一种烟草抗低温胁迫诱导早花基因NtMYB15及其克隆方法与应用与流程

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种烟草抗低温胁迫诱导早花基因ntmyb15及其克隆方法与应用。

背景技术：

低温是限制农作物生产的最主要的环境因素之一，低温胁迫可以改变植物的花期，从而影响作物产量及一些花卉植物的经济价值。在我国南部地区，低温胁迫诱导的烟草早花现象现象严重影响烟叶生产和农民增收。

烟草起源于南美洲，是典型喜温短日作物，生长发育适温为25-28℃，在零下2-3℃时，烟株就会死亡，地下部最适宜的生长温度是31℃。烟草在6-7叶龄时，如果受到两周左右的12℃低温胁迫就会发生早花现象（项目组田间数据）。烟草早花指烟草植株未能达到正常生长应具有的高度和叶数，花芽就提早分化，现蕾开花的现象。发生早花的烟株过早地从营养生长转入生殖生长，导致生长势弱，叶片数减少，叶片窄小，叶片的产量和质量降低。因此，烟草早花将给烟农带来重大经济损失，影响边远山区农民收入。

目前生产上主要通过农艺措施（如打顶留杈）来解决低温胁迫诱导花芽提前分化的问题，但这仅是一种极为耗费人力的补救措施。解决低温胁迫诱导早花的根本途径是通过对低温胁迫诱导烟草早花的分子机理研究，培育出耐低温抗早花的烟草新品种。

目前可供参考借鉴的关于低温胁迫影响植物花期的研究主要集中在拟南芥上。拟南芥（arabidopsisthaliana）是重要的模式植物，起源于高纬度地区及高山地区，生活环境以湿冷为主，因此具有明显的低温促进开花（春化）现象。

大量的研究表明模式植物拟南芥存在至少五种成花途径：春化作用（营养生长初期低温胁迫）、温度因素（营养期低温胁迫）、光周期、赤霉素和自主开花途径。这五种途径都通过调控开花途径关键基因floweringlocust(ft)、suppressorofoverexpressionofconstans1(soc1)及leafy（lfy）来控制开花的精确时间。constant(co）在这些基因上游起正调控作用，与此同时，flooweringlocusc(flc）在ft、soc1、lfy的上游起负调控作用。

在非诱导性短日照条件下，赤霉素是拟南芥开花的必要条件，拟南芥ga1突变体（对映贝壳杉烯突变体）在短日照条件下外施赤霉素能够开花，否者不能开花，但在长日照的条件下ga1-3表现为延迟开花。赤霉素能够与赤霉素受体gid1结合然后与della结合形成ga-gid1-della三聚体，通过泛素26s蛋白酶体降解della蛋白。当ga不存在的情况下，della蛋白能够通过抑制lfy及soc1的表达从而抑制开花，而当ga存在的时候，della蛋白降解，lfy及soc1表达上调从而促进开花。目前关于赤霉素调控植物开花的研究主要集中在长日植物拟南芥，而对于短日植物则没有涉及。并且低温胁迫与赤霉素是否存在着互作进而协同促进植物开花目前没有相关报道。

植物在营养生长的初期，经过一段时间的低温处理诱导成花作用被称为春化作用，此过程主要由几个mads转录因子所调控。低温胁迫主要影响拟南芥fri（frigida）和flc基因的表达。fri位于flc基因的上游，促进flc的表达，通过flc蛋白介导春化过程。flc基因编码一个mads转录因子，介导自主开花/春化途径，是开花路径的负调控因子。flc蛋白通过结合soc1基因及ft基因启动子上cargbox直接抑制soc1和ft基因的转录，soc1蛋白又能够调控lfy基因的转录。过表达flc基因能够抑制植物中soc1和ft基因的转录，从而抑制开花。春化作用导致flc基因转录和翻译水平均显著降低，因此春化作用通过抑制茎顶端分生组织中flc基因的表达促进开花。

春化作用是影响植物开花时期的重要因素，研究表明春化作用主要受到表观遗传修饰调控，表观修饰能够影响flc基因的表达，flc基因除了受fri基因调控，还存在h2b单泛素化、去乙酰化、h3k27三甲基化、h2a.z的富集。vin3(vernalizationinsensitive3)、vrn5(vernalization5)两个基因与春化作用直接相关。vin3蛋白编码1个phd结构域蛋白,该基因受低温诱导表达，在春化初期能够使flc基因组蛋白发生去乙酰化,从而抑制flc基因的表达。vin3蛋白还能够与另一个phd结构域蛋白vrn5发生互作形成prc2复合物,该复合体参与flc染色质的h3k27三甲基化和组蛋白去乙酰化,使flc基因在表观遗传学水平沉默。另外ubc1(ubiquitin-conjugatingenzyme1)、ubc2(ubiquitin-conjugatingenzyme2)、hub1(histonemonoubiquitination1)和hub2(histonemonoubiquitination2)介导的flc染色质h2b单泛素化、swr1c(swr1complex)能够介导h2a.z在flc染色体上的富集等。

春化作用是植物在营养生长初期受到低温胁迫诱导开花的现象，但在营养生长中期温度高低对植物开花的影响却呈现出与春化作用相反的态势，即呈现高温促进、低温抑制开花的趋势。当温度为25-27℃时,即使在短日照条件下，拟南芥开花时间也与23℃长日照相似。一些开花调控基因的突变体如phyb、cry2、fri和flc等表现出比野生型更强的温度依赖性。flc同源基因flm基因编码一个mads-box结构域蛋白，flm基因突变后拟南芥在23℃短日照情况下早花。在高温条件下flm基因剪切形式发生变化，这种剪切能够产生两种变异体flm-β和flm-δ，这两种变异结构蛋白能够竞争性地与开花抑制因子svp(shortvegetativepahse)蛋白互作。高温条件下svp蛋白水平下降,同时svp-flm-β阻遏减少，促进植物开花，在低温条件下flm-β蛋白水平升高,形成svp-flm-β阻遏物,抑制开花。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种烟草抗低温胁迫诱导早花基因ntmyb15；第二目的在于提供所述的烟草抗低温胁迫诱导早花基因ntmyb15的克隆方法，第三目的在于提供所述的烟草抗低温胁迫诱导早花基因ntmyb15的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的烟草抗低温胁迫诱导早花基因ntmyb15的核苷酸序列如seqidno：1所示。

本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：

a、烟草叶片cdna合成：提取烟草叶片总rna，反转录得到第一链cdna；

b、ntmyb15基因的pcr扩增：以烟草叶片cdna为模板，根据ntmyb15基因序列设计引物，进行pcr扩增，回收和纯化pcr扩增产物，并测序。

本发明的第三目的是这样实现的，所述的烟草抗低温胁迫诱导早花基因ntmyb15在获得抗抗低温胁迫诱导早花转基因烟草植株中的应用。

本发明提供了一种新的控制植物开花时期相关蛋白及其编码基因。

本发明所提供的植物开花时期调控相关蛋白，名称为ntmyb15，其来源于k326栽培烟草，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的seqidno：2；

2)将序列表中seqidno：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物开花时期调控相关的蛋白质。

序列表中的序列2由281个氨基酸组成。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

ntmyb15的编码基因(ntmyb15)也属于本发明的保护范围。

ntmyb15的编码基因，可具有下述核苷酸序列之一：1)序列表中seqidno：1的dna序列；2)编码序列表中seqidno：2蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中seqidno：1限定的dna序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中seqidno：1限定的dna序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的dna序列。

含有本发明ntmyb15的表达载体，细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增ntmyb15中任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了利用该基因增强植物开花时期调控的方法，是在植物中过量表达上述植物开花时期调控相关蛋白编码基因。

过量表达上述植物开花时期调控相关蛋白编码基因ntmyb15可通过多种方法实现，如植物病毒载体介导基因过表达的方法，农杆菌介导转化过表达载体，对基因编码匡进行优化修改，对该基因启动子进行优化以达到过表达效果等方法实现。本发明过量表达基因的方法并不限于上述几种方法，只要能过量表达ntmyb15即可。

利用任何基因过表达或者基因修饰方法该ntmyb15使植物表现为抗低温胁迫处理后不表现出开花时期提前的现象；利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的ntmyb15干扰载体转入植物中，植物就表现出烟草低温胁迫处理后开花时期延迟的现象。

本发明的ntmyb15基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(gus基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜宿等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以植物苗期叶片失水程度来筛选转化植株。携带有本发明ntmyb15基因的表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。

本发明的植物开花时期调控相关蛋白及其编码基因为农作物尤其是烟草优化开花时期育种提供基因与技术的支持。

附图说明

图1为低温胁迫处理及正常温度下烟草开花表型与开花所需天数示意图；

图2为ntmyb15的rnai干扰片段pcr产物电泳图；；

图3为pdonr-zeo载体图；

图4为ntmyb15基因植物表达载体pb2gw7图；

图5为转ntmyb15基因rnai干扰载体的烟草株系ntmyb15表达水平柱状图；

图6为ntmyb15基因rnai干扰烟植株低温胁迫后开花时期生长表型照片；

图7为ntmyb15基因rnai干扰烟植株低温胁迫后开花时期箱线图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的烟草抗低温胁迫诱导早花基因ntmyb15的核苷酸序列如seqidno：1所示。

所述的烟草抗低温胁迫诱导早花基因ntmyb15编码的氨基酸序列如seqidno：2所示。

本发明所述的烟草抗低温胁迫诱导早花基因ntmyb15的克隆方法，包括以下步骤：

a、烟草叶片cdna合成：提取烟草叶片总rna，反转录得到第一链cdna；

b、ntmyb15基因的pcr扩增：以烟草叶片cdna为模板，根据ntmyb15基因序列设计引物，进行pcr扩增，回收和纯化pcr扩增产物，并测序。

b步骤中所述的引物为：

正向引物：5’-ccacttgaaaaagaggcttaaaaat-3’

反向引物：5’-taaaattttcagacgagtccatctc-3’。

b步骤中所述的pcr反应体系和扩增条件如下：

b步骤中所述的回收和纯化pcr扩增产物的具体操作如下：凝胶电泳后，用干净的刀片将带有目的片段的胶切割下来，放入到离心管中，胶不要切得过大，以避免回收时dna片段溶液含有大量的杂质；向离心管中加入3倍体积的qg溶液后，在50℃条件下温浴10min，直到胶完全融化；将离心管中的溶液移到2ml的吸附柱中，离心1min，弃去液相；再次向吸附柱中加入0.5ml的qg溶液，离心1min，弃去液相；向吸附柱加入0.75ml的pe溶液，离心1min，弃去液相；再次离心1min后，将吸附柱放置在一个新的离心管上，加入50μl的溶解液，静置1min，最后离心1min，得到的液相即为回收的dna溶液。

本发明所述的烟草抗低温胁迫诱导早花基因ntmyb15的应用为所述的烟草ntmyb15在抗低温胁迫诱导烟草早花育种中的应用。

本发明所述的烟草抗低温胁迫诱导早花基因ntmyb15的应用为所述的烟草抗低温胁迫诱导早花基因ntmyb15在获得抗低温胁迫诱导早花转基因烟草植株中的应用。

所述获得抗低温胁迫诱导烟草早花转基因烟草植株的方法包括以下步骤：

a、构建载体：

根据烟草基因组中筛选出的ntmyb15基因序列设计引物，并根据gateway系统中的bp反应要求，在正向引物前加上5’ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgc3’序列，在反向引物前加5’ggggaccactttgtacaagaaagctgggtc3’序列。pcr反应均采用phusion高保真聚合酶进行pcr克隆。通过bp反应将这些片段克隆到pdonr-zeocin载体中，然后通过lr反应将这些片段分别克隆到各自目的载体中。

采用gateway®技术构建载体，其原理可简述如下：

attb1-gene-attb2×attp1-ccdb-attp2⇔attl1-gene-attl2×attr1-ccdb-attr2

(expressionclone)(pdonr™)(entryclone)(destinationvector)

bp反应

（1）在200μl离心管中准备8μl的反应体系，包括：1-7μl的attb-pcr产物（约15-150ng，浓度≥10ng/μl）、1μl的pdonr载体（150ng/μl）和适量的te缓冲液（ph8.0），在室温下混匀；

（2）将bpclonase™ii酶混合物在冰上静置2min融化，轻轻震荡2次，混匀待用；

（3）向（1）准备的样品中加入2μl的bpclonase™ii酶混合物，轻轻地将体系混匀；

（4）将bpclonase™ii酶混合物放回到-20°c或者-80°c保存；

（5）将反应体系放在25°c温浴1h；

（6）向反应体系中加入1μl的蛋白酶k溶液，轻轻震荡，然后将样品放在37°c温浴10min，以便终止bp反应；

（7）将混合液转化大肠杆菌后，取转化菌液涂在含zeacin抗性的lb平板上，挑取菌落至含相应抗生素培养基溶液中摇菌培养，确认后提取阳性克隆的质粒备用。

lr反应

（1）在200μl离心管中准备8μl的反应物，包括：1-7μl的2.2.10.1获得的pdonr-zeocin质粒（50-150ng）、1μl的目的载体（150ng/μl）和适量的te缓冲液（ph8.0），在室温下混匀；

（2）将lrclonase™ii酶混合物静置在冰上2min融化，轻轻震荡2次以混匀；

（3）加入2μl的lrclonase™ii酶混合物，轻轻震荡将体系混匀；

（4）将lrclonase™ii酶混合物放回到-20°c或者-80°c冰箱保存；

（5）将反应体系放在25°c温浴反应1h；

（6）向反应体系中加入1μl的蛋白酶k溶液以终止lr反应，轻轻震荡后，将样品放在37°c静置10min；

（7）将lr反应产物转化大肠杆菌后涂板、筛选阳性克隆、提取质粒，然后进行酵母双杂和农杆菌转化等实验。

b、农杆菌转化：

将1μg（200ng/μl）目的质粒加入到100μl感受态农杆菌中，混匀后在冰上静置5min，放入液氮中冷冻5min，然后从液氮中取出，放入37℃水浴锅中水浴5min，再在冰上静置5min后，加入500μllb溶液，在28℃、充分震荡条件下恢复培养4h，最后将菌液均匀涂抹于选择性平板培养基上，28℃下培养48h。

c、培养转基因植株：

(1)无菌条件下，将烟草种子放入ep管中用无菌水冲洗2-3次；

(2)于75%的酒精中浸泡30-60sec；

(3)再用0.1%的升汞处理5min，最后用无菌水冲洗5次；

(4)播种于ms培养基上，培养在云南烟草农业科学研究院组织培养室中，暗培养4天。25℃光照培养20-30天。

(5)待烟草苗长至3-5cm时（20-30天），取顶芽放于ms+ba0.2mg/l（壮芽，使其快速成长）培养基上，继代培养。

(6)继代培养14天后（有小叶片即可），取叶片，大小1cmx1cm，切去叶柄，叶片表面及叶边缘划伤，放入ms+ba1.0mg/lph6.0-6.5的预培养培养基上，正面朝下紧贴培养基放置，于黑暗条件下预培养2-3天。

(7)然后取出预培养的叶片或茎段，放入侵染液中进行侵染。侵染前一天晚上，摇菌农杆菌2瓶。将2ml离心管装满菌液，4000rpm离心5min，用悬菌液清洗两次。以1:10比例（10ml悬菌液放1管1.5ml菌体）放入悬菌液，加入as25mg/l（40ml中加40ulas）不断摇晃侵染液，使其与叶片及茎段切口处充分接触，10min后，取出，放于灭过菌的干燥滤纸上吸干菌液；

(8)将叶片及茎段放回到预培养基上，28℃黑暗条件下共培养2-3天，至叶片切口周围有微菌斑形成；

(9)洗菌，取出共培养的烟草叶片及茎段，用添加500mg/lcef的无菌水冲洗5次，第一次放置于摇床摇30min，后面每次5min，以洗去外植体表面的农杆菌；

(10)取出后，用滤纸吸干，转移到烟草诱芽培养基上，诱芽培养基为ms+ba1.0mg/l+hyg25mg/l+cef500mg/lph5.8；过2周观察，如果发现不长菌，则降低cef浓度。如果长菌，则继续保持cef浓度。

(11)每两周更换一次培养基，直至长出不定芽（一般情况为2周）。切下再生的小苗（1cm左右），转入继代培养基ms+ba0.2-0.1mg/l+hyg25mg/l+cef500mg/lph5.8；

(12)至小苗长至2cm长时（有小芽即可），转接入生根培养基ms+naa0.2-0.1mg/l上，24士1℃、12h光照、1500lx培养三周左右即可长出粗壮根系。

(13)对生根的植株进行pcr初步检测，将结果呈阳性的植株经过炼苗后移到泥炭：蛭石=7:1的基质中，放入人工气候室进行培养，并对其生长情况进行观察、记录。

农杆菌侵染液的制备

(1)取-80℃冰箱保存的含有表达载体的农杆菌，划平板培养，lb固体平板中加入50mg/lkan和50mg/lrif；

(2)挑取单菌斑到含50mg/lkan和50mg/lrif的5mllb液体培养基中，放入摇床中28℃、200rpm培养过夜（12h-16h）；

(3)保存菌种，750ul菌液加入灭过菌的甘油250ul，-80℃冰箱保存备用。

(4)摇菌，lb液体培养基10ml加kan（所需浓度50mg/l）10ul、rif（所需浓度50mg/l）10ul及菌液10ul，28℃、200rpm过夜培养（12h-16h）。

(5)当菌液浓度达到od600=1.5左右时，取2ml菌液加入到离心管中，4000rpm离心5min；

(6)倒掉上清液，吸1ml新的ms液体培养基，重悬农杆菌，4000rpm离心5min。

(7)重复步骤（6）一次；

(8)用1ml的ms液体培养基重悬菌后，再加入到40ml的ms的液体培养基中（含40ul25mg/l的as），即为侵染液。放置2h以上，再侵染。

下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：

实施例1

低温胁迫会使烟草早花

将6-7叶期烟株在12℃低温胁迫下处理14天，设置正常温度生长烟株为对照，12℃低温胁迫下处理14天移至正常温度下生长直至开花为低温诱导烟草早花的实验条件。早花表型能够稳定重现，经低温胁迫处理的烟草开花时间平均提前15天（图1）。

实施例2

1.烟草叶片cdna合成

采用trizol(invitrogen，usa)试剂提取烟草叶片总rna，将烟草叶片总rna定量1μg于1.5ml离心管中，按照invitrogen公司的firststrandcdnasynthesiskit产品说明进行反转录,最终获得烟草叶片cdna。

2.ntmyb15基因的rnai片段pcr扩增

以烟草叶片cdna为模板，根据烟草基因组数据库信息设计引物，进行ntmyb15基因的rnai载体片段pcr扩增，得到pcr扩增产物。

引物为：

正向引物：5’-ccacttgaaaaagaggcttaaaaat-3’

反向引物：5’-taaaattttcagacgagtccatctc-3’

将扩增获得的pcr产物在0.8%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶电泳结果为(如图2所示)，获得293bp大小的片段。

电泳结束后，采用qiagen公司pcr产物纯化试剂盒，按照产品说明回收纯化所述的pcr产物，并送invitrogen测序，验证序列结果，结果表明该序列与基因组数据库中数据完全相同。

实施例3

1.植物rnai干扰载体的构建

以实施例2中ntmyb15rnai干扰载体片段为模板，用含有gateway接头序列的引物进行pcr扩增，扩增产物经pcr产物纯化后，经过bp反应插入到invitrogen公司pdonr-zeo载体中（图3）。将构建好的bp反应载体通过lr反应将ntmyb15片段置换到phellsgate12（图4）载体中。

gateway反应引物序列如下：

ntmyb15_f

5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgcccacttgaaaaagaggcttaaaaat-3’

ntmyb15_r

5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctaaaattttcagacgagtccatctc-3’。

2.农杆菌介导的烟草转化及转基因植株的鉴定

将经过pcr反应及测序，鉴定正确的重组质粒利用冻融法转化农杆菌lba4404，通过菌落pcr确定阳性农杆菌菌株，利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草品种k326。

具体方法如下:

(1)无菌条件下，将烟草种子放入ep管中用无菌水冲洗2-3次；

(2)于75%的酒精中浸泡30-60sec；

(3)再用0.1%的升汞处理5min，最后用无菌水冲洗5次；

(4)播种于ms培养基上，培养在云南烟草农业科学研究院组织培养室中，暗培养4天。25℃光照培养20-30天；

(5)待烟草苗长至3-5cm时（20-30天），取顶芽放于ms+ba0.2mg/l（壮芽，使其快速成长）培养基上，继代培养；

(6)继代培养14天后（有小叶片即可），取叶片，大小1cmx1cm，切去叶柄，叶片表面及叶边缘划伤，放入ms+ba1.0mg/lph6.0-6.5的预培养培养基上，正面朝下紧贴培养基放置，于黑暗条件下预培养2-3天；

(7)然后取出预培养的叶片或茎段，放入侵染液中进行侵染。侵染前一天晚上，摇菌农杆菌2瓶。将2ml离心管装满菌液，4000rpm离心5min，用悬菌液清洗两次。以1:10比例（10ml悬菌液放1管1.5ml菌体）放入悬菌液，加入as25mg/l（40ml中加40ulas）不断摇晃侵染液，使其与叶片及茎段切口处充分接触，10min后，取出，放于灭过菌的干燥滤纸上吸干菌液；

(8)将叶片及茎段放回到预培养基上，28℃黑暗条件下共培养2-3天，至叶片切口周围有微菌斑形成；

(9)洗菌，取出共培养的烟草叶片及茎段，用添加500mg/lcef的无菌水冲洗5次，第一次放置于摇床摇30min，后面每次5min，以洗去外植体表面的农杆菌；

(10)取出后，用滤纸吸干，转移到烟草诱芽培养基上，诱芽培养基为ms+ba1.0mg/l+hyg25mg/l+cef500mg/lph5.8；过2周观察，如果发现不长菌，则降低cef浓度。如果长菌，则继续保持cef浓度；

(11)每两周更换一次培养基，直至长出不定芽（一般情况为2周）。切下再生的小苗（1cm左右），转入继代培养基ms+ba0.2-0.1mg/l+hyg25mg/l+cef500mg/lph5.8；

(12)至小苗长至2cm长时（有小芽即可），转接入生根培养基ms+naa0.2-0.1mg/l上，24士1℃、12h光照、1500流明。培养三周左右即可长出粗壮根系；

(13)待根生长至2-3cm。苗高7-10cm左右时，移出三角瓶洗去根部培养基，移栽于花盆中，温室培养。

采用qiagen公司dna提取试剂盒，提取转基因烟草幼苗的基因组dna，设计kan抗性基因引物进行pcr扩增，筛选阳性植株,检测到25株阳性植株。

按照实例2中所述方法提取野生型植株和25株转ntmyb15_基因t0代植株的总rna,进行realtime-pcr分析，内参基因为26s，分析不同株系的表达情况。选取表达量最低的两株植株（图5）。单株收取种子分别播种，用kan抗生素筛选tl代植株的分离情况，如此重复直至t3代获得遗传稳定的转基因株系。

ntmyb15_qrt引物

ntmyb15__qrt_f：5’-tggagagccctccctaaact-3’

ntmyb15__qrt_r：5’-tttcaagtgggtgtgccata-3’

26s内参基因引物

26s_f：5’-gaagaaggtcccaagggttc-3’

26s_r：5’-tctccctttaacaccaacgg-3’

实施例3

将野生型烟草k326植株和2个独立的rnai干扰转基因系(rnai_1及rnai_2)转基因烟草种子均匀播于含营养土的小盆中，置于光照培养室中培养。待幼苗长至6-7片叶时(47天)，12℃低温胁迫处理14天，同时设置在正常温度下生长的烟株为对照。低温胁迫处理14天后移至正常温度下生长观察低温胁迫植株及对照烟株开花情况，并记录相关数据。

rnai干扰ntmyb15基因表达后，rnai_1转基因烟草植株表现出低温胁迫条件下开花较非转基因植株及转基因植株延迟，低温胁迫和常温生长非转基因烟草基因现蕾，但rnai干扰烟株没有现蕾（图6）。同时统计2个rnai干扰转基因系(rnai-1及rnai_2)单株的开花时期箱线图，转基因烟草植株表现出低温胁迫条件下开花较非转基因植株及转基因植株延迟，延迟时间比非转基因烟株晚大约为5-6天（图7）。

sequencelisting

<110>云南省烟草农业科学研究院

<120>一种烟草抗低温胁迫诱导早花基因ntmyb15及其克隆方法与应用

<130>2017

<160>12

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>846

<212>dna

<213>ntmyb15核苷酸

<400>1

atggtgagagctccttgttgtgagaagatggggttgaaaaaaggaccatggactcctgaa60

gaagatcaaattcttgtttcttatattcaaacaaatggccatggcaattggagagccctc120

cctaaactagctggacttttgagatgtgggaagagttgcagattgcgttggactaactat180

ttgcgtccagatataaagaggggaaactttactagagaagaagaagactccattattcag240

ttacatgaaatgcttggcaatagatggtctgcaatagcagcgagattaccgggacgaacg300

gacaatgaaattaaaaatgtatggcacacccacttgaaaaagaggcttaaaaattaccag360

cctcctcaaaactccaaaagacactccaaaaacaaccttgattccaaagctcctagtact420

tctcaaaccttcaataattcagacaattttagcaatatccaagaagatattaatgggccc480

gtgaccggcccgaactcgccacaacgatcgtctagtgagatgtcgactgtcacggttgat540

tcaacagccatgacgaccatcacaatcgatgatcagaatatgtttaagcaattagatgag600

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tccacaagcgataactcgacttttggtatggagggtaccggtggagaattacaagtccaa720

tttccattttcttcggtgaagcaagaaagtatggacatggttggagcaaaattagaggac780

gacatggacttttggtacaatgttttcataaagtccggggacttactagatttaccggaa840

ttttga846

<210>2

<211>281

<212>prt

<213>ntmyb15氨基酸

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151015

trpthrproglugluaspglnileleuvalsertyrileglnthrasn

202530

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354045

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505560

ilelysargglyasnphethrarggluglugluaspserileilegln

65707580

leuhisglumetleuglyasnargtrpseralailealaalaargleu

859095

proglyargthraspasngluilelysasnvaltrphisthrhisleu

100105110

lyslysargleulysasntyrglnproproglnasnserlysarghis

115120125

serlysasnasnleuaspserlysalaproserthrserglnthrphe

130135140

asnasnseraspasnpheserasnileglngluaspileasnglypro

145150155160

valthrglyproasnserproglnargserserserglumetserthr

165170175

valthrvalaspserthralametthrthrilethrileaspaspgln

180185190

asnmetphelysglnleuaspglumetaspsersergluasnpheile

195200205

progluileaspgluserphetrpthraspaspleuserthrserasp

210215220

asnserthrpheglymetgluglythrglyglygluleuglnvalgln

225230235240

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245250255

lysleugluaspaspmetaspphetrptyrasnvalpheilelysser

260265270

glyaspleuleuaspleuprogluphe

275280

<210>3

<211>31

<212>dna

<213>bp_f

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<212>dna

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<400>4

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<210>5

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<210>6

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<212>dna

<213>ntmyb15_r

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<212>dna

<213>gatewany反应正向引物ntmyb15_f

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<212>dna

<213>gatewany反应正向引物ntmyb15_f

<400>8

ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctaaaattttcagacgagtccatctc55

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>ntmyb15__qrt_f

<400>9

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<211>20

<212>dna

<213>ntmyb15__qrt_r

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<210>11

<211>20

<212>dna

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<400>11

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<210>12

<211>20

<212>dna

<213>26s_r

<400>12

tctccctttaacaccaacgg20