靶向EMS1/cortactin的多靶位siRNA分子及应用的制作方法

本发明属于靶向肿瘤相关基因的sirna分子的技术领域，涉及靶向ems1/cortactin的多靶位sirna分子及应用。

背景技术：

原发性肝癌(hcc)是一种多基因改变的复杂和异构肿瘤，多数病人死于术后的复发和远处转移。肝癌细胞的侵袭性在hcc复发和远处转移中发挥重要作用。研究表明，细胞膜下存在一层0.2-0.5微米厚的透明区域，称为细胞皮层。该层结构主要由肌动蛋白微丝相互交联构成，与细胞骨架重组，细胞运动，信号转导等重要生理活动密切相关^[1]。ems1基因定位于人类染色体11q13，其编码蛋白具有与细胞皮质区内肌动蛋白结合的能力，故称之为皮动蛋白(actin-bindingprotein，cortactin)。ems1/cortactin在肌动蛋白聚合过程中发挥关键性作用，并且调节细胞骨架和运动^[2-3]。有关ems1/cortactin与hcc迁移、侵袭密切相关的文献报道较多，但具体机制尚未研究清楚。

核酸干扰技术(rani)经典作用在于特异性敲除或敲低某一特定基因片段，从而阐明该基因功能，并将其用于疾病治疗。由于ems1/cortactinmrna基因全长3319bp，单一靶点sirna有时存在沉默效果不佳，性能不稳定，脱靶效应等问题，不利于下游实验开展，故本发明拟将rnai的作用靶点选择在靶基因启动子下游75位碱基之后，同时进行多个rnai靶点的联合抑制。通过多靶位sirna联合作用，稳定敲低hcc细胞中ems1/cortactin水平。

申请人拟将同时靶向ems1/cortactin多个位点的sirna联合转染入hcc细胞，通过rt-qpcr实验、人类全转录组cdna基因芯片(affymetrixhumanprimeview)检测等，研究ems1/cortactin水平下调后，hcc细胞中下游基因的具体变化，并将此实验结果与使用单一靶点sirna的作用效果相对比，分析多靶位sirna在抑制率和稳定性等方面是否具有有益效果。同时通过分析hcc细胞中ems1/cortactin水平下调后，细胞中变化基因对应生物过程、分子功能等，进一步阐述ems1/cortacitin表达与hcc迁移侵袭信号转导的具体关系，并明确其机制。研究结果为稳定抑制人hccems1/cortacitin水平和研发靶向ems1/cortactin抗转移的核酸药物提供有益的探索，为探讨hcc转移机制和临床控制hcc转移提供更有针对性的思路。

[1]喻丹，张培军.皮动蛋白及微丝相关蛋白2/3复合物介导的细胞运动的分子机制[j].生命的化学2005，25(3)：226-228.

[2]urunot，liuj，zhangp，etal.activationofarp2/3complex-mediatedactinpolymerizationbycortactin[j].naturecellbiology2001，3：259-266.

[3]brycens，clarkes，leysathjl，etal.cortactinpromotescellmotilitybyenhancinglamellipodialpersistence[j].currentbiology2005，15：1276-1285.

技术实现要素：

根据ems1mrna(genbank基本信息：nm_005231,3319bp,homosapienscortactin,transcriptvariant1,mrna)及南通麦杰生物有限公司提供的设计原则，筛选出3条特异性sirna靶序列：sirna-5、sirna-6和sirna-7，分别靶向ems1mrna基因序列ccaacatcgagatgattga(序列13，1765bp-1783bp)、cggtatcgacaaggacaaa(序列14，804bp-1783bp)和gaatatcagtcgaaacttt(序列15，514bp-532bp)。设计并制备的特异性靶向序列如下：

ems1/cortactinsirna-5的正义链：5’-ccaacaucgagaugauugadtdt-3’；

ems1/cortactinsirna-5的反义链：5’-ucaaucaucucgauguuggdtdt-3’；

ems1/cortactinsirna-6的正义链：5’-cgguaucgacaaggacaaadtdt-3’；

ems1/cortactinsirna-6的反义链：5’-uuuguccuugucgauaccgdtdt-3’；

ems1/cortactinsirna-7的正义链：5’-gaauaucagucgaaacuuudtdt-3’；

ems1/cortactinsirna-7的反义链：5’-aaaguuucgacugauauucdtdt-3’；

阴性对照序列如下：

sirna-nc的正义链：5’-uucuccgaacgugucacgudtdt-3’；

sirna-nc的反义链：5’-acgugacacguucggagaadtdt-3’。

通过将sirna-5、sirna-6和sirna-7转染入人肝癌细胞系smmc-7721，通过rt-qpcr方法测定其基因水平变化，通过ws方法和免疫荧光方法检测其蛋白水平变化予以验证。

实验结果发现，多靶位联合使用sirna-5、sirna-6和sirna-7可使smmc-7721细胞内ems1/cortactin在基因水平明显沉默，沉默效率为83.97％(区间范围81.14％-84.94％)，转染sirna-nc未见ems1/cortacin明显下降。蛋白水平westernblot实验和免疫荧光检测支持以上实验结果。

将提取同批次转染后smmc-7721之mrna并送人类全转录组cdna基因芯片(affymetrixhumanprimeview)检测，实验结果发现，当敲低ems1/cortactin水平后，细胞内改变基因591种，其中上调389种，下调202种(见表1)。通过go分析和kegg分析，发现变化基因涉及的主要细胞组分为细胞质、胞浆基质等部位，实验结果与文献中关于ems1/cortactin细胞膜下皮质区定位相符合，实验中检测出多个经典家族或分子，如interleukin家族il6，il1a，mapk家族map2k6和egr1，fgf2等，这些家族或分子被报道与细胞间黏附、侵袭和迁移密切相关，本次实验检测发现沉默hcc细胞中ems1/cortactin后，这些家族或分子变化明显，fold值大于2，说明ems1/cortactin发挥作用主要与其相关，除经典通路外，本次实验检测发现沉默ems1/cortactin后，细胞内变化的基因还与erk1和erk2负反馈调节，nf-kappab信号转导通路，tnf信号转导通路相关，与heparinbinding，cholesterolbiosyntheticprocess，proteinhomodimerizationactivity等生物过程相关，ems1/cortactin与这些家族通路或生物过程的相关性为本实验首次发现，其他文献尚未见报道。

表1细胞内全基因水平变化

*按fold值>2计算

综上所述，本实验进一步明确了ems1/cortactin在hcc迁移侵袭过程中的作用通路，拓展了对ems1/cortactin功能的理解和认识，同时为临床控制hcc转移提供更有针对性的思路。

为对实验结果进行验证，在变化基因中随机选取8种，设计合成引物，通过rt-qpcr方法检测sirna转染后其变化水平。实验结果发现其中7种基因rt-qpcr结果与基因芯片结果一致，符合度为85.00％。

仅将sirna5转染smmc-7721，下调水平在36.86％(区间范围31.95％-41.41％)，采取与上文同样的方法进行affymetrixhumanprimeview检测，实验结果发现改变基因1336种，上调基因1273种，下调63种，实验结果不符合一般规律。在变化基因中随机选取8种，设计合成引物，通过rt-qpcr方法检测sirna转染后其变化。实验结果发现其中4种与rt-qpcr结果一致，符合度为50.00％。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：本次合成靶向ems1/cortactin的sirna-5、sirna-6和sirna-7，用于同时转染人hcc细胞株smmc-7721，在基因水平下调效率约为80％，反复验证后下调水平较为稳定和准确。单一使用sirna-5，下调水平较低，仅为40％左右。将sirna-5、sirna-6和sirna-7联合应用于基因芯片检测实验，经实验结果分析和pcr验证，效果准确，为研发靶向ems1/cortactin抗转移的核酸药物提供依据。

多靶位sirna联合使用，可有效解决单一靶点sirna沉默效果不佳，性能不稳定，脱靶效应等问题，利于下游实验开展，稳定性和沉默效果好。

附图说明

图1为联合使用sirna-5、sirna-6和sirna-7，rt-qpcr方法检测ems1/cortactin基因水平下调效果示意图；

图2为联合使用sirna-5、sirna-6和sirna-7，wb分析时上层浓缩胶的配方示意图(a)、蛋白定量检测的吸光度结果示意图(b)和一体式化学发光仪拍摄照片(c)；

图3为联合使用sirna-5、sirna-6和sirna-7，免疫荧光检测ems1/cortactin蛋白水平沉默示意图；

图4为联合使用sirna-5、sirna-6和sirna-7，affymetrixhumanprimeview基因芯片检测go数据库-细胞组成(cellularcomponent)(a)、go数据库-生物过程(biologicalprocess)(b)和go数据库-分子功能(molecularfunction)(c)和kegg数据库通路分析示意图(d)；

图5为单独使用sirna-5，rt-qpcr方法检测ems1/cortactin基因水平下调效果。

具体实施方式

为方便起见，在下文中，术语“sirna”、“sirna序列”或“sirna分子”可以互换，它们表示的意思和范围相同。其中，sirna是正义链和反义链退火形成的双链结构。本发明的sirna分子来源于针对ems1/cortactin基因开放阅读框的功能保守区而设计。sirna的制备可采用多种方法，比如：化学合成法、体外转录、酶切长链dsrna、载体表达sirna、pcr合成sirna表达元件等，这些方法的出现为研究者提供了可选择的空间，可以更好地获得基因沉默效率。

本发明采取化学合成法制备sirna分子，该分子可用于hcc基因芯片检测、ems1/cortactin表达对hcc转移调控分子机制研究，也可作为制备调节细胞中ems1/cortactin基因功能药物的有效成分，下面通过实施例和附图对本发明作进一步地说明。

第一部分：联合使用sirna-5、sirna-6和sirna-7

一、通过rt-qpcr检测sirna-5、sirna-6和sirna-7同时转染后ems1/cortactin基因的表达

1.实验材料

1.1细胞株

肝癌smmc-7721细胞株，保存于南通麦杰生物技术有限公司。

1.2主要设备和耗材

二氧化碳恒温培养箱美国thermofisher公司、real-time检测仪(abi-7500)美国abi公司、倒置显微镜日本olympus公司、细胞培养板美国corning公司、dmem培养基美国lifetechnologies公司、美国lifetechnologies公司、trizolrna提取试剂美国lifetechnologies公司、sybrgreenpcr试剂盒f-415xl美国thermo公司，其他生化试剂均为进口或国产分析纯试剂。

2.实验方法

2.1细胞培养

细胞株smmc-7721生长于含10％胎牛血清的dmem培养基中，37℃、5％co2加湿培养箱中常规培养。

2.2引物设计

在ncbigenbank检索各基因序列，设计相应引物序列，化学合成sirna序列，使得对应的正义链和反义链退火形成相应的sirna。见表2。

表2sirna序列

2.3实验分组

(1)提前一天铺板，第二天转染，实验分为3组：

1)sirna-5#6#7#组(同时转染sirna-5#6#7#，靶向组)

2)sirna-nc组(转染sirna-nc，阴性对照组)

3)normal组(细胞不做任何处理，空白对照组)

(2)转染48hrs后收集样品。

取培养得到的处于对数生长期的细胞，96孔板的接种密度为5×10⁴/孔、24孔板按1.5×10⁵/孔、6孔板为1×10⁶/孔接种细胞，各实验组采用相应的sirna按操作说明用脂质体(lipofectamine)2000(invitrogen公司)转染到细胞内，使sirna终浓度为50nm，37℃培养4h后，培养液换成含10％fbs的dmem培养基。

2.4rt-qpcr检测ems1/cortactin基因的mrna水平

(1)提取细胞总rna：

1)用冷的pbs洗涤细胞数次，并加入1mlrisotmrna提取试剂，用细胞刮子将细胞刮下来。

2)将裂解液转移至离心管中，在室温下放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。

3)12,000g，4℃离心10min，然后小心吸取上清液，移入新的离心管中。

4)向上述步骤得到的匀浆液中加入0.2ml氯仿(每使用1mlriso加0.2ml氯仿)，盖紧管盖，用手上下振荡15sec，得浑浊液，无分层现象，室温静置2-3min。

5)12,000g，4℃离心15min。离心后，样品分为三层：无色上清水相、中间蛋白层及下层有机相，水相的体积约为所用riso试剂的60％。小心吸取无色上清液至另一离心管。

6)加入0.5ml异丙醇(每使用1mlriso加0.5ml异丙醇)，轻轻混匀，室温静置10min。

7)12,000g，4℃离心10min。弃去上清，加1ml70％乙醇(每使用1mlriso试剂至少加1ml70％乙醇)，涡旋振荡混匀。

8)7,500g，4℃离心5min。弃尽上清，超净工作台干燥沉淀或真空离心干燥(不可太干，否则rna将会难以溶解)，加入适量depc-h2o溶解rna沉淀，在55-60℃促溶10min。

9)取1μl的rna样品，进行1.0％甲醛变性琼脂糖电泳检测。

(2)rt-qpcr检测：

用rt-qpcr检测靶基因mrna表达水平，看家基因gapdh为内参，引物序列见表3：

表3rt-qpcr引物序列

f：forwardprimer，正向引物；r：reverseprimer，反向引物。

1)总rna反转录成cdna：反转录前rna，70℃热变性5min，后立即置于冰上；建立以下反应体系，以oligod(t)n反转录cdna：rna～2μg，m-mlv酶1μl，5×m-mlv反应缓冲液4μl，rnase抑制剂0.5μl，dntp(浓度：2.5mm)4μl，oligod(t)151μl，depc处理h2o至20μl，反应程序：42℃反应1h后；70℃灭活10min，反应结束后：稀释cdna至100μl后，保存于-80度备用；

2)pcr：以上述2对引物做qpcr，其中gapdh基因作为内参对照；建立以下qpcr反应体系：cdna4.0μl，2×sybrgreenqpcrmix12.5μl，f或f’(10μm)1.0μl，r或r’(10μm)1.0μl，ddh2o，至25μl，反应程序：95℃5min预变性。95℃30s，55℃30s，72℃30sec，45循环；反应结束后，分析rt-qpcr的扩增曲线，同时观察熔解曲线，按每个反应的ct值，用2-^δδct法分析实验结果，并作柱形图。

3.实验结果和讨论

检测各基因mrna水平的表达，如图1，由结果可知：ems1/cortactin沉默效率为83.97％。实验结果发现，多靶位联合使用sirna-5、sirna-6和sirna-7可使smmc-7721细胞内ems1/cortactin在基因水平明显沉默，沉默效率为83.97％(区间范围81.14％-84.94％)。

二、检测sirna-5、sirna-6和sirna-7同时转染后对ems1/cortactin蛋白水平沉默

(一)westernblot实验

1.实验材料

表4wb实验材料

2.实验步骤：

(1)取冻存的smmc-7721细胞系，37℃快速解冻后，1000r/min离心5min，用dmem培养基清洗1-2次(因为在冷冻的过程中加入了对细胞繁殖生长有害的物质)，用dmem基础培养基重悬后再离心。

(2)加入dmem完全培养基进行培养，每天换一次培养基。

(3)观察细胞生长状况，待细胞处于对数生长期时，调整细胞浓度为5×10⁴cells/ml，将细胞分盘铺于6孔板，共9个孔，37℃，5％co2培养箱内培养24h。

(4)制备sirna-lipofectamine2000复合物。

(5)将上清液吸掉，pbs清洗细胞。

(6)每孔加入600μlsirna-lipofectamine2000复合物到6孔培养板中，轻轻前后摇匀。

(7)37℃，5％co2培养箱内培养4-6h后，吸掉上清液，用pbs清洗两次，加入2ml的dmem完全培养基，于培养箱内培养24h后收集细胞。

(8)每组分别加入500μl的ripa裂解液，并加入适量的pmsf，置于冰上裂解2h；12000rpm，4℃，离心10min；移上清于新的ep管中，进行蛋白质定量后贮存于-20℃冰箱。(9)蛋白定量

1)标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂

表5蛋白定量试剂

2)将bca试剂a与试剂b按体积比为50:1配制适量bca工作液，充分混匀；各孔加入200μlbca工作液。

3)把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30min，然后在562nm下测定吸光度。以吸光值为横坐标，蛋白浓度(μg/μl)为纵坐标，绘出标准曲线，如图2。

4)在酶标板中加入2μl待测蛋白和8μl去离子水，加入200μlbca工作液，把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30min，然后在562nm下测定吸光度。

5)根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可计算出相应的蛋白浓度(μg/μl)，乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度(单位：μg/μl)。如图2所示，根据样品浓度确定上样量。

表6吸光度测定结果

(10)page胶的制备

1)下层分离胶的制备根据目的蛋白的分子量选用12％的胶。不同浓度的分离胶按常规进行配制，待下层胶凝固后进行上次浓缩胶的配制。

2)上层浓缩胶的配制

根据需要按图2配制浓缩胶，并插好梳子。

(11)上样及电泳

根据蛋白定量的结果相对应的加入200μlep管中，再在每管中加入染液3μl。每孔蛋白上样量为20μl。电泳浓缩胶80v20min，分离胶100v1h。

(12)转膜

将胶小心的移入转膜缓冲液中，剪下同样大小的pvdf膜，以甲醇浸泡3min，然后水洗2min，剪下同样大小的6块滤纸与pvdf膜，在转膜缓冲液中平衡15min。在转膜装置上从负极到正极放置垫片、滤纸、胶、膜、滤纸、垫片，除去气泡。电压100v，1.5h左右。

(13)膜的封闭及抗体孵育

1)封闭：5％脱脂奶粉(检测磷酸化蛋白用bsa)室温封闭1h或4℃过夜。

2)一抗：根据说明书稀释抗体，抗体加入封闭液中稀释到所需浓度，和膜孵育2h或4℃孵育过夜。二抗：孵育一抗的膜用tbst洗涤3次，每次10min。随后根据用量，稀释相对应的二抗，与膜37℃孵育1h。用tbst洗涤3次，每次10min。

3实验结果和讨论

一体式化学发光仪拍摄照片如图2，与normal组相比，sirna-nc转染细胞后，ems1/cortactin蛋白表达水平有没有差异；与nc组相比，sirna-5#6#7转染细胞后，ems1/cortactin蛋白的表达水平有显著的下降。

(二)免疫荧光

1.实验材料及仪器：

1.1实验材料

fbs、dmem培养基均购自hyclone，smmc-7721细胞来源于本实验室保存。

1.2实验仪器

细胞培养箱(thermoscientific8000)，光学显微镜(xds-1a)，低速离心机(上海卢湘仪tdz4b-ws)，荧光显微镜(leicaix71)。

2.实验步骤：

(1)待细胞生长至对数生长期时，调整细胞密度为5×10⁴cells/ml，分别接种至48孔细胞培养板，每孔300μl，每个浓度梯度3个复孔，37℃，5％co2培养24h。

(2)按照前述步骤进行转染，培养24h后进行后续实验。

1)固定：取出孔板，加入pbs300μl，静置5min，用手甩去板中液体，在吸水纸上轻轻拍干，每孔加入150μl4％多聚甲醛固定液，室温固定30min。

2)通透：每孔加入150μl0.1％tritonx-100，室温静置15min。

3)洗涤：每孔加入300μl的pbs，静置5min，吸出液体，重复3次，在吸水纸上轻轻拍干。

4)封闭：每孔加入200μl5％bsa封闭液，置于37℃，5％co2培养箱1h。吸出液体，在吸水纸上轻轻拍干。

5)一抗：每孔加入150μl采用1％bsa稀释的nse(稀释比例参照说明书)，4℃过夜孵育。

6)洗涤：每孔加入300μl的pbs，静置5min，吸出液体，重复5次，在吸水纸上轻轻拍干。

7)封闭：每孔加入200μl1％bsa封闭液，室温封闭15min。

8)二抗：每孔加入150μl采用1％bsa稀释的对应二抗(稀释比例参照说明书)，37℃孵育1h。

(3)洗涤：每孔加入300μl的pbs，静置5min，吸出液体，重复5次。

(4)染核：每孔加入150μl的hoechst33258染液，室温避光孵育30min。

(5)拍照：洗涤完毕每孔加入300μlpbs，将细胞置于荧光显微镜下观察，并拍照保存。

3.3实验结果和讨论

实验结果见图3，由上图免疫荧光可知，与normal组相比，sirna-nc转染细胞后，ems1/cortactin表达水平没有差异；与nc组相比，sirna-5#6#7转染细胞后，ems1/cortactin的表达水平有明显下降。

三、affymetrixhumanprimeview方法检测sirna-5、sirna-6和sirna-7联合转染沉默ems1/cortactin后细胞内全基因组变化

实验设计合成的sirna-5、sirna-6和sirna-7，经rt-qpcr检测，基因水平下调效率在80％左右，ws和免疫荧光实验支持以上结果，下调效率高，效果稳定。发明人将其用于大通量基因芯片检测，研究当沉默hcc细胞中ems1/cortactin基因后，细胞内全基因水平变化情况。将sirna-5、sirna-6和sirna-7联合转染肝癌细胞后，提取细胞rna，送基因芯片affymetrixhumanprimeview检测，具体步骤为：

样品总rna利用nanodropnd-2100(thermoscientific)定量并经agilentbioanalyzer2100(agilenttechnologies)检测rna完整性。rna质检合格后，样本的标记、芯片的杂交以及洗脱参照芯片标准流程。首先，总rna反转录成双链cdna，再进一步合成用生物素标记的crna。标记好的crna和芯片杂交，洗脱和染色后利用affymetrixscanner3000(affymetrix)扫描得到原始图像。

原始图像采用affymetrixgenechipcommandconsole软件(version4.0,affymetrix)处理提取原始数据。接着利用genespring软件(version12.5；agilenttechnologies)进行rma标准化和后续处理。差异基因利用foldchange的倍数变化值进行筛选，筛选的标准为上调或者下调倍数变化值>＝2.0。接着，对差异基因进行go和kegg富集分析，以判定差异基因主要影响的生物学功能或者通路。

实验结果如图4，发现细胞内改变基因591种，其中上调389种，下调202种。通过go分析和kegg分析，发现变化基因涉及的主要细胞组分为细胞质、胞浆基质等部位，实验中检测出多个经典家族或分子变化(取fold值>2)，如interleukin家族il6，il1a，mapk家族map2k6和egr1，fgf2等，这些家族或分子被报道与细胞间黏附、侵袭和迁移密切相关。除经典通路外，本次实验检测发现沉默ems1/cortactin后，细胞内变化的基因还与erk1和erk2负反馈调节，nf-kappab信号转导通路，tnf信号转导通路相关，与heparinbinding，cholesterolbiosyntheticprocess，proteinhomodimerizationactivity等生物过程相关，ems1/cortactin与这些家族通路或生物过程的相关性为本实验首次发现，其他文献尚未见报道。

第二部分：单独使用sirna-5

一、rt-qpcr检测ems1/cortactin基因的mrna水平

1分组：

(1)sirna-5组(仅转染sirna-5，靶向组)

(2)sirna-nc组(转染sirna-nc，阴性对照组)

(3)normal组(细胞不做任何处理，空白对照组)

2引物设计及具体实验方法同上，rt-qpcr检测ems1/cortactinmrna水平的表达，如图5，由结果可知：ems1/cortactin沉默效率为36.86％，区间范围(31.95％-41.41％)。

二、affymetrixhumanprimeview方法检测sirna-5沉默ems1/cortactin后细胞内全基因组变化

采取与上文同样的方法进行affymetrixhumanprimeview检测，实验结果发现改变基因1336种，上调基因1273种，下调63种，实验结果不符合一般规律(表1)。

第三部分：联合使用sirna-5、sirna-6和sirna-7及单独使用sirna-5，基因芯片结果与pcr结果对比

一、根据affymetrixhumanprimeview基因芯片结果，在上调基因和下调基因中各选择4

种，设计引物并将sirna-5、sirna-6和sirna-7转染smmc-7721细胞，通过rt-qpcr方法检测这些基因的变化情况，并与基因芯片结果进行比对。基因引物列表见表7，比对结果见表8。

表7基因引物列表

表8联合使用sirna-5、sirna-6和sirna-7基因芯片结果与rt-qpcr结果对比

二、根据affymetrixhumanprimeview基因芯片结果，在上调基因和下调基因中各选择4种，设计引物(如表9)并将sirna-5转染smmc-7721细胞，通过rt-qpcr方法检测这些基因的变化情况，并与基因芯片结果进行比对(表10)。

表9通过rt-qpcr方法检测变化基因引物列表

表10单独使用sirna-5，基因芯片结果与rt-qpcr结果对比

本发明合成靶向ems1/cortactin的sirna-5、sirna-6和sirna-7，用于转染人hcc细胞株smmc-7721，在基因水平下调效率约为80％，反复验证后下调水平较为稳定和准确。单一使用sirna-5，下调水平较低，仅为40％左右。将sirna-5、sirna-6和sirna-7联合应用于基因芯片检测实验，经实验结果分析和pcr验证，效果准确，为研发靶向ems1/cortactin抗转移的核酸药物提供依据。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和等同形式的替换，这些改进和等同替换得到的技术方案也应属于本发明的保护范围。

<110>南通大学杏林学院南通大学南通麦杰生物科技有限公司

<120>靶向ems1cortactin的多靶位sirna分子及应用

<160>12

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>21

<212>rna

<213>ems1/cortactinsirna-5的正义链

<400>1

ccaacaucgagaugauugadtdt21

<210>2

<211>21

<212>rna

<213>ems1/cortactinsirna-5的反义链

<400>2

ucaaucaucucgauguuggdtdt21

<210>3

<211>21

<212>rna

<213>ems1/cortactinsirna-6的正义链

<400>3

cgguaucgacaaggacaaadtdt21

<210>4

<211>21

<212>rna

<213>ems1/cortactinsirna-6的反义链

<400>4

uuuguccuugucgauaccgdtdt21

<210>5

<211>21

<212>rna

<213>ems1/cortactinsirna-7的正义链

<400>5

gaauaucagucgaaacuuudtdt21

<210>6

<211>21

<212>rna

<213>ems1/cortactinsirna-7的反义链

<400>6

aaaguuucgacugauauucdtdt21

<210>7

<211>21

<212>rna

<213>sirna-nc的正义链

<400>7

uucuccgaacgugucacgudtdt21

<210>8

<211>21

<212>rna

<213>sirna-nc的反义链

<400>8

acgugacacguucggagaadtdt21

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>macf1引物f

<400>9

ggttccatactgccctctgt20

<210>10

<211>20

<212>dna

<213>macf1引物r

<400>10

cagagtttgcctccttgtga20

<210>11

<211>20

<212>dna

<213>gapdhrt-pcr引物f

<400>11

gaaggtgaaggtcggagtc20

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>gapdhrt-pcr引物r

<400>12

gaagatggtgatgggatttc20

<210>13

<211>19

<212>rna

<213>对应于sirna-5的ems1mrna基因序列

<400>13

ccaacatcgagatgattga19

<210>14

<211>19

<212>rna

<213>对应于sirna-6的ems1mrna基因序列

<400>14

cggtatcgacaaggacaaa19

<210>15

<211>19

<212>rna

<213>对应于sirna-7的ems1mrna基因序列

<400>15

gaatatcagtcgaaacttt19

<210>16

<211>20

<212>dna

<213>ems1/cortactin引物f

<400>16

gtgtggaacaagaccgaatg20

<210>17

<211>20

<212>dna

<213>ems1/cortactin引物r

<400>17

catctggacaccaaacttgc20

<210>18

<211>20

<212>dna

<213>map2k6引物f

<400>18

agagatgggcaagcaagaag20

<210>19

<211>20

<212>dna

<213>map2k6引物r

<400>19

gtcatctgccttcacctcaa20

<210>20

<211>20

<212>dna

<213>meox1引物f

<400>20

aaccaggagaacagagggaa20

<210>21

<211>20

<212>dna

<213>meox1引物r

<400>21

gtccaggtttaccgcaatct20

<210>22

<211>20

<212>dna

<213>slc12a3引物f

<400>22

caactatggcgtgtgtgtca20

<210>23

<211>20

<212>dna

<213>slc12a3引物r

<400>23

tagggaatgaggagggtgag20

<210>24

<211>20

<212>dna

<213>itga2引物f

<400>24

gcactcactttgttgctggt20

<210>25

<211>20

<212>dna

<213>itga2引物r

<400>25

gtgagcctgaataaccgtga20

<210>26

<211>20

<212>dna

<213>fgf2引物f

<400>26

atgcctctctcaccactcct20

<210>27

<211>20

<212>dna

<213>fgf2引物r

<400>27

tgtatcccgagactttgctg20

<210>28

<211>21

<212>dna

<213>il6引物f

<400>28

ccagagctgtgcagatgagta21

<210>29

<211>20

<212>dna

<213>il6引物r

<400>29

tctcagctgattgtcttggg20

<210>30

<211>20

<212>dna

<213>ecm2引物f

<400>30

caaacttgctgatgatggca20

<210>31

<211>21

<212>dna

<213>ecm2引物r

<400>31

tcttctggaagaatgttccgt21

<210>32

<211>20

<212>dna

<213>map1b引物f

<400>32

ctacccatcctctcctccag20

<210>33

<211>20

<212>dna

<213>map1b引物r

<400>33

tctcagctgattgtcttggg20