一种锰超氧化物歧化酶基因Mn‑SOD及其应用的制作方法

本发明涉及dna重组技术领域,特别涉及一种锰超氧化物歧化酶基因mn-sod,还涉及所述锰超氧化物歧化酶基因mn-sod的应用。

背景技术：

活性氧自由基(reactiveoxygenspecies,ros)是细胞代谢过程中必然产生的一种氧化物，具有高度的化学活性,许多疾病、生命的衰老都涉及到活性氧自由基反应，当体内自由基过多时,它们会导致膜脂过氧化、碱基突变、链的断裂和蛋白质的损伤等。

超氧化物歧化酶(superoxidedismutase)是一类重要的氧自由基清除剂，通过催化超氧阴离子自由基(o^2-)发生歧化反应，减轻或者消除超氧阴离子对机体的氧化或过氧化损害，具有防御氧毒性、增强机体抗辐射损伤能力、防衰老以及治疗某些肿瘤、炎症、自身免疫疾病等功效，广受国内外科研工作者的关注和重视。mc-cord和fridovich在1969年发现该酶以来，人们已经从多种动植物和微生物中分离得到此酶。目前，随着对逆境微生物群的研究发展，在极端环境中生存的微生物群中分离得到的sod酶因其在适应特殊环境方面具有不可比拟的优越性和实用性，逐渐成为sod研究的新热点，无论基础研究还是应用研究，研究状况十分活跃。

mn-sod是生物体内重要的氧自由基清除剂。在正常状态下，线粒体电子传递链是超氧化物的主要来源，大约5％的o2分子转变为超氧化物，由于mn-sod定位于线粒体，在保护线粒体免受有氧代谢产生的超氧阴离子损伤中发挥重要作用，因此被认为是抵御氧化压力的第一线，mn-sod是最有效的具有抗肿瘤活性的抗氧化酶之一，引起国内外生物界和医学界的广大重视。

由于高温生物工程环境限制了mn-sod的应用，所以人们加强了对酶热稳定性的研究。希望可以通过提高酶作用温度以增加酶热稳定性，从而提高酶作用效率，以达到降低工业生产成本的目的。目前，开发耐热型mn-sod的研究主要包括从自然界中嗜热微生物菌株筛选和利用蛋白质工程技术等对酶分子进行定向改造，相对于筛菌技术的盲目性，后者具有更强的针对性，受到国内外学者的青睐。

随着基因工程技术、生物信息学等的快速发展，为分子生物学的研究开辟了新的道路。cn104450632a公开了一组可提高sod耐热温度和热稳定性的氨基酸序列及其应用，它是一组来源于geobacillus属的13个特殊嗜热fe/mn-sod的n端氨基酸序列。这组氨基酸序列具有以下特征：1)位于fe/mn-sod蛋白的soda功能域之前，序列长度为101-344个氨基酸，功能未知；2)其相互之间具有85-100％的同源性；3)均包含1或2个特殊的共有重复序列geo-n-repeat。这组氨基酸序列对geobacillus属的fe/mn-sod的耐热温度和热稳定性具有决定性作用，可广泛应用于其它sod(特别是常温sod)的改造，显著提高其耐热温度和热稳定性。但由于其插入氨基酸序列过大可能会影响后续蛋白的表达纯化等过程，且由于要插入特定氨基酸序列会使实验过程更为复杂。

技术实现要素：

为了解决以上现有技术中mn-sod热稳定性的问题，本申请提供了一种最适反应温度较高，60℃下的半衰期较长的锰超氧化物歧化酶基因mn-sod^{v140l，e155w，e215w}。本技术是通过对酶分子进行定向改造以提高热稳定性，改造后的酶分子其热稳定性有了明显提高，且过程简单操作方便，有较大的工业化生产和应用潜力以及经济价值。

本发明还提供了所述的锰超氧化物歧化酶基因mn-sod^{v140l，e155w，e215w}的载体的构建方法。

本发明还提供了所述的锰超氧化物歧化酶基因mn-sod^{v140l，e155w，e215w}在氧自由基清除中的应用。

本发明是通过以下步骤得到的：

一种锰超氧化物歧化酶基因mn-sod^{v140l,e155w,e215w}，根据humanmn-sod的三维结构(2adq)为模板模拟得到mousemn-sod三维结构，通过设计突变val140leu,glu155trp,glu215trp得到突变型mn-sod^{v140l，e155w，e215w}，核苷酸序列如序列表中序列1所示。共突变三个氨基酸，六个碱基突变位点。将第418位碱基g突变为c；将463位碱基g突变为t，将第464位碱基a分别g；将第643位碱基g突变为t，将第644位碱基a突变为g，将第645位碱基a突变为g。

所述的锰超氧化物歧化酶基因mn-sod^{v140l，e155w，e215w}，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。将第140位氨基酸val突变为leu，第155位氨基酸glu突变为trp，第215位氨基酸glu突变为trp。

所述的锰超氧化物歧化酶基因mn-sod^{v140l，e155w，e215w}，优选其最适反应温度为39℃，60℃下的半衰期120min。

所述的锰超氧化物歧化酶基因mn-sod^{v140l，e155w，e215w}的载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)设计突变引物，核苷酸序列如下：

sod2-f:5’-cgcggatccatgttgtgtcgggcggcgt-3’，

sod2-r:5’-acgcgtcgacgtggccgtgagtgaggtt-3’，

t140-f:5’-ctgacagccgtgtctctgggagtccaaggt-3’，

t140-r:5’-accttggactcccagagacacggctgtcag-3’，

t155-f:5’-ggcttcaataagtggcaaggtcgcttac-3’，

t155-r:5’-gtaagcgaccttgccacttattgaagcc-3’，

t215-r:5’

-acgcgtcgactcacttcttgcaagctgtgtatctccaagtaacattctcccagttga-3’，(2)以小鼠血液rna为模板，以sod2-f，sod2-r为引物rt-pcr获得小鼠mn-sod基因，将其插入到表达载体pgex-6p-1的多克隆位点，酶切位点为bamhi、sali，构建得到重组表达质粒mn-sod-pgex-6p-1；

(3)以构建成功的重组质粒mn-sod-pgex-6p-1为模板，以sod2-f、t140-r为引物进行第一轮pcr，经切胶回收后获得基因片段mn-sod^1-140；以t140-f、sod2-r为引物进行第二轮pcr，经切胶回收后获得基因片段mn-sod^141-222；以sod2-f、sod2-r为引物，前两轮pcr产物为模板进行第三轮pcr，获得单点突变型mn-sod^val140leu基因，将其插入到表达载体pgex-6p-1的多克隆位点，酶切位点为bamhi、sali，构建单点突变型重组表达质粒mut-mn-sod-pgex-6p-1^val140leu；

(4)以构建成功的单点突变型重组质粒mn-sod-pgex-6p-1^val140leu为模板，以sod2-f、t155-r为引物进行第一轮pcr，经切胶回收后获得基因片段mut-mn-sod^1-155；以t155-f、sod2-r为引物进行第二轮pcr，经切胶回收后获得基因片段mut-mn-sod^156-222；以sod2-f、sod2-r为引物，前两轮pcr产物为模板进行第三轮pcr，获得双点突变型mut-mn-sod^{val140leu，glu155trp}，将其插入到表达载体pgex-6p-1的多克隆位点，酶切位点为bamhi、sali，构建双点突变型重组表达质粒mut-mn-sod-pgex-6p-1^{val140leu，glu155trp}；

(5)以sod2-f、t215-r为引物，重组质粒mut-mn-sod-pgex-6p-1^{val140leu，glu155trp}为模板进行pcr，pcr产物连接到表达载体pgex-6p-1，pcr产物即为锰超氧化物歧化酶基因mn-sod^{v140l，e155w，e215w}。

所述的锰超氧化物歧化酶基因mn-sod^{v140l，e155w，e215w}在氧自由基清除中的应用。

本发明的有益效果：

1、本发明提供了一种新型简便的通过氨基酸突变提高mn-sod热稳定性的方法，改造后得到的突变mn-sod^{v140l，e155w，e215w}，其热稳定性有了明显提高，有较大的工业化生产和应用潜力以及经济价值，也为其它sod酶的研究奠定了基础；

2、通过运用大规模高性能的计算机及其相关软件，结合基因工程手段，利用模拟试验对酶分子进行定向改造以提高热稳定性，从而扩大mn-sod的应用面。

附图说明

图1突变后mn-sod三维结构图，

图2ramachandranplot模型评估拉氏图，

图3profile-3d图，

图4分子动力学分析结果(rmsd)，

图5分子动力学分析结果(rmsf)，

图6分子动力学分析结果(potentialenergy)。

具体实施方式

以下结合具体实例，进一步阐明本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。

实施例1氨基酸突变位点的选定

同源建模：从ncbi网站获取人源mn-sod(2adq)的氨基酸序列，并以此为模板，使用ds4.0软件集成的modeller同源建模软件模块构建小鼠mn-sod的三维结构，获得20种目标结构模型，分别使用ramanchandranplot和profile-3d对各模型进行评估。

建模的基本步骤如下：

(1)模板搜索：使用序列相似性搜索工具blast搜索目标序列的模板，发现人源mn-sod(2adq)的氨基酸序列与目标氨基酸序列相似性达93.9％(除去n端信号肽氨基酸序列)，因此使用人源mn-sod氨基酸序列构建小鼠mn-sod三维结构模型。

(2)序列比对：使用序列比对(aligningsequence)方法，将目标序列直接比对至模板序列。

(3)结构比对：通过结构比对先将模板结构叠合，在通过sequence同sequenceprofile的比对将目标序列比对至比对好的模板序列。

(4)建立模型：使用dsmodeller模块，构建目标序列的模型。打开ds4.0，在工具浏览器(toolsexplorer)中，展开macromolecules→createhomologymodels，点击buildhomologymodels，打开buildhomologymodels对话框。点击inputsequencealignment右边的栅格，下拉列表中选取模板。将numberofmodels设为20，点击optimizationlevel右边的栅格，下拉列表中选取high，点击run运行程序。

建模结束后，根据pdf值或者dope值挑选最优模型。在打开的report窗口中，summary一栏综述了所构建模型的打分。模型的排名依据是pdftotalenergy。建模过程中，dsmodeler首先会提取模板(template)的几何特性，然后使用pdf(probabilitydensityfunction)函数来定义蛋白结构中诸如键长、键角、二面角等几何特性。接着它会对pdf函数施加一定的约束条件，并以此来构建target的3d结构。所以pdf的函数值可以直接反应所构建模型的好坏。一般，模型的pdftotalenergy越低，表明该模型在同源约束条件下优化的越好；模型同限定的同源约束条件偏差越小，该模型的可信度越大。然而，如果构建的模型其pdftotalenergy相似，则可以利用基于原子统计势能的dopescore作为衡量模型质量的依据。dope是一个基于原子统计势能的程序，主要用于模型评估。它的分数可以认为是衡量同一分子不同构象可信度的标准，能够帮助选择预测结构的最优模型。分数越低，模型质量越可靠。

表1同源建模结果

模型评估：使用ramanchandranplot和profile-3d对所建模型进行评估。

ramachandranplot用于阐述蛋白质或肽立体结构中肽键内α碳原子和羰基碳原子间的键的旋转度(psi)对α碳原子和氮原子间的键的旋转度(phi)，主要用来指明蛋白质或肽类中氨基酸的允许和不允许的构象。从主菜单中，选取chart→ramachandranplot，显示所构建模型的拉氏图，结果如图2。

profile-3d是ucla的davideisenberg教授开发的一种基于“穿线”(threading)法的模型评估程序。该方法采用3d-1d的打分函数来检测所构建模型与自身氨基酸序列的匹配度关系。分数越高，说明同源模型的可信度越大。在工具浏览器(toolsexplorer)中，展开macromolecules→createhomologymodels，点击verifyprotein(profile-3d)打开verifyprotein(profile-3d)对话框。点击inputproteinmolecules右边的栅格，选择模型，点击run运行程序，结果如图3。

虚拟氨基酸突变(calculatemutationenergy(stability))

对所构建的三维结构模型进行基于氨基酸稳定性的虚拟突变以确定待突变位点。打开sample→tutorial→proteinmodeling中的mousemn-sod.pdb，分子窗口中显示目的蛋白的三维结构。通过simulation→changeforcefield→applyforcefield为蛋白结构赋上charmm力场。点击protocols→macromolecules→proteindesign→calculatemutationenergy(stability)，运行程序。

表2预测稳定突变

对待突变位点进行分子动力学(moleculardynamics)分析

对待突变位点进行10ns的分子动力学分析，以确定能增加目的蛋白稳定性的最佳突变组合。启动dsclient，分别载入以上各突变模型的三维结构，使用prepareprotein模块对各模型进行初始化准备后，应用charmm力场。protocolexplorer中双击simulations文件夹下standarddynamicscascade流程，该流程在参数浏览器(parametersexplorer)中打开，minimization中maxsteps设置为5000；heating中simulationtime(ps)设置为10，timestep(fs)设置为1，targettemperature设置为310；equilibration中timestep(fs)设置为1，targettemperature设置为310；production中simulationtime(ps)设置为10000，timestep(fs)设置为1，targettemperature设置为310；implicitsolventmodel设置为distancedependentdielectrics；electrostatics设置为sphericalcutoff；advenced中applyshakeconstraint设置为true；numberofprocessors设置为4，以上模拟过程均在等温等压(constantnumber(n)，volume(v)，temperature(t)，npt)系综下进行，点击run运行程序。

待程序运行结束后，进行分子动力学轨迹分析。在流程浏览器(protocolexplorer)中展开simulation→analyze文件夹，双击analyzetrajectory流程，该流程在参数浏览器((parametersexplorer)中打开，analyzetype设置为rmsd、rmsf，atomgroup及atomgrouptofit设置为backbone，运行程序，rmsd、rmsf、potentialenergy结果分别如图4、5、6。

实施例2突变基因mn-sod^{v140l，e155w，e215w}的获得及及其表达质粒的构建

氨基酸突变位点的选定：以humanmn-sod的三维结构(2adq)为模板，用discoverystudio4.0软件homologymodeling模块构建了小鼠mn-sod三维结构模型，使用ramanchandranplot和profile-3d对模拟出的三维结构进行分析；利用calculatemutationenergy(stability)模块对模拟出的三维结构进行分析确定能提高目的蛋白稳定性的最适突变位点，并利用moleculardynamics对改造前后的三维结构进行动力学模拟，最终确定氨基酸突变位点；

突变基因mn-sod^{v140l,e155w，e215w}及其表达质粒的构建：据ncbimousemn-sod(genebank登录号：nm_013671.3)中核苷酸序列及突变位点特点设计突变引物sod2-f,sod2-r,t140-f,t140-r,t155-f,t155-r,t215-r：

sod2-f:cgcggatccatgttgtgtcgggcggcgt(bamhi)

sod2-r:acgcgtcgacgtggccgtgagtgaggtt(sali)

t140-f:ctgacagccgtgtctctgggagtccaaggt

t140-r:accttggactcccagagacacggctgtcag

t155-f:ggcttcaataagtggcaaggtcgcttac

t155-r:gtaagcgaccttgccacttattgaagcc

t215-r:acgcgtcgactcacttcttgcaagctgtgtatctccaag

taacattctcccagttga(sali)

以昆明小鼠(km小鼠)血液rna为模板，以sod2-f，sod2-r为引物rt-pcr(95℃5min；1个循环，95℃30s，58℃30s，72℃1min；30个循环，72℃10min；4℃保存)，获得小鼠mn-sod基因，pcr扩增了一条长约650bp左右的基因片段，1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并将其插入到表达载体pgex-6p-1的多克隆位点(酶切位点为bamhi、sali)，构建重组表达质粒mn-sod-pgex-6p-1，转化escherichiacoildh5α感受态细胞，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。

采用overlappcr技术构建突变基因，以测序成功的重组质粒mn-sod-pgex-6p-1为模板，以sod2-f、t140-r为引物进行第一轮pcr(95℃5min；1个循环，95℃30s，58℃30s，72℃1min；30个循环，72℃10min；4℃保存)，经切胶回收后获得基因片段mn-sod^1-140；以t140-f、sod2-r为引物进行第二轮pcr(95℃5min；1个循环，95℃30s，58℃30s，72℃1min；30个循环，72℃10min；4℃保存)，经切胶回收后获得基因片段mn-sod^141-222；以sod2-f、sod2-r为引物，前两轮pcr产物为模板进行第三轮pcr(95℃5min；1个循环，95℃30s，58℃30s，72℃1min；30个循环，72℃10min；4℃保存)，获得单点突变型mn-sod^val140leu基因，1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带将其插入到表达载体pgex-6p-1的多克隆位点，酶切位点为bamhi、sali)，构建单点突变型重组表达质粒mut-mn-sod-pgex-6p-1^val140leu，转化escherichiacoildh5α感受态细胞，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。

以构建成功的单点突变型重组质粒mn-sod-pgex-6p-1^val140leu为模板，以sod2-f、t155-r为引物进行第一轮pcr，经切胶回收后获得基因片段mut-mn-sod^1-155；以t155-f、sod2-r为引物进行第二轮pcr，经切胶回收后获得基因片段mut-mn-sod^156-222；以sod2-f、sod2-r为引物，前两轮pcr产物为模板进行第三轮pcr，获得双点突变型mut-mn-sod^{val140leu，glu155trp}基因，将其插入到表达载体pgex-6p-1的多克隆位点，酶切位点为bamhi、sali，构建双点突变型重组表达质粒mut-mn-sod-pgex-6p-1^{val140leu，glu155trp}；

以sod2-f、t215-r为引物，mut-mn-sod-pgex-6p-1^{val140leu，glu155trp}为模板进行pcr，pcr产物连接到表达载体pgex-6p-1，经转化测序后将215位氨基酸glu突变成trp。

将以上测序成功的重组质粒转化表达宿主菌escherichiacoilbl21(de3)感受态细胞。

重组子mn-sod^{v140l，e155w，e215w}的表达及酶学特性的测定：将成功转入escherichiacoilbl21(de3)感受态细胞的突变型重组mn-sod经终浓度为0.05mmol/l的iptg20℃诱导12h，离心上清液经蛋白层析仪纯化后经sds-page检测为单一条带，该重组mn-sod最适反应温度为39.5℃，较原酶提高了2.5℃，60℃下的半衰期达120min。

邻苯三酚法测突变mn-sod的活力：在25℃，4.5ml50mmol/l，ph8.2tris-hcl缓冲液中加入样品和10μll50mmol/l的邻苯三酚，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯，325nm波长下每隔30s测od值一次，共测4分钟，邻苯三酚自氧化速率控制在0.070od/min左右。测得数据按下列公式计算酶活性：

酶活性＝250±22u/ml。

实施例3

对纯化出的突变及未突变蛋白进行温度稳定性的比较。突变前后的蛋白，分别在37℃，55℃水浴保温一定时间后测酶活，稳定性都提高5-10倍(表3)。

表3突变-sod和sod的热稳定性(ph7.0,37℃,55℃)

突变前后耐酸碱性和胃胰蛋白酶耐受性也显著提高，结果见下表4、5、6、7。

表4突变-sod和sod的耐酸性(ph5.20,25℃)

表5突变-sod和sod的耐碱性(ph10.80,25℃)

表4、5结果表明，sod经突变后，其耐酸碱性能明显提高。

表6突变-sod和sod对胃蛋白酶耐受性(ph1.34，25℃)

表7突变-sod和sod对胰蛋白酶耐受性(ph7.84，25℃)

表6、7结果表明，sod经突变后，对蛋白酶和胰蛋白酶耐受性明显提高。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110>曲阜师范大学

<120>一种锰超氧化物歧化酶基因mn-sod及其应用

<160>9

<210>1

<211>669

<212>dna

<213>小鼠（musmuscculus）

<400>1

atgttgtgtcgggcggcgtgcagcacgggcaggaggctgggccctgtggccggtgccgcg60

ggctcccggcacaagcacagcctcccagacctgccttacgactatggcgcgctggagcca120

cacattaacgcgcagatcatgcagctgcaccacagcaagcaccacgcggcctacgtgaac180

aatctcaacgccaccgaggagaagtaccacgaggctctggccaagggagatgttacaact240

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ttctggacaaacctgagccctaagggtggtggagaacccaaaggagagttgctggaggct360

atcaagcgtgactttgggtcttttgagaagtttaaggagaagctgacagccgtgtctctg420

ggagtccaaggttcaggctggggctggcttggcttcaataagtggcaaggtcgcttacag480

attgctgcctgctctaatcaggacccattgcaaggaacaacaggccttattccgctgctg540

gggattgacgtgtgggagcacgcttactaccttcagtataaaaacgtcagacctgactat600

ctgaaagctatttggaatgtaatcaactgggagaatgttacttggaggtacacagcttgc660

aagaagtag669

<210>2

<211>223

<212>prt

<213>小鼠（musmuscculus）

<400>2

metleucysargalaalacysserthrglyargargleuglyprovalalaglyalaala

5101520

glyserarghislyshisserleuproaspleuprotyrasptyrglyalaleuglupro

25303540

hisileasnalaglnilemetglnleuhishisserlyshishisalaalatyrvalasn

45505560

asnleuasnalathrgluglulystyrhisglualaleualalysglyaspvalthrthr

65707580

glnvalalaleuglnproalaleulyspheasnglyglyglyhisileasnhisthrile

859095100

phetrpthrasnleuserprolysglyglyglygluprolysglygluleuleugluala

105110115120

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125130135140

glyvalglnglyserglytrpglytrpleuglypheasnlystrpglnglyargleugln

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165170175180

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185190195200

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205210215220

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223

<210>3

<211>28

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<213>人工序列

<400>3

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<213>人工序列

<400>9

acgcgtcgactcacttcttgcaagctgtgtatctccaagtaacattctcccagttga57