色素的生成，因而可改善雀斑和皮肤老化等问题。然而，这类活性物质对细胞的功能性存在一定损伤，会产生副作用。因此，本发明的目的是寻求新的合成方法制备酪氨酸酶抑制剂对苯二酚和熊果苷的衍生物，使其在细胞内能够稳定地发挥作用而避免副作用的产生。尝试的方法包括化学方法（Wang etc. A new synthesis of α-arbutin via Lewis acid catalyzed selective glycosylation of tetra-O-benzyl-α-D-glucopyranosyl trichloroacetimidate with hydroquinone, 341, 1945-1947, 2006）和酶合成方法（Sugimoto etc. Enzymatic Synthesis of α-arbutin by α-anomer-selective glucosylation of hydroquinone using lyophilized cells of xanthomonas campestris WU-9701, 93, 328-330, 2002; Sugimoto etc. Synthesis of α-arbutin-α-glycosides and their inhibitory effects on human tyrosinase, 99, 272-276, 2005）。但是，由于制备合成α-1~4结构物质的淀粉酶价格过于昂贵。

因此，需要提供一种新的技术方案来解决上述问题。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种利用糖基转移酶的糖类化合物衍生物的制造方法。

本发明还要解决的技术问题是提供一种由此方法而制得的衍生物。

为解决上述技术问题，本发明的利用糖基转移酶的糖类化合物衍生物的制造方法，包括以下步骤：在含糖浓度为0.1-1M的溶液中添加糖基转移酶，使反应釜的最终活性浓度达到0.1-3.0 U/mL后，然后在15-50℃的反应釜里添加由2-氨基酸，3-氨基酸，4-氨基酸，对苯二酚及熊果苷构成的组中所选择的至少一种的糖基受体，使最终活性浓度达到质量百分含量0.01-3%并使其反应，反应是在28-37℃下经过1-18小时而形成的，糖的葡萄糖或果糖基转移到上述的受体中最后经醋酸酸化可得到糖类化合物衍生物。注意，上述反应中糖会在15-50℃的条件下进行分解，而处于28-37℃的条件下时，在1-18小时内是不完全分解的。

进一步的，所述糖基转移酶是由葡聚糖蔗糖酶及果聚糖蔗糖酶形成族群中选择出来的。

进一步的，所述葡聚糖蔗糖酶是从肠系膜明串珠菌菌株或银耳菌丝体中获取的；将其接种到含有K₂HPO₄和糖的培养基上进行培养，经人工发酵培养后得到菌液，将上述菌液进行分离纯化，采用离子交换色谱的方式得到葡聚糖蔗糖酶。上述方法也是目前获得该酶的通用方法。

葡聚糖蔗糖酶可从肠系膜明串珠菌NRRL B-1299, NRRL B-742, NRRL B-1355, NRRL B-512, NRRL B-1149, NRRL B-1142等系列菌株中获得，但本发明选用的是肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mensenteroides) NRRL B-1299菌株。

所述果聚糖蔗糖酶是从肠系膜明串珠菌菌株中获取的。将该菌株其接种到含有K₂HPO₄和糖的培养基上进行培养，经人工发酵培养后得到菌液，将上述菌液进行分离纯化，采用离子交换色谱的方式得到果聚糖蔗糖酶。上述方法也是目前获得该酶的通用方法。

果聚糖蔗糖酶可从肠系膜明串珠菌NRRL B-512(ATCC 10830), NRRL B-1299, NRRL B-742, NRRL B-1355, NRRL B-1149, NRRL B-1142等系列菌株中获得，但本发明选用的是肠系膜明串珠菌NRRL B-512(ATCC 10830)菌株。

进一步的，糖基转移酶是果聚糖蔗糖酶时，糖的果糖基转移到上述糖的受体中；糖基转移酶是葡聚糖蔗糖酶时，糖的葡萄糖转移到上述糖的受体中。

进一步的，添加的糖基转移酶使反应釜的最终活性浓度达到0.5-2.0 U/mL。

利用糖基转移酶的糖类化合物衍生物的制造方法制得的衍生物，糖的受体是N-氨基酸时，生成N-氨基酸衍生物，N的取值2-4。

进一步的，糖基转移酶是葡聚糖蔗糖酶，上述的糖的受体是对苯二酚时，生成下述化学式Ⅳ的对苯二酚衍生物。

进一步的，糖基转移酶是果聚糖蔗糖酶，上述的糖的受体是对苯二酚时，生成下述化学式Ⅴ的对苯二酚衍生物。

进一步的，糖基转移酶是葡聚糖蔗糖酶，糖的受体是熊果苷时，生成下述化学式Ⅵ的熊果苷衍生物。

进一步的，生成的熊果苷衍生物经醋酸酸化以后可生成下述化学式Ⅹ的五乙酰熊果苷。

本发明的有益效果：本发明中选取2-氨基苯酚、3-氨基苯酚、4-氨基苯酚、对苯二酚及熊果苷等物质作为糖受体，在葡聚糖蔗糖酶以及果聚糖蔗糖酶的催化作用下，利用反应基质中扩散分布的糖，使得选取的受糖体与糖发生反应，形成新的化合物。反应所得到的衍生物，其水溶解性以及光、热稳定性均得以加强，功能性质得到改善，在食品添加剂、化妆品、医药品以及老年痴呆的治疗等方面体现了巨大的应用潜力。

附图说明

图1为蔗糖溶液中，不同种类的氨基苯酚诱导物在葡聚糖这趟作用下反应所得产物的TLC分析的物质分布结果图。

其中，S为蔗糖；F为果糖。

条带1，0.3M蔗糖+ 2-aminophenol + L. mesenteroides NRRL 1299 葡聚糖蔗糖酶；条带2，0.3M蔗糖+ 3-aminophenol + L. mesenteroides NRRL 1299 葡聚糖蔗糖酶；条带3，0.3M 蔗糖+ 4-aminophenol +L. mesenteroides NRRL 1299 葡聚糖蔗糖酶。

图2 对苯二酚在葡聚糖蔗糖酶作用下生成物质的TLC分析结果图。

其中，S为蔗糖；F为果糖。

条带1，对苯二酚；

条带2，0.3M蔗糖+缓冲液+ L. mesenteroides NRRL 1299 葡聚糖蔗糖酶；

条带3，0.3M蔗糖+对苯二酚+ L. mesenteroides NRRL 1299 葡聚糖蔗糖酶。

图3 对苯二酚在果聚糖蔗糖酶作用下生成物质的TLC分析结果图。

其中，S为蔗糖；F为果糖。

条带1，对苯二酚；条带2, 0.3M蔗糖+缓冲液+L. mesenteroides NRRL 512 果聚糖蔗糖酶；条带3, 0.3M蔗糖+对苯二酚+L. mesenteroides NRRL 512 果聚糖蔗糖酶。

图4 熊果苷在葡聚糖蔗糖酶的作用下得到产物的TLC分析结果图。

其中，S为蔗糖；F为果糖。

条带1，0.3M 蔗糖+ 缓冲溶液+ L. mesenteroides NRRL 1299葡聚糖蔗糖酶；条带2，0.3M 蔗糖 +熊果苷 + L. mesenteroides NRRL 1299 葡聚糖蔗糖酶。

图5 本反应中的熊果苷与糖类物质反应产物结果分析图。

条带1，果糖；条带2，酶反应物（无熊果苷）；条带3，酶反应物（有熊果苷）；条带4，熊果苷标准品；上述色谱分析结果用箭头标明物质。

图6a这个发明实例中得到的经提纯后的分离物质熊果苷-G1的HPLC色谱分析图谱图。

图6b这个发明实例中得到的经提纯后的分离物质熊果苷-G2的HPLC色谱分析图谱图。

具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的保护范围的限定。

下面实施例1-4是方法的实施例。

实施例1

本发明的利用糖基转移酶的糖类化合物衍生物的制造方法，包括以下步骤：在含糖浓度为0.1M的溶液中添加糖基转移酶，使反应釜的最终活性浓度达到0.1U/mL后，然后在15℃的反应釜里添加2-氨基酸，3-氨基酸，4-氨基酸，对苯二酚及熊果苷构成的组中所选择的至少一种的糖基受体，使最终活性浓度达到质量百分含量0.01-3%并使其反应，反应是在28℃下经过1小时而形成的，糖的葡萄糖或果糖基转移到上述的受体中最后经醋酸酸化可得到糖类化合物衍生物。

实施例2

利用糖基转移酶的糖类化合物衍生物的制造方法，包括以下步骤：在含糖浓度为0.3M的溶液中添加糖基转移酶，使反应釜的最终活性浓度达到0.5 U/mL后，然后在20℃的反应釜里添加由2-氨基酸，3-氨基酸，4-氨基酸，对苯二酚及熊果苷构成的组中所选择的至少一种的糖基受体，使最终活性浓度达到质量百分含量0.01-3%并使其反应，反应是在32℃下经过8小时而形成的，糖的葡萄糖或果糖基转移到上述受体中最后经醋酸酸化可得到糖类化合物衍生物。

实施例3

本发明的利用糖基转移酶的糖类化合物衍生物的制造方法，包括以下步骤：在含糖浓度为0.5M的溶液中添加糖基转移酶，使反应釜的最终活性浓度达到2.0 U/mL后，然后在25℃的反应釜里添加由2-氨基酸，3-氨基酸，4-氨基酸，对苯二酚及熊果苷构成的组中所选择的至少一种的糖基受体，使最终活性浓度达到质量百分含量0.01-3%并使其反应，反应是在34℃下经过10小时而形成的，糖的葡萄糖或果糖基转移到上述的受体中最后经醋酸酸化可得到糖类化合物衍生物。

实施例4

本发明的利用糖基转移酶的糖类化合物衍生物的制造方法，包括以下步骤：在含糖浓度为1M的溶液中添加糖基转移酶，使反应釜的最终活性浓度达到3.0 U/mL后，然后在50℃的反应釜里添加由2-氨基酸，3-氨基酸，4-氨基酸，对苯二酚及熊果苷构成的组中所选择的至少一种的糖基受体，使最终活性浓度达到质量百分含量0.01-3%并使其反应，反应是在37℃下经过18小时而形成的，糖的葡萄糖或果糖基转移到上述的受体中最后经醋酸酸化可得到糖类化合物衍生物。

糖基转移酶是由葡聚糖蔗糖酶及果聚糖蔗糖酶形成族群中选择出来的。

糖基转移酶是果聚糖蔗糖酶时，糖的果糖基转移到上述糖的受体中；糖基转移酶是葡聚糖蔗糖酶时，糖的葡萄糖转移到上述糖的受体中。

上述受糖体反应结束后所生成衍生物混合物经由凝胶渗透色谱层析柱（Gel permeation chromatography）进行初步分离，再用专用于右旋糖苷的P-2以及LH-20色度分析柱进行凝胶渗透色谱层析。然后，利用高效液相色谱(High performance Liquid Chromatography)将各受糖体的衍生物单独分离出来。接着，利用核磁共振（NMR）和间串联质谱（MALDI-TOP）等技术对各精制的糖类化合物衍生物进行结构分析。

下面实施例5-10是衍生物的实施例。

本发明的利用糖基转移酶的糖类化合物衍生物的制造方法制得的衍生物，糖的受体是N-氨基酸时，生成N-氨基酸衍生物，N的取值2-4。

葡聚糖蔗糖酶的酶反应液中，除了糖类物质以外，还添加了其它化合物。溶液中添加的蔗糖作为底物在酶的作用下，产生带羟基的葡萄糖游离分子。此时，再向反应液中添加选取的受糖体，受糖体在糖基转移酶的作用下发生糖基转移反应。在这个反应中，酶的种类不同，转移到受糖体上的糖基种类也不同，与此同时，酶和受糖体的物质浓度配比不同也会影响反应产物的种类。

实施例5

糖的受体是2-氨基酸时，生成化学式Ⅰ的2-氨基酸衍生物。

[化学式Ⅰ]

2-氨基苯酚-O-α-D-低聚异麦芽糖

（2-Aminophenol-O-α-D-isomaltooligosaccharide）

（上式 n取0-5）

实施例6

糖的受体是3-氨基酸时，生成化学式Ⅱ的3-氨基酸衍生物。

[化学式Ⅱ]

3-氨基苯酚-O-α-D-低聚异麦芽糖

（3-Aminophenol-O-α-D-isomaltooligosaccharide）

（上式 n取0-5）

实施例7

糖的受体是4-氨基酸时，生成化学式Ⅲ的4-氨基酸衍生物。[化学式Ⅲ]

4-氨基苯酚-O-α-D-低聚异麦芽糖

（4-Aminophenol-O-α-D-isomaltooligosaccharide）

（上式 n取0-5）

实施例8

糖基转移酶是葡聚糖蔗糖酶，上述的糖的受体是对苯二酚时，生成下述化学式Ⅳ的对苯二酚衍生物。

[化学式Ⅳ]

对苯二酚-O-α-D-低聚异麦芽糖

(Hydroquinone-O-α-D-isomaltooligosaccharide)

（上式 n取0-5）

实施例9

糖基转移酶是果聚糖蔗糖酶，上述的糖的受体是对苯二酚时，生成下述化学式Ⅴ的对苯二酚衍生物。

[化学式Ⅴ]

对苯二酚-O-α-D-低果聚糖

(Hydroquinone-O-α-D-fructooligosaccharide)

（上式 n取0-5）

实施例10

糖基转移酶是葡聚糖蔗糖酶，糖的受体是熊果苷时，生成下述化学式Ⅵ的熊果苷衍生物。

[化学式Ⅵ]

熊果苷-O-α-D-低聚异麦芽糖

(Arbutin-O-α-D-isomaltooligosaccharide)

（上式 n取0-5）

即当受糖体为2-氨基苯酚，则2-氨基苯酚在葡聚糖蔗糖酶的作用下，结合多个葡萄糖，生成2-氨基苯酚-O-α-D-低聚异麦芽糖（化学式Ⅰ）；当受糖体为3-氨基苯酚，则3-氨基苯酚(m-aminophenol)在葡聚糖蔗糖酶的作用下，结合多个葡萄糖，生成3-氨基苯酚-O-α-D-低聚异麦芽糖（化学式Ⅱ）；当受糖体为4-氨基苯酚，则4-氨基苯酚在葡聚糖蔗糖酶的作用下，结合多个葡萄糖，生成4-氨基苯酚-O-α-D-低聚异麦芽糖（化学式Ⅲ）。另外，对苯二酚在葡聚糖蔗糖酶的作用下，结合多个葡萄糖，生成对苯二酚-O-α-D-低聚异麦芽糖（化学式Ⅳ）；而对苯二酚在果聚糖蔗糖酶的作用下，结合多个果糖，生成对苯二酚-O-α-D-低果聚糖（化学式Ⅴ）。当受糖体为熊果苷，则熊果苷会在葡聚糖蔗糖酶的作用下生成熊果苷-O-α-D-低聚异麦芽糖（化学式Ⅵ）。

区别在于，当选取的受糖体生成如化学式Ⅰ~Ⅵ中的糖类化合物衍生物，根据n值在2~5的取值不同，认为产生的糖类化合物衍生物的种类也不同。

这些经转糖基作用生成的氨基酚类衍生物，其水溶解性得以提高，且具有耐光、耐热分解的作用，能够有效地防止光分解和热分解。例如，就氨基苯酚而言，当其在光照或受热条件下容易发生分解或出现褐变现象。本发明所得到的氨基苯酚衍生物的溶解性好，对光、对热稳定性好。故可用于食品添加剂、化妆品、医药品以及老年痴呆症药物研究。此外，用上述糖类化合物衍生物所制备的功能性物质有助于改善生物的代谢途径。本发明所得到的糖基化合物衍生物在食品、化妆品、医药品及老年痴呆型药物中的使用含量限定在总重的0.001~10%之间。

葡聚糖蔗糖酶是从肠系膜明串珠菌菌株或银耳菌丝体中获取的；将其接种到含有K₂HPO₄和糖的培养基上进行培养，经人工发酵培养后得到菌液，将上述菌液进行分离纯化，采用离子交换色谱的方式得到葡聚糖蔗糖酶。上述方法也是目前获得该酶的通用方法。

葡聚糖蔗糖酶可从肠系膜明串珠菌NRRL B-1299, NRRL B-742, NRRL B-1355, NRRL B-512, NRRL B-1149, NRRL B-1142等系列菌株中获得，但本发明选用的是肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mensenteroides) NRRL B-1299菌株。

（一）酶液的制备：

例如1：将L.mesenteroides NRRL B-1299接种到1L含有5g酵母提取物、5g胨、20gK₂HPO₄、20g蔗糖的LB培养基，并在28℃下进行发酵培养。从上述培养液中分理出含有葡聚糖蔗糖酶的酶液，提纯后备用。酶的纯化采用DEAE琼脂糖凝胶（DEAE-Sepharose）进行，用浓度为20mM的缓冲液（pH 6.8）提前冲洗滤柱，使柱内压力平衡。然后将用约3倍的缓冲溶液作为流动相，带动酶液进入液相装置中，除去不需要的蛋白质杂质。类似的操作，用准备好的相同缓冲液配置的0~1M浓度的NaCl溶液吸附需要分离得到的酶。用缓冲液反复洗涤粗提取的葡聚糖蔗糖酶液三次，得到精制的葡聚糖蔗糖酶。

果聚糖蔗糖酶是从肠系膜明串珠菌菌株中获取的。将该菌株其接种到含有K₂HPO₄和糖的培养基上进行培养，经人工发酵培养后得到菌液，将上述菌液进行分离纯化，采用离子交换色谱的方式得到果聚糖蔗糖酶。上述方法也是目前获得该酶的通用方法。

果聚糖蔗糖酶可从肠系膜明串珠菌NRRL B-512(ATCC 10830), NRRL B-1299, NRRL B-742, NRRL B-1355, NRRL B-1149, NRRL B-1142等系列菌株中获得，但本发明选用的是肠系膜明串珠菌NRRL B-512(ATCC 10830)菌株。

例如2：将L.mesenteroides NRRL B-512 LWG型葡聚糖蔗糖酶按照0.3%（w/v）的固液比接种到液体培养基里，培养基中还含有胨、0.3%（w/v）K₂HPO₄和矿物质溶液(2% MgSO₄·7H₂O、0.1%NaCl、 0.1%Fe SO₄·7H₂O、0.1% MnSO₄·H₂O,、0.13% CaCl₂·2H₂O、2% (w/v)葡萄糖）培养12-16小时，OD600值为3.0。培养结束后，用DEAE琼脂糖凝胶柱（DEAE-Sepharose）（规格为2.5×35cm）或CM-Sepharose（2.5×35cm）来分离提纯果聚糖蔗糖酶。

（二）酶的反应过程

例1中的葡聚糖蔗糖酶是在浓度为0.3M的糖溶液中合成新的糖类化合物衍生物的。

当氨基苯酚类物质的反应在葡聚糖蔗糖酶的作用下进行，其中葡聚糖蔗糖酶、浓度为0.3M的蔗糖溶液以及0.5%的氨基苯酚物质以1：1：1（v/v/v）的比例添加，且在反应器中充分混匀后于28℃下进行反应。反应要保证28℃的条件下，在糖完全消耗之前（约3个小时）进行。

对苯二酚的反应条件是，葡聚糖蔗糖酶/果聚糖蔗糖酶、浓度为0.3M的蔗糖溶液以及1%对苯二酚按照1：1：1（v/v/v）的比例进行，将反应物充分混匀后在28℃条件下进行反应。反应务必保证在糖完全消耗之前（约3小时）进行。熊果苷的反应条件是葡聚糖蔗糖酶、浓度为0.3M的蔗糖溶液以及0.5%的受糖体以1：1：1（v/v/v）的比例添加，充分混匀后于28℃下进行反应。反应务必保证在糖完全消耗之前（约3小时）进行。熊果苷的合成反应条件是在20mM浓度的醋酸钠缓冲液（pH 5.2 60ml）、12.25mM浓度的熊果苷、100mM浓度的糖溶液，还有2U/ml B-1299葡聚糖蔗糖酶，最终反应在28℃下进行到糖被耗尽之前，对反应液煮沸8分钟，以灭酶活。

当反应物氨基苯酚在葡聚糖蔗糖酶作用下反应结束时，葡聚糖蔗糖酶的活性为1U/ml。1U是指酶在1min内分解1ml果糖溶液的μmol数。运用下述方法鉴别酶作用生成糖类化合物衍生物的反应是否结束。取1μl生成物，用Merck K6F TLC薄层色谱法进行分析鉴定：取硝基甲烷：丙醇：水=2：5：1.5（v/v/v）的混合溶液或者乙腈：水=85：15（v/v）的混合液与1μl生成物在点滴板中混合，然后展开实验，观察反应情况。反应一会后，采用HPTLC(High pressure thin layer chromatograph)薄层色谱法鉴定分离物质，此鉴定方法中所用的显色剂含有0.5%（w/v）的α-萘酚和5%（v/v）的H₂SO₄。

（三）反应产物的结构确定

利用HPLC、NMR以及MALDI-TOP等分析方法来确定上述过程生成的产品的分子结构。反应产物用Bio Gel P-2柱来进行精制，将样品溶液注入柱中，通过TLC来确认流出的分离物。分离得到的目标物质经真空浓缩后，再次用TLC来确认成分。总之，合成产品的成分组成由TLC、NMR、MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted LaserDesorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometer)等来加以确定鉴别，反应的结果如图1~4所显示的。

从Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299菌株中得到的葡聚糖蔗糖酶作用于不同氨基苯酚受糖体分别得到以下氨基苯酚衍生物：2-氨基苯酚-O-α-D-低聚异麦芽糖（图1-P1）、3-氨基苯酚-O-α-D-低聚异麦芽糖（图1-P2）以及4-氨基苯酚-O-α-D-低聚异麦芽糖（图1-P3）。对苯二酚经葡聚糖蔗糖酶作用得到产物如图2所示，所得衍生物对苯二酚-O-α-D-低聚异麦芽糖 （图2-P4），对苯二酚经果聚蔗糖酶作用得到产物如图3所示，所得衍生物对苯二酚-O-α-D-低果聚糖（图3-P5）。另外，熊果苷在葡聚糖蔗糖酶的作用下得到产物如图4所示，产物为熊果苷的衍生物熊果苷-O-α-D-低聚异麦芽糖（图4-P6、P7）。

另一方面，各分离样品在47℃下经蒸发器浓缩，再利用HPLC进行各成分的纯度确定。此时使用的分析柱为hypersil APS-2 NH₂型（4.6×250mm Bio-Rad），流动相是体积比为4：1或3：1的乙腈/甲醇溶液，流动速率为0.5ml/min。在室温条件下，利用RI检波器对HPLC纯化得到的样品进行色谱图分析，如图5所示。经生物凝胶P-2色度分离得到的熊果苷经HPLC分析后确认含有G1物质和G2物质，且两种物质分别占原样品的23.8%和3.3%。 精制后的各样品的分子量由MALDI-TOF-MS进行分析。将制备得到的熊果苷衍生物（3mg/ml）用去离子水稀释，然后与2，5-二羟-苯甲酸（1mg/ml）混合，将混合好的溶液按1：1的比例溶入有机试剂乙腈中，取最终的混合液1μl滴入不锈钢容器中，在室温下缓慢干燥。利用MALDI-TOF-MS(Voyager DE-STR; Appled Bio Systems, USA)进行正像模式的质谱分析，此时附加65KV的电压加快分析速度。取精制的熊果苷衍生物2~3mg，溶解于250μl的重水（D₂O）中，通入NMR（直径 3mm）管中，使用Unity Inova 500 spectrometer(Varian Inc., USA)进行分析。在500 MHz的电压用¹H核磁共振，在125 MHz下用¹³C核磁共振进行分析。结果如下表1所示。

[表1]

熊果苷及熊果苷衍生物的¹³C和¹H核磁共振成像数据(单位：ppm)

熊果苷-G1物质

熊果苷-G1分子的m/z（质荷比）是457。从表1中我们可以看到，在4.89ppm(J=7.0Hz)观察到熊果苷芳香族物质中的以β结合方式结合的葡萄糖的异头构型信号。用HMBC（异核多键相关谱）确定了4.83ppm(J=3.5Hz)信号处的以α方式结合的葡萄糖分子。熊果苷衍生物的熊果苷信号是利用熊果苷分子结构上的碳来确定的（化学式Ⅶ）。和其他位置的碳相比，除了65.55ppm处的C-6’以外，其它的δ₁-δ的值都为负的。上述差异是因为2.15ppm处的C-6’与葡萄糖分子发生结合，从而带来了变化。利用HMBC也确认了，在65.55ppm处的葡萄糖的H-1’’与熊果苷C-6’之间发生耦合作用，以此确认熊果苷-G1结构含有4-羟基苯酰和β-异麦芽糖结构（化学式Ⅷ）。

[化学式Ⅶ]

[化学式Ⅷ]

熊果苷-G2物质

熊果苷-G2分子的m/z（质荷比）是610。从表1可以看出，在4.94ppm(J=7.0Hz)观察到熊果苷芳香族物质中的以β结合方式结合的葡萄糖的异头构型信号，同样，用HMBC也可以得到相同的结论。在4.86ppm(J=3.5Hz)处和4.81ppm(J=3.5Hz)处可看到有两个葡萄糖分子结合在熊果苷上。表1中66.83ppm处的C-6’和64.29ppm处的C-6”分别对应2.43ppm和4.97ppm。葡萄糖基与熊果苷中的C-6’相结合，而葡萄糖与熊果苷中的C-6”相结合。利用HMBC也确认了，在65.83ppm处的葡萄糖的H-1”与熊果苷C-6’之间发生耦合作用，而在65.20ppm处熊果苷的C-6”与葡萄糖H-1”’发生结合。以此确认熊果苷-G1结构含有4-羟基苯酰和β-低聚葡萄糖结构。

[化学式Ⅸ]

最后生成的熊果苷衍生物经醋酸酸化以后可生成下述化学式Ⅹ的五乙酰熊果苷。

[化学式Ⅹ]

五乙酰熊果苷。