副溶血性弧菌的核酸适配体及其应用以及检测副溶血性弧菌的试剂盒和方法与流程

本发明涉及生物传感器技术领域，尤其是涉及一种副溶血性弧菌的核酸适配体及其应用以及检测副溶血性弧菌的试剂盒和方法。

背景技术：

副溶血性弧菌(vibrioparahaemolyticus,简称v.p.)是一种嗜盐性的革兰氏阴性菌，属于弧菌科弧菌属，此菌适应性强，可生长于温度5～44℃，ph4.8～11.0，盐度1～8％范围的环境中。副溶血性弧菌广泛分布于近海岸海水及生长其中的水产品中，例如虾、蟹、扇贝等。目前常规的检测方法已难以满足对副溶血性弧菌现场快速检测的实际需求。

最常用的是微生物培养法，根据副溶血性弧菌的生理生化特性进行鉴定，一般需要增菌培养、分离培养、生化实验、血清学鉴定等步骤。这些方法结果稳定性好且被认可为检测的国标方法，但是实验操作复杂、耗时长，从采样到鉴定需要3～5天，而且灵敏度和特异性不高，难以用于现场分析。仪器分析法主要利用气相色谱法、高效液相色谱法等，主要根据副溶血性弧菌的化学组成或产生的代谢产物的特征谱以进行检测。此类方法结果可靠且灵敏度高，但需要繁琐的样品前处理过程、精密昂贵的仪器和经验丰富的操作人员，不利于在基层推广。使用分子生物学方法进行检测，包括最常用的聚合酶链式反应pcr、环介导等温扩增lamp等，通过扩增副溶血性弧菌的特异表达基因进行检测。这种方法大大缩短了检测时间和简化了检测程序，但是前期需要提取细菌总dna或rna，而且存在较高的假阳性率。免疫学方法是一种基于抗原和抗体之间特异性结合的原理实现检测的，常用的有酶联免疫吸附法elisa、酶联荧光分析法elfa、电化学分析法等。免疫学检测方法具有特异性强、灵敏度高、易于观察等优点，但制备抗体的周期长、成本高，且不适合长期稳定保存，因而限制了他们的广泛应用。

核酸适配体(aptamer)是一段寡核苷酸，通过体外人工进化程序(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment,selex)筛选得到，它可以高效、特异地结合各种配体，如蛋白、小分子化合物、细胞等，特异性如同抗体一样。由于它的易合成、易储存和易修饰等优点，在医学诊断治疗、药物分子设计及分析检测中具有良好的应用前景。但是，如何将核酸适配体更好的应用于副溶血性弧菌的检测之中，需要进一步的探索和研究。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供副溶血性弧菌的核酸适配体，本发明的第二个目的在于提供副溶血性弧菌的核酸适配体的应用，本发明的第三个目的在于提供用于检测副溶血性弧菌的试剂盒，本发明的第四个目的在于提供检测副溶血性弧菌的方法，以缓解现有技术中存在的副溶血性弧菌检测灵敏度低、操作不便的技术问题。

本发明提供了一种副溶血性弧菌的核酸适配体，包括：所述核酸适配体具有如seqidno.1所示的序列：

gatcgggtgtgggtggcgtaaagggagcatcggaca(seqidno.1)。

另外，本发明还提供了所述的核酸适配体在下述i或者ii中的应用：

i、检测副溶血性弧菌；

ii、制备用于检测副溶血性弧菌的试剂盒。

另外，本发明还提供了一种用于检测副溶血性弧菌的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的核酸适配体、与所述核酸适配体不完全互补的cdna、能够自组装成长链的两个发卡序列h1和h2以及高铁血红素；

所述cdna能够触发所述h1和h2的自组装；

所述h1和h2的3’端和5’端分别具有能够形成g-四聚体结构的部分前体核苷酸序列。

进一步的，所述cdna与所述核酸适配体不互补的碱基个数为3-6个。

进一步的，所述cdna的具有如seqidno.2所示的序列：

tagacgccacccacacc(seqidno.2)。

进一步的，所述cdna与所述h1的5’端互补；所述h1的3’端与所述h2的5’端互补，所述h2的3’端与所述h1的5’端互补。

进一步的，

所述h1具有如seqidno.3所示的序列：

agggcgggggtgtgggggcgtctaacccacaccttcttgttgggt(seqidno.3)；

所述h2具有如seqidno.4所示的序列：

tgggtagacgccacccacaccaagaagacggtgtgggtgggtagggcggg(seqidno.4)；

所述h1和h2自组装成长链后，位于所述h13’端的部分前体核苷酸序列，和位于所述h25’端的部分前体核苷酸序列，能够形成完整的g-四聚体结构；位于所述h23’端的部分前体核苷酸序列，和位于所述h15’端的部分前体核苷酸序列，能够形成完整的g-四聚体结构；

所述完整的g-四聚体结构结合所述高铁血红素后，能够形成具有催化活性的dnazyme。

进一步的，所述试剂盒还包括能够被所述dnazyme催化的底物。

进一步的，所述底物为四甲基联苯胺。

另外，本发明还提供了检测一种检测检测副溶血性弧菌的方法，所述方法包括：

在不存在副溶血性弧菌时，核酸适配体与cdna不完全互补，所述cdna被封闭，h1为发卡结构，h2为发卡结构；

当有副溶血性弧菌存在的情况下，副溶血性弧菌与所述核酸适配体结合，所述cdna被暴露，被暴露的所述cdna与所述h1的5’端互补配对，所述h1的发卡结构被打开，3’端暴露；所述h1的3’端与所述h2的5’端互补配对，所述h2的发卡结构被打开，3’端暴露；所述h2的3’端与所述h1的5’端互补配对，所述h1的发卡结构被打开，3’端暴露；依次自组装成长链；

所述h1的3’端与所述h2的5’端互补配对后，位于所述h13’端的能够形成g-四聚体结构的部分前体核苷酸序列，和位于所述h25’端的能够形成g-四聚体结构的部分前体核苷酸序列，能够形成完整的g-四聚体结构；位于所述h23’端的能够形成g-四聚体结构的部分前体核苷酸序列，和位于所述h15’端的能够形成g-四聚体结构的部分前体核苷酸序列，能够形成完整的g-四聚体结构；

所述完整的g-四聚体结构结合高铁血红素后，能够形成具有催化活性的dnazyme，所述dnazyme能够催化底物颜色的变化，以实现对所述副溶血性弧菌的检测；

所述核酸适配体具有如seqidno.1所示的序列：

gatcgggtgtgggtggcgtaaagggagcatcggaca(seqidno.1)；

所述cdna具有如seqidno.2所示的序列：

tagacgccacccacacc(seqidno.2)；

所述h1具有如seqidno.3所示的序列：

agggcgggggtgtgggggcgtctaacccacaccttcttgttgggt(seqidno.3)；

所述h2具有如seqidno.4所示的序列：

tgggtagacgccacccacaccaagaagacggtgtgggtgggtagggcggg(seqidno.4)。

本发明提供的核酸适配体，能够特异性的识别副溶血性弧菌，能够用于副溶血性弧菌的检测；本发明提供的试剂盒，具有很高的灵敏度与特异性，操作简单，检测快速，结果肉眼可见，适合所有实验室进行推广，无需专业培训即可实现对副溶血性弧菌的实时现场分析。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1提供的试剂盒的各序列及其结构；

图2为实施例2提供的检测方法的原理图；

图3为实施例3中检测实验的结果图；

图4为实施例3中检测实验的结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非特别说明，本发明涉及的“aptamer”即为“核酸适配体”。

本发明用核酸适配体aptamer作为分子识别元件，捕获目标菌后，通过构建的dna自组装非酶信号扩增系统，用于对副溶血性弧菌的超灵敏可视化检测。本发明提供的方案的设计原理和思路具体如下：

(1)特异性识别副溶血性弧菌apatmer的筛选

本实验中目标菌富集和信号扩增都依赖于所选核酸适配体的亲和力及特异性。通过应用副溶血性弧菌为正筛菌，沙门氏菌、李斯特菌和大肠杆菌为负筛菌进行cell-selex筛选，从而筛选出能特异性识别副溶血性弧菌的特异性核酸适配体，为下一步的检测奠定基础。通过流式细胞仪分析计算出筛选出来的核酸适配体与目的菌体的解离常数kd值，从中选择两条结合力最强的核酸序列，则为所需aptamer。获得的aptamer序列用于下一步内容(2)的链置换反应。

(2)副溶血性弧菌介导的aptamer链置换反应

以副溶血性弧菌aptamer为识别分子，设计与aptamer互补的dna序列，分析副溶血性弧菌介导的链置换反应。在aptamer和互补dna中的临近末端修饰相应的荧光基团和淬灭基团，当目标菌存在时，可以将aptamer从互补双链中置换下来，通过分析荧光强度来评价链置换效果。当副溶血性弧菌与aptamer特异性稳定结合后，被封闭的互补dna则暴露出来，从而启动下一步内容(3)的dna自组装信号放大过程。

(3)dna自组装通用型信号扩增体系的构建

基于茎环发卡结构(hairpin)的dna自组装，设计一种通用型的信号扩增体系。这部分需要分析hairpin的结构，通过荧光法评价hairpin与cdna结合启动自组装过程，评价cdna在循环扩增中的作用。研究启动链的长度对自组装反应的影响，可通过比色法观察颜色变化强弱进行分析自组装效率。通过对hairpin的茎环长度、序列进行改变，来比较信号扩增前后比色法中响应值的变化，以优化hairpin的自组装效率。分析hairpin自组装时间、反应体系缓冲液以及反应温度对扩增体系的影响。这样的自组装可以将痕量的副溶血性弧菌信号高效放大，产生的大量自组装dna产物将用于启动下一步内容(4)的可视化分析。

(4)可视化分析平台的设计与实现

利用g-quadruplex的过氧化物酶活性特征，以g-quadruplex作为可视化分析的传感元件，将g-四聚体序列设计在内容(3)中的haripin茎部，使内容(2)中产生的单链dna能打开hairpin的茎环结构而激活g-四聚体。激活后的g-四聚体具有dnazyme催化活性，将无色底物氧化成蓝色的可溶性产物，直接通过肉眼观察实验结果，适于现场快速检测分析。对市面上购买的实际样品进行分析，并将检测结果与传统的生化培养方法、仪器分析方法等进行比较，验证该核酸传感平台的准确性，进行误差分析，并进一步优化实验中的主要参数，稳定核酸传感。

与现有技术相比，本发明提供的检测副溶血性弧菌的方案具有如下优势：

(1)本发明体系中无需加入聚合酶进行信号扩增，减少了背景信号。

(2)本发明体系中无需对靶标序列进行任何修饰，而且当副溶血性弧菌混在实际水产样品中仍然可以检测到信号，该方法可以用于实际样品的定量检测。

(3)本发明中用dna自组装形成的双链作为信号放大方式，反应快速方便，缩短了操作时间。

(4)本发明所述的dna自组装非酶检测方法具有很高的灵敏度，检测限为0.1fm，比已报道的方法高出10多倍，线性范围0.1fm-1nm。检测迅速方便，直接肉眼分析，节约了检测成本。

(5)本发明所述的核酸适配体识别靶标菌具有很高的特异性，其他物质对检测不产生影响。

(6)通过改变核酸序列，发明所述的方法可以用于检测一系列不同的食源性病原微生物。

实施例1用于检测副溶血性弧菌的试剂盒

本实施例提供了一种用于检测副溶血性弧菌的试剂盒，试剂盒中包括以下物质：

核酸适配体，具有如seqidno.1所示的序列：

5’-gatcgggtgtgggtggcgtaaagggagcatcggaca-3’(seqidno.1)；

cdna，具有如seqidno.2所示的序列：

5’-tagacgccacccacacc-3’(seqidno.2)；

h1，具有如seqidno.3所示的序列：

5’-agggcgggggtgtgggggcgtctaacccacaccttcttgttgggt-3’(seqidno.3)；

h2，具有如seqidno.4所示的序列：

5’-tgggtagacgccacccacaccaagaagacggtgtgggtgggtagggcggg-3’(seqidno.4)；

高铁血红素；

四甲基联苯胺(tmb)。

其中，核酸适配体与cdna不完全互补结合，h1和h2各自形成发卡结构。

图1所示为各序列及结构。

实施例2检测副溶血性弧菌的方法

本实施例提供了实施例1提供的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)将合成回来的含识别副溶血性弧菌aptamer发卡序列95℃水浴5min后，慢慢降温至室温，使发卡结构闭合。

(2)向体系中加入2μl的pbs稀释菌液，室温反应30min，使得副溶血性弧菌与发卡中的aptamer结合并打开发卡结构。

(3)打开的发卡结构将cdna序列游离出来成单链状态，体系中加入h1和h2发卡混合液，室温反应1小时，dna进行自组装反应。

(4)向体系中加入hemin，室温反应10min，让hemin充分掺入自组装双链中。

(5)向体系中加入底物混合液a+b(其中，a为四甲基联苯胺tmb，b为双氧水)，室温反应5-10分钟，可见颜色由无色变成蓝色，当颜色不再加深时，加入h2so4终止反应。检测原理如图2所示。

实施例3不同浓度的靶标副溶血性弧菌的检测

本实施例针对不同浓度的靶标副溶血性弧菌进行了检测，具体包括以下内容：

配制副溶血性弧菌的标准溶液，终浓度分别为100cfu，1000cfu，10000cfu室温保存。

将不同浓度的菌液分别加到实施例2中(2)所述的反应体系中，充分反应，检测490nm处吸光强度和肉眼观察颜色变化。

从图3的检测结果可以看出，当存在副溶血性弧菌时，颜色由无色变成蓝色(图中未示出)，吸光值明显增加；且随着菌液浓度的增加，吸光值增加。其中，hemin空白组为只有hemin加磁珠，不加前期自组装的dna产物，磁珠空白组为只有磁珠，不加前期自组装的dna产物。

为了评估这个检测方法的灵敏度，我们配置了不同浓度的副溶血性弧菌，从10cfu到到1015cfu，并测定检测的吸光值。从图4的检测结果可以看出，当10cfu的副溶血性弧菌存在时，吸光值是阴性对照读数的三倍以上，说明该方法对副溶血性弧菌的检测限10cfu，比传统的检测方法高出10多倍。并且，随着菌液浓度的增加(从10cfu到10¹⁵cfu)，吸光值也随着增加，菌体浓度的对数(log10)与吸光值呈很好的线性关系，其线性范围是从10cfu到10⁹cfu。

其中，图4的横坐标表示副溶血性弧菌浓度的对数(log10)，图3和图4的纵坐标中的“abs”表示吸光值。

针对副溶血性弧菌污染范围广、爆发率高、危害大的特点，本发明用核酸适配体aptamer作为分子识别元件，捕获目标菌后通过构建的dna自组装非酶信号扩增系统，用于对副溶血性弧菌的超灵敏可视化检测。该核酸传感器可在常温下使用、简单易操作、检测成本较低、结果肉眼可见，适用于现场快速分析海鲜中副溶血性弧菌的污染情况；该比色法分析体系在食品安全检测中具有广泛的应用前景。而目前还没有报道dna自组装技术用于副溶血性弧菌的检测，由于这个技术的优势我们认为它是可以很好的符合现代副溶血性弧菌现场检测的要求。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

sequencelisting

<110>青岛大学

<120>副溶血性弧菌的核酸适配体及其应用以及检测副溶血性弧菌的试剂盒和方法

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