治疗前列腺疾病的靶向药物的制作方法

专利名称：治疗前列腺疾病的靶向药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物和治疗领域。具体地，涉及一种包含靶向部分和前列腺疾病治疗 分子的靶向药物。本发明还涉及含有该靶向药物的药物组合物，并公开了将该靶向药物用 于前列腺疾病治疗的方法，特别是在前列腺癌的治疗中的用途。
背景技术：
在男性疾病中，前列腺疾病的发病率越来越高。前列腺疾病主要由三种疾病构成 前列腺炎，前列腺增生和前列腺癌。其中后两种较为难治，尤其是前列腺癌会导致部分患者 死亡。前列腺癌是困扰65岁以上男子的常见肿瘤之一。在美国，据信约有数百万美国男 性患有前列腺癌。虽然只有不到3%患有该病的男性因此而死亡，但前列腺癌依旧是男性癌 症死亡的第二杀手。这种癌症通常局限于前列腺，但在某些情况中癌症被诊断出时已扩散 到骨骼、肾或脑。一旦诊断出前列腺癌，就必须确定并施用合适的治疗方法。已有的治疗方法包括 根治性前列腺切除术、放疗和激素抑制。为了确定合适的治疗方法，通常考虑一些因素如患 者的年龄和疾病的严重程度。通常这种病对较年轻的患者攻击性较高。通常将任何大于 0.5cc的肿瘤视为是临床显著的。局部前列腺癌的优选治疗是根治性前列腺切除术。但这 种治疗可能会导致死亡、失禁、阳痿、直肠受损或肺栓塞。已开发了一些小分子化合物用作治疗前列腺疾病的药物。然而，在施用这些小分 子药物时，由于缺乏靶向性，因此通常需要使用较高的剂量才能在前列腺组织中达到治疗 效果所需的浓度。然而，大剂量使用药物往往伴随则一些毒副作用，对于患者产生了不利影 响。因此，对于前列腺疾病的治疗尚难以令人满意。因此，本领域迫切需要开发针对前列腺疾病的更有效的、针对性更强的药物和治 疗手段。

发明内容
本发明的目的就是提供一种针对前列腺疾病的更有效的、针对性更强的药物和治
疗方案。在本发明的第一方面，提供了一种式I所示的靶向性治疗分子，T-A (I)式中，T为针对前列腺细胞的靶向性部分(moiety)；A是对于前列腺疾病有治疗活性的化合物；并且T和A通过化学键或共价键结合。在另一类优选例中，所述的T为抗前列腺特异性抗原(PSA)的抗体或其具有靶向 性的抗体片段。
在另一类优选例中，所述的抗PSA的抗体为单克隆抗体。在另一类优选例中，所述的A为治疗前列腺癌、前列腺增生或前列腺炎的化合物。在另一类优选例中，所述的A为治疗前列腺癌的化合物。在另一类优选例中，所述的靶向性治疗分子的治疗活性保留率> 50%，其中治疗 活性保留率按下式计算
治疗活性保留率=趟示的靶向性治謝_臓xl00%。
‘化合物A的治疗活性在另一类优选例中，所述的靶向性治疗分子的治疗活性保留率> 60%,^ 70%, 彡80%或彡90%。其中，所述的治疗活性是在不考虑靶向因素情况下的同一种治疗活性。例如，如果 化合物A的治疗活性是抑制前列腺增生的活性，则靶向性治疗分子的治疗活性也是抑制前 列腺增生的活性。如果化合物A的治疗活性是治疗前列腺癌的活性，则靶向性治疗分子的 治疗活性也是治疗前列腺癌的活性。在另一类优选例中，所述的A为选自下组的治疗前列腺癌的化合物爱普列特、非 那甾胺或它们的衍生物(如药学上可接受的盐和活性衍生物)。在另一类优选例中，所述的T和A通过共价键结合。在另一类优选例中，所述的T和A是通过DCC法形成偶联的。在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，它含有药学上可接受的载体和本 发明第一方面中所述的靶向性治疗分子。在另一类优选例中，所述的药物组合物剂型是片剂、胶囊、粉末剂、颗粒剂、混悬 剂、或注射剂、口腔喷雾剂、滴丸、混悬剂。在另一类优选例中，所述的药物组合物还含有致凋亡化疗药物。在另一类优选例中，所述的致凋亡化疗药物是肿瘤坏死因子。在另一类优选例中，所述的药物组合物还含有选自下组的治疗剂TRAIL、TGF_i3、 IFN-α、血管他丁(Angiostatin)、内皮他丁(Endostatin)、甘磷酰芥、血卟啉、石蒜碱内铵 盐、鸦胆子乳、足叶乙甙(即依托泊甙)、脱水卫矛醇、阿霉素、三苯氧胺、5-氟尿嘧啶、去甲 斑螯素、双呋喃氟尿嘧啶、葫芦素、三尖杉酯碱、冬凌草乙素、马蔺子甲素、云芝糖肽、阿糖胞 苷、卡波钼、紫杉醇、香菇多糖、氟他胺、异环磷酰胺、乌苯美司、醋酸亮丙瑞林、脱氧氟尿苷、 洛波钼、依林诺特肯、来屈唑或替尼泊甙。在本发明的第三方面，提供了本发明第一方面中所述的靶向性治疗分子的用途， 它被用于制备治疗前列腺疾病的药物。较佳地，它用于制备治疗前列腺癌、前列腺增生、或前列腺炎的药物。在本发明的第四方面，提供了一种制备本发明第一方面中所述的靶向性治疗分子 的方法，其特征在于，包括步骤(a)在偶联剂存在下，将靶向性部分T与化合物A进行偶联反应，从而形成式I所 示的靶向性治疗分子T-A (I)其中，
T为针对前列腺细胞的靶向性部分(moiety)；A是对于前列腺疾病有治疗活性的化合物，并且T和A通过化学键或共价键结合。在另一类优选例中，所述的偶联剂是羧基活化剂，并且在步骤(a)中包括(i)将 化合物A用活化试剂进行活化，形成活化的化合物Α4Π (ii)将活化的化合物A与靶向性 部分T进行偶联，从而形成式I所示的靶向性治疗分子。在另一类优选例中，在步骤(ii)中，还包括添加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)共同 参与活化的化合物A与靶向性部分T的偶联反应。 在另一类优选例中，所述的偶联剂选自下组1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二 亚胺盐酸盐(EDC)、溴化氰、和高碘酸钠。在另一类优选例中，靶向性部分T与化合物A的摩尔比为1 5-1 500;较佳地 为 1 10-1 200 ；更佳地为 1 10-1 100。在另一类优选例中，偶联反应在0-40°C，更佳地4-35°C下进行。在另一类优选例中，偶联反应在pH 3. 0-7. 0，更佳地pH4. 0-6. 0下进行。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具 体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。例如，就靶向性部 分T与化合物A的摩尔比而言，范围1 5-1 500的上限1 500可以与另一优选范围 1 10-1 200的下限1 10进行组合，从而构成范围1 10-1 500。限于篇幅，在此 不再--累述。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，将治疗前列腺疾病的小分子 化合物与抗PSA的抗体通过化学偶联所形成的偶联物，不仅结合牢固并保留了 PSA抗体的 靶向性，而且基本上保留了小分子化合物全部活性。因此，与原先单独的小分子化合物(如 爱普列特和非那留胺)相比，药物使用剂量大大降低(在抑制前列腺增生时剂量下降约 1000倍左右)，从而降低了药物使用过程中产生的毒副作用。更出乎意料的是，在原本无治 疗前列腺癌效果的爱普列特和非那留胺的临床剂量范围内，本发明的相应偶联物表现出显 著的抑制前列腺癌细胞生长的效力。在此基础上完成了本发明。活性成分如本文所用，术语“本发明的小分子化合物”或“治疗前列腺疾病的小分子化合物” 可互换使用，都指对于前列腺疾病有治疗活性的化学合成的化合物(compound)。代表性的 小分子化合物包括但并不限于爱普列特和非那甾胺。1)爱普列特。其他名称17b-(N-叔丁基氨基甲酰基)雄留-3，5_ 二烯-3-羧酸；依立雄胺；爱 普列特UV;(17B)-17-[[(1，1-二甲基乙基)氨基]羧基]雄甾-3，5-二烯-3-羧酸；依普甾胺。爱普列特通过抑制人体内5 α-还原酶的活性，抑制睾丸酮还原为双氢睾丸酮，从 而降低双氢睾丸酮的浓度，起到治疗前列腺良性增生症的作用。其分子式=C25H37NO3
其化学结构式 2)非那甾胺其他名称N-叔丁基-3-氧代-4-氮杂-5 α -雄甾烯-17 β -甲酰胺，非那雄 胺其分子式=C23H36N2O2其化学结构式 本发明的小分子化合物是可从商业途径购买到，也可常规的有机合成方法制备获得。如本文所用，本发明的小分子化合物还包括所述小分子的由药学上或生理学可接 受的酸或碱衍生的盐。这些盐包括(但不限于)与如下无机酸形成的盐如盐酸、硫酸、硝 酸、磷酸，以及与有机酸形成的盐，而有机酸则指乙酸、草酸、丁二酸和马来酸。其他盐包括 与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的 “前体药物”的形式(当以这种形式给药时，在体内可转化成活性部分)。PSA 抗体前列腺特异性抗原(Prostate Specific Antigen, PSA)是一个被证明的标志物， 大量存在于前列腺中，血清中也有少量，PSA有不同的分子形式，FREE-PSA以游离的形式循 环于血液中。测定血清中不同分子形式的PSA对于区别前列腺癌和前列腺增生有重要意 义。前列腺癌患者血清中Free PSA/TotalPSA比值明显较前列腺增生患者低，当PSA值为 4 15ng/ml时，应用游离PSA/总PSA比值来区别癌和增生。PSA抗体能够专一地识别PSA，尤其是抗PSA的单克隆抗体，具有灵敏度高，专一性 强的特点，可以被用作靶向性药物的载体，专门运载针对前列腺增生和前列腺癌的药物。除了抗前列腺特异性抗原PSA的完整抗体之外，抗体的具有靶向性的抗体片段也 可用于本发明。
可用于本发明的PSA抗体可从商业途径购买到，也可常规的单克隆技术制备获得。小分子化合物-PSA抗体的偶联物及其制法本发明提供了小分子化合物-PSA抗体的偶联物及其制法。本发明的偶联物可用式I表示T-A (I)式中，T为针对前列腺细胞的靶向性部分(moiety)；A是对于前列腺疾病有治疗活性的化合物；并且T和A通过化学键或共价键结合。如本文所用，术语“本发明的偶联物”和“小分子化合物-PSA抗体的偶联物”可互 换使用，都指将本发明的小分子化合物与靶向性部分(优选PSA单克隆抗体)通过DCC法 等进行偶联，所形成的小分子化合物-PSA抗体的偶联物。应理解，在本发明的偶联物中，一个PSA抗体上可以共价结合有一个或多个小分 子化合物。本发明的方法包括将现有的治疗前列腺疾病小分子化合物与PSA抗体经化学共 价偶联(优选通过DCC法)，从而产生稳定的共价偶联物。以爱普列特和非那甾胺两种药物为例，分别与PSA单克隆抗体偶联后，得到两类 偶联物爱普列特-PSA抗体(简称E_PSA)非那留胺-PSA抗体(简称F_PSA)对本发明的偶联物进行动物试验表明，其具有极其优异的药物效果。与原先单独 的爱普列特和非那留胺相比，药物使用剂量大大降低(在抑制前列腺增生时，用药剂量可 下降约1000倍左右)，从而降低了药物使用过程中产生的副作用。另外，采用本发明提供的新偶联物，可以用作治疗前列腺癌的临床应用。原先单独 使用爱普列特和非那留胺在临床可接受的剂量范围无法观测到抗癌效果，而加大使用剂量 造成严重的副作用而无法实施。而本发明偶联物在爱普列特和非那留胺的临床可接受的剂 量范围内可以观察到对前列腺癌的治疗效果。药物组合物本发明还包括含有小分子化合物-PSA抗体的偶联物的药物组合物。本发明的小 分子化合物-PSA抗体的偶联物及其药物组合物可用于治疗前列腺简便(尤其是前列腺增 生和前列腺癌)，即给哺乳动物施用安全有效量的本发明偶联物。本发明的偶联物可单独直接用于疾病治疗，还可与其他治疗剂联用，如TNF-α、 TRAIL、TGF-β、IFN-α、血管他丁(Angiostatin)、内皮他丁(Endostatin)、甘磷酰芥、血 卟啉、石蒜碱内铵盐、鸦胆子乳、足叶乙甙(即依托泊甙)、脱水卫矛醇、阿霉素、三苯氧胺、 5-氟尿嘧啶、去甲斑螯素、双呋喃氟尿嘧啶、葫芦素、三尖杉酯碱、冬凌草乙素、马蔺子甲素、 云芝糖肽、阿糖胞苷、卡波钼、紫杉醇、香菇多糖、氟他胺、异环磷酰胺、乌苯美司、醋酸亮丙 瑞林、脱氧氟尿苷、洛波钼、依林诺特肯、来屈唑和替尼泊甙等。此外，还可与抗肿瘤的中药 (或其制剂)合用。
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一种优选的药物组合物还含有致凋亡化疗药物，尤其是肿瘤坏死因子如人肿瘤坏 死因子α等。当本发明的偶联物用于治疗前列腺癌时，它可与一种或多种药学上可接受的载体 或赋形剂混合，如溶剂、稀释剂等，从而形成药物组合物。液态载体包括无菌水、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花 生油和芝麻油)，而固态载体包括淀粉、乳糖、磷酸氢钙、微晶纤维素、蔗糖和白陶土，只要 适合活性成分的特性和所需的特定给药方式。在制备药物组合物中通常使用的佐剂也可有 利地被包括，例如调味剂、色素、防腐剂和抗氧化剂如维生素Ε、维生素C、2，6-二叔丁基对 甲酚(BHT)和叔丁基羟基茴香醚(BHA)。通常，本发明的药物组合物包括以下剂型如下口服给药片剂、胶囊、可分散的 粉末、颗粒或悬浮液(混悬剂)(含有如约0. 05-5%悬浮剂(助溶剂))、糖浆(含有如约 10-50%糖)、和酏剂(含有约20-50%乙醇)，或者以无菌可注射溶液或混悬剂形式(在等 渗介质中含有约0. 05-5%助溶剂)进行非肠胃给药。这些药物制剂通常可含有与载体混合 的约0. 5-99. 5wt%，较佳地2. 5-90wt%，更佳地5%-60wt% (重量)的本发明偶联物，按 组合物的总重量计。在制备药物组合物时，通常，可将这些本发明的化合物配制于无毒的、惰性的和药 学上可接受的水性载体介质中，其中PH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随 被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)瘤 内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、口服或局部给药。优选静脉给药方式。适应于注射的药物形式包括无菌水溶液或分散液和无菌粉(用于临时制备无菌 注射溶液或分散液)。在所有情况中，这些形式必须是无菌的且必须是流体以易于注射器 排出流体。在制造和储存条件下必须是稳定的，且必须能防止微生物(如细菌和真菌)的 污染影响。载体可以是溶剂或分散介质，其中含有如水、醇(如甘油、丙二醇和液态聚乙二 醇)、它们的适当混合物和植物油。所用的活性成分的有效剂量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。 然而，通常当本发明化合物每天以约0. 005-500mg/kg动物体重(较佳地0. 01-100mg/kg体 重，更佳地0. 05-5mg/kg体重给药)的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以 1-4次的剂量给予，或以缓释形式给药。对大部分大型哺乳动物而言，每天的总剂量约为 0. I-IOOOmg或更高，较佳地0. 5-500mg。适用于内服的剂量形式，包含与固态或液态药学上 可接受的载体混合的约0. 5-500mg的活性化合物。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应 答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是液态组合物。本发明的主要优点包括(a)本发明偶联物不仅结合牢固并保留了 PSA抗体的靶向性，而且基本上保留了 小分子化合物全部活性。(b)与原先单独的小分子化合物(如爱普列特和非那甾胺)相比，药物使用剂量大 大降低(在抑制前列腺增生时剂量下降约1000倍左右)，从而降低了药物使用过程中产生 的副作用。
(c)在原本无治疗前列腺癌效果的爱普列特和非那甾胺的临床剂量范围内，本发 明的相应偶联物表现出显著的抑制前列腺癌细胞生长的效力。(d)本发明偶联物的毒副作用小。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室手册(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1DCC法制备爱普列特-PSA抗体(方法一)采用EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)是一种可溶于水的碳 二亚胺，在酰胺合成中用作羧基的活化试剂。爱普列特与EDC之比为IM 1.2-1. SM0活化 反应的PH范围为4. 0-6. O。活化反应结束后，加入PSA抗体(该抗体为小鼠单抗)，PSA抗 体加入的量与爱普列特之比为IM IO-IOOM0采用DEAE离子交换柱进行色谱分离，即将 E-PSA偶联物悬浮于缓冲液中，缓冲液使用IOOmM Tris, pH8. 6，去除小分子化合物，得到纯 化的偶联物产品。实施例2DCC法制备爱普列特-PSA抗体(方法二 )采用EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)是一种可溶于水的碳 二亚胺，在酰胺合成中用作羧基的活化试剂。爱普列特与EDC之比为IM 1.2-1. SM0活 化反应的PH范围为4. 0-6. 0。活化反应结束后，加入PSA抗体，PSA抗体加入的量与爱普列 特之比为IM 10-100M，同时加入少量N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，共同完成偶联反应。采 用DEAE离子交换柱进行色谱分离，即将E-PSA偶联物悬浮于缓冲液中，缓冲液使用IOOmM Tris, pH8. 6，去除小分子化合物，得到纯化的偶联物产品。实施例3DCC法制备爱普列特-PSA抗体(方法三)爱普列特加入溴化氰活化(与溴化氰的重量比例为1 0. 5)，再加入己二酰胼处 理，衍化率为1_3%。活化反应结束后，加入PSA抗体和碳二亚胺(19. 17mg/ml), PSA抗体 加入的量与爱普列特之比为IM 10-100M，同时加入少量N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，共同 完成偶联反应。采用DEAE离子交换柱进行色谱分离，即将E-PSA偶联物悬浮于缓冲液中， 缓冲液使用IOOmM Tris，pH8.6，去除小分子化合物，得到纯化的偶联物产品。实施例4DCC法制备爱普列特-PSA抗体(方法四)爱普列特加入高碘酸钠氧化(爱普列特与高碘酸钠之比为IM 1. 2-1. 8M)。活化 反应结束后，加入PSA抗体和硼氰氢化钠(爱普列特与硼氰氢化钠之比为IM 1.2-1.8M)， PSA抗体加入的量与爱普列特之比为IM 10-100M反应得到E-PSA结合物。采用100KD的 超滤器纯化，以去除残留的硼氰氢化钠，得到初步纯化的偶联物。采用DEAE离子交换柱进 行色谱分离，即将E-PSA偶联物悬浮于缓冲液中，缓冲液使用IOOmM Tris，pH8. 6，去除小分 子化合物，得到纯化的偶联物产品。实施例5
DCC法制备非那留胺-PSA抗体(方法一)采用EDC (1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)是一种可溶于水的碳 二亚胺，在酰胺合成中用作羧基的活化试剂。非那留胺与EDC之比为IM 1.2-1. SM0活化 反应的PH范围为4. 0-6.0。活化反应结束后，加入PSA抗体，PSA抗体加入的量与非那甾胺 之比为IM 10-100M.采用DEAE离子交换柱进行色谱分离，即将F-PSA偶联物悬浮于缓冲 液中，缓冲液使用IOOmM Tris, pH8. 6，去除小分子化合物，得到纯化的偶联物产品。实施例6DCC法制备非那留胺-PSA抗体(方法二)采用EDC (1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)是一种可溶于水的碳 二亚胺，在酰胺合成中用作羧基的活化试剂。非那留胺与EDC之比为IM 1.2-1. SM0活化 反应的PH范围为4. 0-6.0。活化反应结束后，加入PSA抗体，PSA抗体加入的量与非那甾胺 之比为IM 10-100M,同时加入少量(终浓度约为0. 02M)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，共同 完成偶联反应。采用DEAE离子交换柱进行色谱分离，即将F-PSA偶联物悬浮于缓冲液中， 缓冲液使用IOOmM Tris，pH8.6，去除小分子化合物，得到纯化的偶联物产品。实施例7DCC法制备非那留胺-PSA抗体(方法三)非那留胺加入溴化氰活化(与溴化氰的重量比例为(1 0. 5)，再加入己二酰胼处 理，衍化率为1_3%。活化反应结束后，加入PSA抗体和碳二亚胺(19. 17mg/ml), PSA抗体 加入的量与非那甾胺之比为IM 10-100M，同时加入少量N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，共同 完成偶联反应。采用DEAE离子交换柱进行色谱分离，即将F-PSA偶联物悬浮于缓冲液中， 缓冲液使用IOOmM Tris，pH8.6，去除小分子化合物，得到纯化的偶联物产品。实施例8DCC法制备非那留胺-PSA抗体(方法四)非那留胺加入高碘酸钠氧化(非那留胺与高碘酸钠之比为IM 1. 2-1. 8M)。活化 反应结束后，加入PSA抗体和硼氰氢化钠(非那留胺与硼氰氢化钠之比为IM 1.2-1.8M)， PSA抗体加入的量与非那甾胺之比为IM 10-100M反应得到F-PSA结合物。采用100KD的 超滤器纯化，以去除残留的硼氰氢化钠，得到初步纯化的偶联物。采用DEAE离子交换柱进 行色谱分离，即将F-PSA偶联物悬浮于缓冲液中，缓冲液使用IOOmM Tris，pH8. 6，去除小分 子化合物，得到纯化的偶联物产品。实施例9不同偶联方法的结果比较对于实施例1-8中所制备的偶联物，通过常规方法测定其与等量游离药物的活性 等同性(按照标准爱普列特，非那留胺活性测定方法测定)，结果列于下表。
偶联物偶联方法与等量游离药物的活性等同性爱普列特-PSA抗体实施例165%
10 通过对比实验，考证不同的方法，表明不同的偶联方法对不同的药物产生明显不 同的结果。对于爱普列特-PSA抗体而言，实施例3和实施例2的方法都被证明可行有效，但 是实施例3中采用溴化氰活化的方法在将来生产过程中非常危险和难以操作，涉及高度危 险的生产防护。而采用实施例2的方法，简单容易。对于非那留胺-PSA抗体而言，实施例8的方法被证明可行有效，这可能由于采用 溴化氰活化的方法对非那留胺结构产生破坏，而采用高碘酸钠氧化方法能够提高效率。两种药物相比，在结构上爱普列特末端羧酸提供了很好的活化位点，且不影响活 性，与抗体蛋白分子上的活化氨基形成较为牢固的共价偶联。非那留胺也能提供了很好的化学活化位点，并可与抗体蛋白分子上的活化氨基形 成较为牢固的共价偶联。实施例10爱普列特的PSA偶联抗体和非那甾胺的PSA偶联抗体的抗丙酸睾酮引起的大白鼠 前列腺增生试验在本实施例中，SD雄性大白鼠经去势恢复后，以丙酸睾丸酮诱发前列腺增生，继而 连续一个月静脉注射1. 6和8. Oug/kg的爱普列特和非那留胺的PSA偶联抗体，结果显示与 丙睾组相比，24小时排尿量增加；前列腺体积、前列腺湿重及前列腺指数均缩小，腹部叶腺 上皮细胞高度降低，腺腔面积缩小。因此，爱普列特的PSA偶联抗体和非那留胺的PSA偶联 抗体都具有改善前列腺增生症状效果，同时，对于丙睾诱导的大鼠前列腺增生具有抑制作 用。一、激素与药物1、苯甲酸雌二醇，上海第九制药厂，批号20090401，橄榄油稀释；2、丙酸睾酮，上海华联制药有限公司，批号010504，橄榄油溶解；3、非那甾胺，广丰县创新医药原料有限公司提供，英文名finasteride，化学名 N-叔丁基-3-氧代-4-氮杂-5 α -雄甾-1-烯-17 β -甲酰胺，分子式=C23H36N2O2，分子量 373，外观白色或类白色结晶性粉末；
4、爱普列特，江苏联环药业股份有限公司提供，英文名=Epristeride,化学名 17B- (N-叔丁基-氨基-甲酰基)雄甾-3，5-Z烯-3-羧酸，分子式=C25H37NO3,分子量 399. 57，外观白色结晶性粉末；5、爱普列特-PSA偶联抗体，简称E-PSA，实施例2制备，纯度98. 1 % ；6、非那留胺-PSA偶联抗体，简称F-PSA，实施例8制备，纯度98. 3%。二、动物1、来源、种属、合格证SD大鼠，$，100_120g，上海西普尔-必凯公司提供，合格证 号沪动合证字SCXK沪2003-0002号，饲养条件按普通级动物要求饲养，自由取水，室温 25士2°C，相对湿度40-70%，光照明暗各12小时。经一周适应性。饲料购自中英合资上海 西普尔_必凯实验动物有限公司；2、体重给药时体重为170 士 20g左右；3、性另Ij 雄性；4、动物数54只，每组6只。三、剂量设置根据文献资料，以5为剂距，设两个供试品各1. 6和8. Oug/kg高和低两个剂量组。四、给药方法1、E-PSA或F-PSA =SD大鼠尾静脉注射，1. 6和8. Oug/kg体重；(该用量是按偶联 物的重量计算，大致合0. 16-0. Sug爱普列特或非那留胺/kg体重和0. 8-4ug爱普列特或非 那甾胺a/kg体重)2、苯甲酸雌二醇皮下注射，0. 05mg/kg ；3、丙酸睾酮皮下注射，0. 5mg/只；4、非那甾胺SD大鼠灌胃，1.0ml/100g体重。五、给药时间连续给药31天。六、实验方法1、分组将去势SD大鼠随机分组，同时设置正常对照组共10组，见表1所示。表1、实验动物分组及剂量设计
12 2、给药及处理将SD大白鼠去势后，观察SD大鼠身体状况，每周根据动物体重 变化。待大白鼠恢复后，根据其体重调整用药量，按照表1中所示药量及方案，每日上午 8 30-10 30给药，丙酸睾酮及苯甲酸雌二醇每日皮下注射。连续给药一个月，于末次给药 前最后一天用代谢笼收集大鼠24小时尿液，测其尿量。末次给药24小时后，将SD大鼠称 重后处死，取血及前列腺组织，进行检验分析，提取血清后保存于-80°C备用。前列腺测量 体积大小后，将前列腺组织分腹侧叶和背侧叶，称取各叶湿重，再将各叶分成两部分，一部 分称取湿重后，将组织块放置80°C烘箱中烘24小时后称干重。另一部分前列腺组织经中 性福尔马林固定，组织切片，在显微镜下，利用显微图像分析软件测量腺腔面积和腺上皮高 度，判断结果。七、实验观察指标1、尿量；2、前列腺体积；3、前列腺湿重；4、前列腺腺腔面积和腺上皮高度。八、数据处理方法数据用又士SD表示，以单因素方差分析法进行数据分析。九、结果1、E-PSA和F-PSA对SD大鼠体重、尿量、前列腺重量及前列腺系数的影响给予
E-PSA和F-PSA后，SD大鼠体重与丙睾组相比，体重未见明显异常(P > 0. 05) ；24小时排尿
量较丙睾组增加；与丙睾组相比，高剂量和低剂量组前列腺体积、前列腺湿重及前列腺指数均缩小(表2)。表2、药物对SD大鼠体重、尿量、前列腺体积、前列腺湿重及前列腺系数的影响(η =6) 注*Ρ< 0. 05，**Ρ < 0. 01 VS 丙睾组2、E-PSA和F-PSA对SD大鼠前列腺各叶上皮高度影响与丙睾组相比，E-PSA和F-PSA组腹侧叶上皮高度均缩小(P < 0. 01)(表3)。3、E-PSA和F-PSA对SD大鼠前列腺各叶腺腔面积影响与丙睾组相比，主要是腹侧叶腺腔面积缩小(表3)。表3、药物对SD大鼠前列腺各叶上皮高度和腺腔面积影响 注*P < 0. 05广P < 0. 01 VS丙睾组上皮高度η = 40，腺腔面积η = 20.十、结论爱普列特和非那甾胺的PSA偶联抗体在丙酸睾酮引起的大白鼠中，对前列腺增生 有抑制作用。另外，与原先单独的爱普列特和非那留胺相比，药物使用剂量大大降低(1000倍 左右)，从而降低了药物使用过程中产生的副作用。本试验中使用非那留胺为阳性对照药 物。i^一、参考文献中华人民共和国卫生部药政局.新药(西药)临床前研究指导原则汇编(药学、 药理学、毒理学)[M]北京人民卫生出版社，1993. 101-103.实施例11爱普列特的PSA偶联抗体和非那留胺的PSA偶联抗体的抗裸鼠移植性前列腺癌药 效学试验在本实施例中，分别观察爱普列特的PSA偶联抗体和非那留胺的PSA偶联抗体对 裸鼠移植性前列腺癌的治疗效果。方法如下(1)取BABL/C裸鼠20只，雄性，17 23g。适应性饲养一周后，套管 针皮下接种把大小相近的组织块接种入这20个裸鼠右侧背部靠腋下部。每天观察肿瘤大 小，用游标卡尺测量肿瘤长径短径，计算肿瘤体积，直至大部分裸鼠肿瘤体积范围为100 300mm3，剔除此范围之外的裸鼠，结果18只裸鼠在此范围之内。随机分成6组，分别灌胃给 药，给药体积为0. 2ml/20g，每天1次，连续25天。观察供试品对裸鼠移植性前列腺癌的治 疗效果。结果阳性对照(比卡鲁胺)组可减轻瘤重，抑制肿瘤进展，与阴性对照组对比差 异具有显著的统计学意义(P < 0. 01)，抑瘤率为83. 45% ；E-PSA高低两剂量组亦可减轻瘤 重，抑制肿瘤进展，与阴性对照组对比差异具有显著的统计学意义(P < 0. 01)，抑瘤率分别为61. 38%和31. 03%，认为对前列腺癌有抑制作用。F-PSA高低两剂量组亦可减轻瘤重， 抑制肿瘤进展，与阴性对照组对比差异具有显著的统计学意义(P < 0.01)，抑瘤率分别为 68. 97%和59. 31%，认为对前列腺癌有抑制作用。一、动物1、动物来源、种属、品系BABL/C裸鼠由中科院上海实验动物中心提供。通过实验 动物检测所检疫选用符合国家实验动物；合格证SCXK沪2003-0002 (上海市医学实验动物 管委会颁发)；2、周龄6 8周龄；3、体重17 23g;4、性别雄;5、动物数18只。二、饲养条件1、饲料饲料由中英合资上海西普尔_必凯试验动物有限公司提供；2、饲养条件在SPF级动物房层流架中饲养。每天上、下午各喂食一次，用高压灭 菌的标准饲料和水供动物自由食用。动物房通风良好，室温25 士 2°C，相对湿度40-70 %，光 照12小时，黑暗12小时；3、饲养环境BABL/C裸鼠饲养于318X 202X 135mm3塑料笼内，每笼饲养同性小鼠 3只，用高压灭菌的标准饲料和水供动物自由食用。三、阳性对照药1、名称比卡鲁胺；2、性状白色，粉末状；3、提供单位上海希地医药科技有限公司；4、批号=20051201 ；5、含量99. 4%;6、溶媒0. 5 % 的 CMC-Na。四、受试物1、爱普列特-PSA偶联抗体，简称E-PSA，实施例2制备，纯度98. 1 % ；2、非那留胺-PSA偶联抗体，简称F-PSA，实施例8制备，纯度98. 3%。五、试验方法1、裸鼠皮下移植瘤模型的建立[1]取裸鼠32只，雄性，17 23g。取肿瘤生长旺 盛且无破溃，健康情况良好的荷瘤鼠3只，右侧均长了由22Rvl前列腺癌细胞所致的皮下 肿瘤，脱白处死，固定于手术板上，用酒精消毒动物皮肤，无菌条件下剥肿瘤，所用器械均 经高压消毒。剔除坏死部分，选取表皮边缘长势良好形如鱼肉状的肿瘤，放入盛有加入了 抗生素的生理盐水的培养皿中，仔细冲洗，用眼科剪小心分离肿瘤组织至大小均一，大概 ImmXlmmXlmm的小块，剪去坏死和血管，把边缘修剪光滑，再反复用生理盐水冲洗。用20 号套管针小心吸入肿瘤块，接入这18个裸鼠右侧靠腋窝处。保证接入裸鼠的同一位置，避 免触及血管，套管针在皮下的滑行距离尽可能长，酒精消毒接种部位的皮肤。2、观察和测量肿瘤生长情况每天观察裸鼠肿瘤生长情况，每隔3天称裸鼠体重， 并用游标卡尺测量裸鼠肿瘤的最长径和最短径，按照公式V = O. 5ab2计算肿瘤体积，式中V为肿瘤体积，a为通过肿瘤中心量取的最长径，b为通过肿瘤中心量取的最短径。直至大部 分裸鼠肿瘤体积范围为100 300mm3，剔除此范围之外的裸鼠2只，结果30只裸鼠在此范 围之内。用SAS程序生成随机数据表，随机分成10组。3、观察供试品对裸鼠移植性前列腺癌的防治作用根据预实验的结果，每个供试 品各设计高剂量低剂量2个剂量，分别为10mg/Kg和0. 5mg/Kg。阳性药比卡鲁胺的浓度根 据文献[2]配置成25mg/Kg，详细情况见表4。按照表4的分组给予相应药物，根据每20mg裸 鼠给予0.2ml的药物给药。每天早晨9点灌胃。灌胃后密切观察裸鼠一般状态。每三天称 裸鼠体重[3]，用游标卡尺测量裸鼠长短径，计算肿瘤体积。直至大部分裸鼠肿瘤出现坏死时 结束实验。停药24小时后处死所有裸鼠，称量裸鼠体重，把它们排列整齐拍照。取出皮下 肿瘤，小心分离皮肤，直至肿瘤完整剥离，测量肿瘤长短径，称肿瘤体重，放在滤纸上排列整 齐，拍照。4、疗效评价[1]停药24小时后处死所有裸鼠，称量裸鼠体重，解剖剥离瘤块，称瘤 重。如果对照组裸鼠肿瘤平均重量小于1克，或20%裸鼠肿瘤重量小于400mg，则表示肿瘤 生长不良，试验作废。本试验结果所有裸鼠肿瘤均大于1克，试验有效。疗效评价公式肿瘤抑制率=(C-T)/0100%式中T为给药组平均瘤重；C为对照组平均瘤重。老版本的指导原则认为，抑制率> 30%，经统计学处理有显著性差异(P < 0. 05) 且经2次重复实验证明后，则评定该药对肿瘤有一定疗效。然而，最近学术界有趋向认为抑制率要> 60%才算有效，目前还没有定论，本试验 采用的标准为抑制率> 50%且经统计学处理有显著性差异算有效。表4、抗裸鼠前列腺癌药效学模型中受试物剂量组设置 六、结果各给药组间裸鼠体重、生存天数、瘤重和抑制率结果(叉土 SD)表5、裸鼠体重、生存天数、瘤重和抑制率结果 注与阴性对照组相比*P < 0. 05< 0.01根据表5中数据显示阳性对照(比卡鲁胺)组可减轻瘤重，抑制肿瘤进展，与 阴性对照组对比差异具有显著的统计学意义(P <0.01)，抑瘤率为83.45% ；E-PSA高低 两剂量组亦可减轻瘤重，抑制肿瘤进展，与阴性对照组对比差异具有显著的统计学意义(P
<0. 01)，抑瘤率分别为61. 38%和31. 03%，认为对前列腺癌有抑制作用。F-PSA高低两 剂量组亦可减轻瘤重，抑制肿瘤进展，与阴性对照组对比差异具有显著的统计学意义(P
<0. 01)，抑瘤率分别为68. 97%和59. 31 %，认为对前列腺癌有抑制作用。七、结论爱普列特的PSA偶联抗体和非那留胺的PSA偶联抗体高剂量组对前列腺癌抑制作 用明显，抑瘤率> 50%，而低剂量组抑瘤率< 50%，两者与阴性药对比差异均有显著的统 计学意义(P <0.01)。八、参考文献1、中华人民共和国卫生部药政局.新药(西药)临床前研究指导原则汇编(药学、 药理学、毒理学).北京人民卫生出版社，1993. 88 90.2> B. J. A. Furr, Ph. D. , and H. Tucker, Ph. D. The preclinical development of bicalutamide pharmacodynamics and mechanism of action. UROLOGY 47(Supplement ΙΑ), January 1996 13-263、张均田主编，现代药理实验方法[下册].北京医科大学中国协和医科大学联合 出版社，1991. 2281实施例12爱普列特和非那甾胺的PSA偶联抗体急性毒性试验一、实验目的观察受试物一次静脉注射后对小鼠产生的急性毒性反应和死亡情况。二、受试药物1、爱普列特-PSA偶联抗体，简称E-PSA，实施例2制备，纯度98. 1 % ；2、非那留胺-PSA偶联抗体，简称F-PSA，实施例8制备，纯度98. 3%。三、动物1、来源、种属、合格证昆明种小鼠40只，雌雄各半，由上海医科大学动物中心提供，合格证号医动字第02-22-1号。经一周适应性。饲料购自中英合资上海西普尔-必凯 实验动物有限公司。自由饮水，饲养温度22士 1°C ；相对湿度60士5% ；2、体重给药时体重为18_20g ；3、性别雌雄各半；4、动物数按体重随机分2组，20只/组。四、剂量1、参照预试结果，最高剂量定为2. Og/kg ；2、每只动物接受容量注射体积约为0. 25ml/10g。五、给药方式小鼠单次尾静脉注射，缓慢推注约15秒。六、实验方法动物按体重随机分为2组，每组20只，雌雄各半。单次尾静脉注射给予供试品注 射液，缓慢推注约15秒，给药后即观察动物各方面反应情况，死亡动物即进行解剖，检查内 脏。记录每天动物的死亡数。七、观察指标1、观察期连续观察14天；2、毒性反应观察检查小鼠外观、行为、进食、粪便等情况，死亡动物进行尸检。第 15天实验结束时，存活小鼠解剖，检查心、肺、肝、脾、肾等脏器病变。八、结果1、毒性反应及死亡情况小鼠在静脉注射供试品注射液后，小鼠给药后无明显反 应，第15天全部解剖，肉眼检查未见明显病变；2、最大耐受量小鼠在静脉注射供试品注射液后，最大耐受量MTD = 2. Og/kg。九、结论昆明种小鼠静脉注射供爱普列特的PSA偶联抗体和非那甾胺的PSA偶联抗体的最 大耐受量(MTD)分别都为2. Og/kg。讨论近年来，靶向性药物的开发成为了研究的热点。靶向性药物因其靶向性可以使得 药物在病灶或其附近富集，从而在总用药量减少的情况下，也能显著提高病灶处药物的有 效浓度，从而取得更为有效的治疗效果。目前，已经开发出了针对肝脏组织的靶向性药物。 然而，对于靶向性药物的制备中，在将小分子化合物与靶向性部分(通常为针对某一特定 组织的抗体或配体)时，并没有非常通用而有效的方法。必须针对不同的化合物而选用不 同的连接方案。此外，基于连接方法、靶向性分子的空间结构等诸多因素，制备的靶向性分 子常常会产生以下问题(1)小分子化合物与靶向性部分的结合不够牢固；(2)因空间位阻 等多种因素，靶向性分子仅保留了小分子化合物的少量活性。本发明的试验结果表明，将对于前列腺疾病有治疗活性的小分子化合物(如爱普 列特和非那留胺)和对前列腺细胞的有靶向性的PSA抗体通过DCC化学偶联法，可以形成 结合牢固的偶联物。该偶联物不仅保留了原PSA抗体的靶向性，而且基本上保留了小分子 化合物全部活性。与原先单独的爱普列特和非那留胺相比，药物使用剂量大大降低(1000 倍左右)，从而降低了药物使用过程中产生的副作用。
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在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
一种式I所示的靶向性治疗分子，T A(I)式中，T为针对前列腺细胞的靶向性部分；A是对于前列腺疾病有治疗活性的化合物；并且T和A通过化学键或共价键结合。
2.如权利要求1所述的靶向性治疗分子，其特征在于，所述的T为抗前列腺特异性抗原 (PSA)的抗体或其具有靶向性的抗体片段。
3.如权利要求2所述的靶向性治疗分子，其特征在于，所述的抗PSA的抗体为单克隆抗体。
4.如权利要求1所述的靶向性治疗分子，其特征在于，所述的A为治疗前列腺癌、前列 腺增生或前列腺炎的化合物。
5.如权利要求1所述的靶向性治疗分子，其特征在于，所述的靶向性治疗分子的治疗 活性保留率> 50%，其中治疗活性保留率按下式计算治疗活性保留率=式1所示的靶向性治疗細治疗活性X100O/O 。 _化合物A的治疗活性
6.如权利要求5所述的靶向性治疗分子，其特征在于，所述的A为选自下组的治疗前列 腺癌的化合物爱普列特、非那留胺或它们的衍生物。
7.如权利要求1所述的靶向性治疗分子，其特征在于，所述的T和A通过共价键结合。
8.—种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有药学上可接受的载体和权利 要求1所述的靶向性治疗分子。
9.如权利要求1所述的靶向性治疗分子的用途，其特征在于，用于制备治疗前列腺疾 病的药物。
10.一种制备权利要求1所述的靶向性治疗分子的方法，其特征在于，包括步骤(a)在偶联剂存在下，将靶向性部分T与化合物A进行偶联反应，从而形成式I所示的 靶向性治疗分子 T-A (I) 其中，T为针对前列腺细胞的靶向性部分； A是对于前列腺疾病有治疗活性的化合物， 并且T和A通过化学键或共价键结合。全文摘要
本发明提供了治疗前列腺疾病的靶向药物。具体地，本发明提供了一种结构如“T-A”所示的靶向性治疗分子，式中，T为针对前列腺细胞的靶向性部分(moiety)；A是对于前列腺疾病有治疗活性的化合物；并且T和A通过化学键或共价键结合。本发明的靶向药物不仅保留了原前列腺特异抗原(PSA)抗体的靶向性，而且基本上保留了小分子化合物全部活性。与原先单独的爱普列特和非那甾胺相比，本发明的靶向药物的使用剂量大大降低(1000倍左右)，从而降低了药物使用过程中产生的毒副作用。
文档编号A61K47/48GK101897979SQ200910052110
公开日2010年12月1日 申请日期2009年5月27日 优先权日2009年5月27日
发明者孙祖越, 黄文华 申请人:上海市计划生育科学研究所;上海国源生物技术有限公司