能有效编辑猪ROSA26基因的sgRNA及其应用的制作方法

本发明公开了一条能有效编辑猪rosa26基因的sgrna及其应用，同时还公开了与该sgrna相关的更加安全的外源基因的定点策略及可行性分析，属于生物技术领域。

技术背景

crispr/cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源dna。crispr/cas9系统通过将入侵噬菌体和质粒dna的片段整合到crispr中，并利用相应的crisprrnas（crrnas）来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。后来，研究人员发现，它更是一种精确且万能基因编辑工具，可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因，包括人、老鼠、猪、牛、羊、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物等的基因。利用这种机制可以实现基因组的精确编辑，如条件性基因敲除、基因敲进、基因替换、点突变等等。crispr/cas9技术以自己操作的便捷性，高效的基因编辑能力获得青睐，该技术面世以后，弥补了传统基因编辑技术的诸多不足，在基因编辑领域有着广阔的应用前景。

转基因猪在农业新品种培育和生物医药研究中具有非常重要的应用价值。长期以来，由于缺乏猪胚胎干细胞，转基因猪的制备主要依赖于体细胞基因修饰和体细胞核移植技术。而目前，对体细胞的基因修饰主要依赖将外源基因随机插入猪基因组的方法，导致外源基因在猪基因组中的整合位点和拷贝数不可控，进而使外源基因猪体内表达不稳定，引发转基因猪个体之间表型不均一等问题。又因为传统转基因猪的制备过程中对外源启动子基因及正负筛选标记基因的依赖性，进一步增加了转基因猪的安全评价等问题。这些因素限制了转基因猪的培育与应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一条能有效编辑猪rosa26基因的sgrna，该sgrna能用于特异识别和靶向编辑猪rosa26基因及rosa26基因定点整合转基因猪的制备。

本发明所提供了一种能有效编辑猪rosa26基因的sgrna，其特征在于：该sgrna的rna序列如：seqid1所示，互补链的rna序列如：seqid2所示。

本发明能有效编辑猪rosa26基因的sgrna的dna序列，其特征在于：该sgrna的dna序列如seqid3所示，互补链的dna序列如：seqid4所示。

本发明所述的能有效编辑猪rosa26基因的sgrna的制备方法，包括以下步骤：

1）在基因库中调出猪rosa26基因的序列，根据pam序列（ngg）选择用于基因敲除的sgrna靶向的区域；

2）根据靶位点的序列，设计并合成对应的引物序列；

3）引物退火形成寡聚核苷二聚体（oligoduplex）；

4）将寡核苷酸二聚体连接到相应的质粒载体中，即可获得sgrna的表达载体；

本发明所述的能有效编辑猪rosa26基因的sgrna在猪rosa26位点编辑的应用。

本发明所述的所述的能有效编辑猪rosa26基因的sgrna在猪rosa26位点编辑的应用，其特征在于：能有效编辑猪rosa26基因的sgrna在特异识别和靶向编辑猪rosa26基因中的应用以及在制备rosa26基因定点整合转基因猪中的应用。

本发明的积极效果在于：

以猪基因组中的一个能特异识别猪rosa26基因的sgrna为前提，利用crispr/cas9介导基因敲入技术，成功地构建了egfp定点整合的猪胎儿成纤维细胞的细胞系，结果显示该细胞系能稳定且高效的表达egfp基因，且该细胞系的制备过程中没有引入任何的外源的启动子基因及正负筛选标记基因。这大大的增加的转基因猪的安全性，对去除转基因猪农产品的生物、食品安全隐患具有重要意义。

附图说明：

图1为本发明用于评估3条不同sgrna切割效率的测序峰图；

图2为本发明egfp定点打靶质粒载体示意图；

图3为本发明egfp定点整合细胞克隆的荧光显微镜图；

图4为本发明egfp定点整合的细胞克隆的pcr鉴定电泳图。

具体实施方式

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1

1-1、sgrna序列的设计及px330表达载体的构建

设计并合成了3条针对猪rosa26位点的sgrna序列。上述设计完成的shrna序列合成；6条单链的sgrna的dna序列分别经过退火后形成3条靶向猪rosa26第一内含子不同位点的sgrna的寡核苷酸链；然后将该寡聚核苷酸连连入px330质粒载体。

这3条sgrna的序列及其作用位点的序列分别为：

sgrna-86序列：5-atcgcagtggtagtcaagat-3；

sgrna-86作用位点的序列：5-atcttgactaccactgcgat-3；

sgrna-89序列：5-atcttgagcataggcccaac-3；

sgrna-89作用位点的序列：5-gttgggcctatgctcaagat-3；

sgrna-91序列：5-tacggtcagataactctcac-3；

sgrna-91作用位点的序列：5-gtgagagttatctgaccgta-3；

其中，本发明所涉及的

sgrna的rna序列为：5-uacggucagauaacucucac-3（seqidno.1）；

sgrna的rna序列的互补序列为：5-uacggucagauaacucucac-3（seqidno.2）；

其中，本发明所涉及的

sgrna的dna序列为：5-tacggtcagataactctcac-3（seqidno.3）；

sgrna的dna序列的互补序列为：5-tacggtcagataactctcac-3（seqidno.4）。

、高效sgrna的评估和筛选

通过对3种sgrna的表达载体进一步的测序后，进行质粒的大提和质粒的乙醇沉淀，将纯化后一定浓度的三种sgrna的px330的表达载体，通过电穿孔转染的方式引入到猪的胎儿成纤维细胞中，转染后的72小时，提取各组细胞的基因组，然后用特异性的检测突变效率的引物进行pcr反应，将所获得的pcr产物一方面送去测序通过对测序峰图的分析初步评估个sgrna的切割效率，同时将剩下的pcr产物用于连t载体或同过t7e1分析来精确的评估各sgrna对靶基因的切割效率。图1为本发明用于评估3条不同sgrna切割效率的测序峰图。

实施例2

egfp定点整合打靶载体的构建

根据筛选出的高效sgrna设计并构建与该sgrna配套的egfp基因打靶载体（puc57-egfp-ki-donor），该打靶载体的主要原件依次为：上游同源臂、sa位点、egfp基因、polya位点、下游同源臂及原核表达的骨架载体。该egfp定点整合打靶质粒与筛选出的sgrna共同作用可以对猪基因组的rosa26位点进行特异的基因改造，然后再结合荧光显微镜与pcr的方法可以很方便的分析外源基因在该sgrna识别位点整合并表达的可行性。图2为本发明egfp定点打靶质粒载体示意图。

实施例3

（1）px330质粒与puc57-egfp-ki-donor质粒的共转染

复苏原代猪的胎儿成纤维细胞，传至f3代时，消化f3代的猪的胎儿成纤维细胞，用dpbs洗2~3遍后，弃上清，加入电转染缓冲液，然后将px330质粒与puc57-egfp-ki-donor质粒按比例加入到细胞和缓冲液中，用移液器轻轻混匀后，轻轻的将混合液移入电极杯中，将电极杯放到电穿孔仪器上进行电击操作。电击完成后，将电极杯在4℃静置10分钟后，将电极杯中的混合液转入细胞培养皿中。最后将该细胞培养皿置于39℃二氧化碳培养箱中培养。培养12小时后，换液。

实施例4

egfp细胞克隆的挑取与鉴定及荧光显微镜图片

电转染72h后，通过极限稀释的方法将猪的胎儿成纤维细胞铺到100mm细胞培养皿中，2~3天更换一次细胞培养液。9~10天后待细胞克隆长成后，在荧光显微镜下将发绿光的细胞克隆统一做上标记，然后将这些标记过的克隆挑取入24孔细胞培养板中接着培养。2~3天后，待24孔板中的细胞长至一定得汇合度，对细胞进行传代同时分出部分克隆的细胞，将这些细胞用np40裂解液裂解后再通过pcr和测序的方法进一步验证定点egfp的整合事件。图3为本发明egfp定点整合细胞克隆的荧光显微镜图；图4为本发明egfp定点整合的细胞克隆的pcr鉴定电泳图。

<110>吉林大学

<120>一条能有效编辑猪rosa26基因的sgrna及其应用

<160>6

<210>1

<211>20

<212>rna

<213>人工序列

<400>1

aucgcagugguagucaagau20

<210>2

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<212>rna

<213>人工序列

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<213>人工序列

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<212>dna

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<212>dna

<213>人工序列

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