一种活性提高的枯草芽孢杆菌启动子及其构建与应用的制作方法

本发明涉及一种活性提高的枯草芽孢杆菌启动子及其构建与应用，属于启动子工程领域。

背景技术：

枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)是一种已被美国fda认定为生物安全gras(generallyregardedassafe)的革兰氏阳性菌。其具有良好的蛋白质分泌能力的优势，并且发酵条件简单，因而被广泛应用于工业和食品酶制剂的生产中。虽然诸多工业、食品酶制剂已经在b.subtilis中实现重组表达，但现有蛋白质表达系统所具有的异源蛋白生产能力还远远不能满足规模化生产的需求。其中启动子元件在基因表达系统中发挥核心作用，而大多数正在b.subtilis中使用的启动子存在活性不高的问题。启动子是重组蛋白表达系统中最基础、最重要的一类生物元件，它直接调控目标基因的转录水平，从而影响外源蛋白的合成。目前应用最多的是天然启动子，但由于天然启动子存在种属特异性，无法满足构建更为复杂的人工代谢途径等研究的要求。

目前有多种策略改造启动子以提高其活性，比如改造启动子up元件或者对启动子进行串联等。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明的目的是提供新型枯草芽孢杆菌高效表达启动子及其人工构建和筛选方法。

本发明的第一个目的是提供一种枯草芽孢杆菌高效启动子，所述启动子的核苷酸序列如seqidno.2～seqidno.4任一所示的序列。

在一种实施方式中，所述启动子是在核苷酸序列如seqidno.1所示的psrfa启动子的基础上进行突变得到的。

在一种实施方式中，所述启动子是将psrfa启动子“-10”区上游序列进行突变得到的。

在一种实施方式中，所述启动子的核苷酸序列是将seqidno.1所示的序列的第297位至303位碱基进行突变后得到的。

本发明的第二个目的是提供含有所述启动子的重组载体。

在一种实施方式中，所述重组载体为枯草芽孢杆菌载体。

在一种实施方式中，所述重组载体为大肠杆菌—枯草芽孢杆菌穿梭载体。

在一种实施方式中，所述重组载体是将pbsg03质粒中的启动子替换成核苷酸序列如seqidno.2～seqidno.4任一所示的启动子后得到的。

本发明的第三个目的是提供含有所述启动子的重组菌。

在一种实施方式中，所述重组菌为枯草芽孢杆菌重组菌。

在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌重组菌含有所述重组载体。

在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌重组菌是先构建含有启动子psrfa和目的基因的枯草芽孢杆菌载体，然后将启动子psrfa替换成核苷酸序列如seqidno.2～seqidno.4任一所示的启动子，得到重组载体转化到枯草芽孢杆菌中即得到重组菌。

本发明的第四个目的是提供所述启动子、所述重组载体或者所述枯草芽孢杆菌重组菌在提高基因表达方面的应用。

在一种实施方式中，所述基因为绿色荧光蛋白gfp基因或者l-天冬氨酸酶基因。

本发明的有益效果：

本方法通过人工合成启动子文库，得到表达能力较强的启动子，用于异源蛋白高效表达，以期满足工业用途。此策略对于枯草芽孢杆菌中启动子的改造具有很大借鉴意义。

本发明得到了三个优于原始启动子的突变启动子pv1、pv2、pv3，其表达荧光强度分别是原始启动子的1.76、1.5、1.67倍。此外，本发明用筛选得到的最优启动子pv1去表达l-天冬氨酸酶，实现了l-天冬氨酸酶的高效表达，进一步验证突变型启动子的功能。

附图说明

图1：psrfa启动子突变体库构建策略；

图2：psrfa启动子突变体文库筛选；

图3：psrfa突变体启动子摇瓶实验验证a：生长曲线，b：gfp表达曲线，c：24h荧光强度比较，d：sds-page检测gfp表达量；

图4：天冬氨酸酶在重组枯草芽孢杆菌中的表达；a：lb培养基中的生长曲线，b：tb培养基中的生长曲线，c：lb培养基中酶活测定，d：tb培养基中酶活测定，e：sds-page检测aspa在lb培养基中的表达，f：sds-page检测aspa在tb培养基中的表达。

具体实施方式

1、gfp荧光强度的检测方法：样品12000×g离心2min，收集菌体，pbs缓冲液洗3次，用pbs稀释到一定浓度的菌体悬液，取200μl至96孔酶标板，放入synergytmh4荧光酶标仪检测荧光。程序设置为：中度震板1min；600nm检测菌体浓度；激发光495nm，吸收光525nm，增益80，检测荧光。

2、aspa酶活检测方法：

向100μlecaspa纯酶液终加入终浓度为100mmol·l^-1的富马酸铵底物溶液(ph为7.0)及终浓度为1mmol·l^-1的mg²⁺，37℃反应10min。反应结束后将反应体系于100℃反应10min，12000rpm离心5min，吸取上层溶液，用0.22μm有机滤膜过滤。通过hplc检测残余富马酸的方法测定酶活。

其中，hplc检测方法如下：

选择有机酸分析色谱柱prevailorganicacid(oa)(5μm，4.6mm×250mm)。流动相为20％甲醇溶液(用磷酸调ph至2.2)，流速为0.6ml·min^-1，检测波长为220nm，柱温为40℃，检测时间为15min，进样量为10μl。所测得的富马酸含量等同于标样所测得富马酸含量，从而计算酶活。每组实验检测3次取平均值。

酶活定义：在37℃，ph为7.0的条件下，每分钟转化底物富马酸生成1mmol产物l-天冬氨酸所需酶量为一个酶活单位1u。

比酶活定义：每mg蛋白所含的酶活力单位数，即比活力＝活力u·mg^-1蛋白。

3、培养基：lb培养基(l^-1)：胰蛋白胨10g，nacl10g，酵母提取物5g，ph7.0，配制固体培养基时添加琼脂粉20g。

tb培养基(gl^-1)：酵母提取物24，胰蛋白胨12，甘油4，k2hpo412.54，kh2po42.31，ph7.0。

4、培养条件：重组菌种从-80℃冰箱中取出，在含有相应抗性的lb平板上划线，挑取单菌落在含有5mllb培养基的试管中200r·min^-1，37℃过夜培养。之后按2％接种量转入含有50mltb培养基的250ml摇瓶中培养。

5、枯草芽孢杆菌168转化方法：挑单菌落bs168接种至2ml的spi培养基中，37℃摇床培养过夜；从过夜培养物中取100μl，接种至5mlspi培养基中，37℃摇床培养4-5h后开始测od600。当od600约为1.0时，移取200μl菌液转接至2ml的spii培养基中，于37℃、100r·min^-1摇床孵育1.5h；向管中加入20μll00×egta(乙二醇双(α-氨基乙基醚)四乙酸)溶液，于37℃、100r·min^-1摇床中培养10min后分装500μl每l.5ml离心管；向管中加入经过测序验证正确的适量质粒，吹吸混匀放置于37℃、100r·min^-1的摇床中培养2h；培养结束，吸取菌液约200μl均匀涂相应的选择性平板，37℃过夜培养。

实施例1：psrfa启动子突变体库构建策略

(1)以psrfa-7bp-1和psrfa-7bp-2(表1)为引物，以pbsg03为模板，对psrfa启动子[c.guan,w.cui,j.cheng,l.zhou,j.guo,x.hu,g.xiao,z.zhou,constructionanddevelopmentofanauto-regulatorygeneexpressionsysteminbacillussubtilis,microb.cellfact.14(2015)]σ^a识别核心区“-10区”上游7bp碱基进行简并突变(图1)。

表1本实施例中用到的引物

实施例2：psrfa启动子突变体文库筛选

将所得到的psrfa启动子突变体文库转化b.subtilis168，涂布平板，获得转化子。挑取得到的枯草芽孢杆菌转化子至96孔细胞培养板中培养，用酶标仪测定菌液的od600和gfp荧光强度，筛选不同gfp表达水平的突变体启动子。

从96孔板筛选结果可以看出(图2)，所有转化子都成功表达了序列如seqidno.5所示的gfp，大部分转化子的gfp荧光强度下降，有3个转化子的gfp荧光强度增强，说明这3个突变体启动子是正向突变，得到的这3个突变体启动子分别为pv1、pv2、pv3，碱基序列分别如seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4所示。

实施例3：psrfa突变体启动子摇瓶实验验证

将实施例2筛选得到的3个psrfa启动子用于摇瓶实验验证。在250ml摇瓶体系中验证这些转化子表达gfp活性，结果显示，带有突变体启动子质粒的菌株的生长曲线与野生型菌株一致(图3-a)，并且野生型与突变体启动子都在细胞对数生长的中后期活性迅速提高(图3-b)，这符合psrfa启动子受群体感应信号激活这一特点。筛选得到的3个突变体启动子的活性较野生型启动子都大幅提升，最高的pv1活性约为野生型启动子的1.76倍(图3-c)，pv2、pv3，表达荧光强度分别是野生型启动子psrfa的1.5、1.67倍。sds-page检测结果与gfp荧光检测结果一致(图3-d)。

实施例4：天冬氨酸酶在重组枯草芽孢杆菌中的表达

将实施例3中最佳突变启动子pv1分别用于天冬氨酸酶aspa(序列如seqidno.6所示)的表达，实施过程主要是将原始载体中的报告基因gfp替换成aspa，具体引物设计见上表1，天冬氨酸酶表达量较原始psrfa启动子提高了90％，图4显示是表达天冬氨酸酶具体情况。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110>江南大学

<120>一种活性提高的枯草芽孢杆菌启动子及其构建与应用

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