一种调控杨树叶片发育的生长调节因子基因及其应用的制作方法

文档序号：12794005阅读：246来源：国知局

本发明涉及一种调控叶片发育的生长调节因子基因及其应用，尤其涉及一种调控杨树叶片发育的生长调节因子基因ptgrf1/2d及其应用，属于植物基因工程和生物技术领域。

背景技术：

叶片作为植物光合作用的主要器官，是植物的“绿色工厂”，对植物的生长发育有重要作用。已有研究表明生长调节因子(growth-regulatingfactor,grf)参与植物叶片的发育。grf作为一类植物特有的转录因子，参与植物生长发育的调控并发挥重要作用。大多数grf是mir396的靶基因，与mir396一起参与多种植物生长发育过程，包括叶片的生长发育。在叶片发育过程中，grf通过细胞周期途径调控细胞分裂和/或细胞扩展作用于细胞数目和/或细胞大小。另外，grf还通过与互作因子grf-interact-ingfactor(gif)的互作与叶片生长发育过程密切关联，进而调控叶片发育过程中细胞分裂和细胞扩展的转变。而不同的grf基因在叶片分裂区与扩展区存在差异表达的模式可能是它们影响叶片细胞分裂和/或扩展的基础。

杨树作为在世界范围分布广泛的一种经济树种，不仅是重要的木材原材料，也被认为是一种重要的能源植物，具有早期速生、易杂交改良和繁殖、适应性强等特点，因而广泛应用于速生材栽培。另外，杨树作为研究树木生长发育的模式树种，还具有连年生长及碳分配等特性，因此了解grf在木本植物器官发育中的作用有重要的理论和实际应用价值。

目前，grf的功能在木本植物研究甚少。分离调控叶片生长发育的关键grf基因，利用植物转基因技术鉴定其功能，通过遗传改良促进叶片生长发育，获取大叶木本植物，不仅对林木生长发育研究有重要理论意义，而且在农业、畜牧业和观赏园艺生产中具有巨大的应用价值。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的之一是提供一种调控杨树叶片发育的生长调节因子基因ptgrf1/2d。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种调控杨树叶片发育的生长调节因子基因ptgrf1/2d，其核苷酸序列如序列表中的序列1所示(加粗单下划线序列为mir396调控位点)。

一种调控杨树叶片发育的生长调节因子基因ptgrf1/2d的不受mir396调控的突变形式mptgrf1/2d，其核苷酸序列如序列表中的序列2所示(双下划线序列为已突变的mir396调控位点)。

本发明的另一目的是提供一种调控杨树叶片发育的生长调节因子基因ptgrf1/2d的表达蛋白。

本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：

一种调控杨树叶片发育的生长调节因子基因ptgrf1/2d的表达蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列3所示。

一种含有调控杨树叶片发育的生长调节因子基因ptgrf1/2d的载体pmdc32-mptgrf1/2d，所述载体在ptgrf1/2d基因的5’端组装组成型强表达启动子p35s；在ptgrf1/2d基因的3’端组装有强终止子nos。

一种由上述载体组装的hpt基因可作为转基因杨树的筛选标记，用潮霉素进行转基因杨树的筛选，所述的载体上组装有lb序列和rb序列，lb序列和rb序列能促使组装于其间的ptgrf1/2d基因整合至杨树受体细胞染色体中。

一种调控杨树叶片发育的生长调节因子基因ptgrf1/2d的表达蛋白。

本发明的再一目的是提供一种调控杨树叶片发育的生长调节因子基因ptgrf1/2d的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：

一种调控杨树叶片发育的生长调节因子基因ptgrf1/2d在调控杨树生长发育过程中的应用。

本发明的优点：

与现有技术相比，本发明以银腺杨(populusalba×p.glandulosa)为材料，克隆了ptgrf1/2d基因，并对其mir396靶位点核苷酸进行6个碱基的同义突变，获得突变形式的ptgrf1/2d(mptgrf1/2d，序列2)，通过将mptgrf1/2d基因转入银腺杨，过量表达mptgrf1/2d的转基因杨树与对照植株比较，叶片明显变大，说明ptgrf1/2d基因是调控杨树叶片发育的关键调节基因，在林木基因工程领域有重要应用价值。

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。

附图说明

图1是本发明植物表达载体pmdc32-mptgrf1/2d的结构示意图。

图2-1是未转基因银腺杨与本发明过量表达mptgrf1/2d的转基因银腺杨的植株比较图。

图2-2是未转基因银腺杨与本发明过量表达mptgrf1/2d的转基因银腺杨的叶片比较图。

图3是本发明过量表达mptgrf1/2d的转基因杨树的转录水平定量检测图。

图4是本发明测量的过量表达mptgrf1/2d的转基因杨树的叶面积图。

具体实施方式

以下实施例中未进行详细说明的操作可参照分子克隆，相关试剂盒使用说明的操作实现。

实施例1克隆ptgrf1/2d基因

以银腺杨为材料，使用rneasyplantmini试剂盒和rnase-freednasei试剂盒(qiagen，hilden，germany)提取扦插30天的银腺杨组培苗总rna。每个样品取约3.0μgrna，通过使用superscriptiiifirst-strandsynthesissystem(lifetechnologies，carlsbad，ca，usa)合成cdna第一链。参考已发表的毛果杨基因组序列，使用oligo软件设计引物(扩增子包含起始密码子及终止密码子)，进行编码区扩增(引物中引入gateway接头)。

其中，ptgrf1/2dcds正向引物为(如序列表中序列4)：

ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctatatggattttggggttcag，

ptgrf1/2dcds反向引物为(如序列表中序列5)：

ggggaccactttgtacaagaaagctgggtattacatggcaggcaatgaa

ptgrf1/2dcds正向突变引物为(如序列表中序列6)：

ccgccatcgttctaggaaaccagtcgagggccaatcaggccattccg

ptgrf1/2dcds反向突变引物为(如序列表中序列7)：

ttggccctcgactggtttcctagaacgatggcggcccctgttcat

高保真pcr反应体系如下：toyobo高保真扩增酶kodplus1μl，正向引物(10μm)0.8μl，反向引物(10μm)0.8μl，模板(银腺杨cdna)1μl，无菌ddh2o补足至20μl。反应程序：预变性94℃，5min；94℃，30s；56℃，30s；68℃，2min，35个循环；68℃，10min。

最终获得基因全长cdna序列为1830bp，命名为ptgrf1/2d基因，序列如序列表中序列1所示。

ptgrf1/2d序列(加粗单下划线序列为mir396调控位点)：

atggattttggggttcaggtgggtttggatgggttggtgggttcagacacaagtaatagtggttttgcttctcttgctagctcagatcctgaagcaaagcagaagttgtacggatctgggttcttgaagcaagagagacctggcaacatcgatggtgattggaggagctctaaattgtccaaaactgagtcaatgctgcttgagcagagtaacacttcacttctgaaatctaactccaactttctcttcgctgatggacagcagcagcagcagcagatgctcagcttctcctatcccagatcagctccttcagcggaaagaagctcccaaaatggcacattgccgtactttcacctcacatcttctgctcataatagaaatacaggctacagctctggtatctacaatgctgccagcatgcatggggttttgaccgagaccagatggccattcactcaatcacaatggatggagcttgaacatcaggccttgatctacaagtatatagcagcaaatgtgcctataccatctaatctgctcattcccattagaaaagctcttgattctgctgggtttcctagcttttctgctggatttttcagacccaatacaatgccatggggtgctttccatatgggtttctccagcaacactgatccggagccaggacggtgtcgaaggacagatgggaagaaatggcggtgctcaagagatgcagttgccgatcagaagtattgtgagcggcatatgaacaggggccgccatcgtggccaatcaggccattccgctgcagccgccaccactgtaaagccagccaatggcacttcgtcttctacatcatcatcagtggtggggcttcgcagcactgtgtccgacagcctcactattgctcataatcagcagcaagcaacgagtccatctaatctttctgcctccaatacgctcagcaggatgttccttactaaagagaatgtaggtgagagaacgcaggatgcgacagccttgtccatgcttcgatccaccatggaccttaaatcgaaagaaactccattcgtcatatcaaaacagcagaactcatatggggaatccttacgaaatgagtttggacttgtcacctccgattccctcctcaatcactcacagaaaagctcatccttaatgagttgcagaaattttggatcgtctcaggacctcactaaccaggaatctgtttcacagcactccctccgccaattcatggatgattggcctaaaagtcagtctgatcgttctgctgtttcttggcctgaacttgatcagcaatctgagagaacccagctatcgatttcaatccccatggctcctgcagacttcatgtcatctacttcctccccaaacaatgaaaaagtcactctctccccattgagattatcacgagaatttgatccaatacagatgggactgggagtgggaggtggaggtggtagtattgccaacgaaccaaaccagaggcaagccaactggattcccatttcttggggaacatcaatgggtggtccgctcggggaggtcttgcacaacaccaataacaatgcagcagcagagtgcaagaccacgtcatcgctgaacctgatgacctatagatgggacaacagtcctcgtataggttcatctccaactggggttttacaaaagtcagcgtttgcttccctttcaaatagcagtgcgggaagcagcccaagagcagagaacaggaccaatgaaggtggcagtctctgcaatgacctccttggatcaactattgtgcattcttcttcattgcctgccatgtaa

实施例2mptgrf1/2d基因的获得

在mir396调控区待突变位点设计一条特异突变的正向突变上游引物及与该正向突变上游引物互补的反向突变下游引物，以ptgrf1/2d基因为模板，以ptgrf1/2dcds正向引物与反向突变下游引物组成的引物对及正向突变上游引物与ptgrf1/2dcds反向引物组成的引物对分别进行pcr扩增，将得到的pcr产物凝胶回收并等量混合用作模板，再以ptgrf1/2dcds正向和反向引物组成的引物对进行pcr扩增和测序，最终得到mptgrf1/2d基因，序列如序列表中序列2所示。

mptgrf1/2d序列(双下划线序列为已突变的mir396调控位点)：atggattttggggttcaggtgggtttggatgggttggtgggttcagacacaagtaatagtggttttgcttctcttgctagctcagatcctgaagcaaagcagaagttgtacggatctgggttcttgaagcaagagagacctggcaacatcgatggtgattggaggagctctaaattgtccaaaactgagtcaatgctgcttgagcagagtaacacttcacttctgaaatctaactccaactttctcttcgctgatggacagcagcagcagcagcagatgctcagcttctcctatcccagatcagctccttcagcggaaagaagctcccaaaatggcacattgccgtactttcacctcacatcttctgctcataatagaaatacaggctacagctctggtatctacaatgctgccagcatgcatggggttttgaccgagaccagatggccattcactcaatcacaatggatggagcttgaacatcaggccttgatctacaagtatatagcagcaaatgtgcctataccatctaatctgctcattcccattagaaaagctcttgattctgctgggtttcctagcttttctgctggatttttcagacccaatacaatgccatggggtgctttccatatgggtttctccagcaacactgatccggagccaggacggtgtcgaaggacagatgggaagaaatggcggtgctcaagagatgcagttgccgatcagaagtattgtgagcggcatatgaacaggggccgccatcgtggccaatcaggccattccgctgcagccgccaccactgtaaagccagccaatggcacttcgtcttctacatcatcatcagtggtggggcttcgcagcactgtgtccgacagcctcactattgctcataatcagcagcaagcaacgagtccatctaatctttctgcctccaatacgctcagcaggatgttccttactaaagagaatgtaggtgagagaacgcaggatgcgacagccttgtccatgcttcgatccaccatggaccttaaatcgaaagaaactccattcgtcatatcaaaacagcagaactcatatggggaatccttacgaaatgagtttggacttgtcacctccgattccctcctcaatcactcacagaaaagctcatccttaatgagttgcagaaattttggatcgtctcaggacctcactaaccaggaatctgtttcacagcactccctccgccaattcatggatgattggcctaaaagtcagtctgatcgttctgctgtttcttggcctgaacttgatcagcaatctgagagaacccagctatcgatttcaatccccatggctcctgcagacttcatgtcatctacttcctccccaaacaatgaaaaagtcactctctccccattgagattatcacgagaatttgatccaatacagatgggactgggagtgggaggtggaggtggtagtattgccaacgaaccaaaccagaggcaagccaactggattcccatttcttggggaacatcaatgggtggtccgctcggggaggtcttgcacaacaccaataacaatgcagcagcagagtgcaagaccacgtcatcgctgaacctgatgacctatagatgggacaacagtcctcgtataggttcatctccaactggggttttacaaaagtcagcgtttgcttccctttcaaatagcagtgcgggaagcagcccaagagcagagaacaggaccaatgaaggtggcagtctctgcaatgacctccttggatcaactattgtgcattcttcttcattgcctgccatgtaa

实施例3ptgrf1/2d/mptgrf1/2d的表达蛋白

根据基因的核苷酸序列经软件预测得到ptgrf1/2d/mptgrf1/2d的表达蛋白氨基酸序列如序列表中序列3所示。

实施例4mptgrf1/2d基因植物表达载体构建

利用克隆技术构建mptgrf1/2d基因的过量表达载体。使用特异pcr引物(实施例1的ptgrf1/2dcds引物)，以银腺杨cdna为模板，进行pcr扩增，将ptgrf1/2d基因cds构建到入门载体。入门载体为pdnor222.1，序列如序列表中序列8所示。反应体系为freshpcrproduct80ng；pdnor222.1vector160ng；bpclonaseⅱenzymemix0.6μl；无菌ddh2o补足至5μl。反应程序为：25℃反应大于5h。

从筛选培养板上挑取阳性克隆进行pcr检测及测序验证，提取测序正确的阳性克隆质粒，并作为模板，使用突变引物(ptgrf1/2dcds正向突变引物和ptgrf1/2dcds反向突变引物)分别进行pcr扩增，将mptgrf1/2d基因构建到入门载体。将带有mptgrf1/2d基因的入门载体通过mlui限制性内切酶线性化后，与市场购买的植物表达载体pmdc32进行lr反应。反应体系为：linearizedentryclone75ng；purifieddestinationvector150ng；lrclonaseⅱenzymemix0.6μl；tebuffer(ph8.0)补足5μl。反应条件：25℃反应大于5h。lr反应后，mptgrf1/2d基因导入植物表达载体pmdc32中，在mptgrf1/2d基因的5’端组装组成型强表达启动子p35s，能使不被mir396降解的mptgrf1/2d基因在杨树体内高效表达；在mptgrf1/2d基因的3’端组装有强终止子nos，可有效终止mptgrf1/2d基因的转录，如图1所示，为植物表达载体pmdc32-mptgrf1/2d的结构示意图。

在载体上组装潮霉素磷酸转移酶hpt，作为转基因杨树的筛选标记，可以用潮霉素进行转基因杨树的筛选。在载体上组装lb和rb序列，促使组装于其间的mptrgrf1/2d基因表达框架和筛选标记基因hpt整合至杨树受体染色体中。通过pcr检测及测序验证，确认过量表达载体构建成功，命名为pmdc32-mptgrf1/2d。该基因位于启动子p35s之后，在启动子p35s的驱动下，不被mir396降解的mptgrf1/2d基因可在杨树体内高效表达。

实施例5mptgrf1/2d基因的遗传转化

通过电击法将所构建的pmdc32-mptgrf1/2d过量表达载体转入农杆菌gv-3101中，通过农杆菌介导将mptgrf1/2d基因转入杨树，转化步骤如下：用于遗传转化的银腺杨组培苗在培养温度为23-25℃、光照为16/8h(白天/黑夜)、光照强度为50μm·m^-2·s^-1的条件下培养。含有pmdc32-mptgrf1/2d表达载体的农杆菌gv-3101在od600＝0.6～0.8时侵染银腺杨叶盘。侵染后的叶盘在不定芽诱导培养基sim(murashige-skoog(ms)基本培养基添加0.5mg/l6-benzylaminopurine(6-ba)和0.05mg/lnaphthaleneaceticacid(naa))上，在温度为23±2℃的黑暗条件下共培养3天。共培养后的叶盘转移至含有3mg/l潮霉素(hygromycin)b和200mg/l替门汀(timentin)的sim上，在培养温度为23-25℃、光照为16/8h(白天/黑夜)、光照强度为50μm·m^-2·s^-1的条件下诱导和筛选抗性不定芽。经过约30天的诱导培养，将抗性不定芽转移至含有3mg/lhygromycinb和200mg/ltimentin的生根培养基中(rim，1/2ms基本培养基添加0.05mg/liba和0.02mg/lnaa)，直至诱导出不定根。提取已生根植株叶片dna，pcr验证。

实施例6mptgrf1/2d基因的应用

利用农杆菌介导的叶盘法(liuetal.,2014a)对84k杨进行遗传转化。用于遗传转化的84k杨组培苗在温度为23-26℃、光照条件为16h光照/8h黑暗、光照强度为50μm·m^-2·s^-1的培养室培养。用含有35s:ptgrf1/2d且od600＝0.6-0.8的农杆菌侵染84k杨叶盘法。侵染后的叶盘在不定芽诱导培养基sim，即murashige-skoog(ms)基本培养基添加0.5mg/l6-ba(6-benzylaminopurine)和0.05mg/lnaa(naphthaleneaceticacid)的培养基上，于24±2℃的温度条件下黑暗培养3天。暗培养后的叶盘转移至含有200mg/l特美汀(timentin)和3mg/l潮霉素b(hygromycinb)的sim培养基上，在培养温度为23-26℃、光照条件为16h光照/8h黑暗以及光照强度为50μm·m^-2·s^-1的条件下诱导并筛选抗性不定芽。经过大约一个月的诱导筛选培养后，即可将抗性不定芽转移至含有200mg/l特美汀(timentin)和3mg/l潮霉素b(hygromycinb)的rim生根培养基(1/2ms基本培养基添加0.05mg/liba和0.02mg/lnaa)中，直至诱导出不定根，得到过量表达mptgrf1/2d的转基因银腺杨，分别选择#20转基因银腺杨和#23转基因银腺杨植株。

扦插6个月的对照组未转基因银腺杨(ck)、#20转基因银腺杨和#23转基因银腺杨植株，即扦插后在组培瓶中生长1个月，再移栽至有营养土的种植盆中生长5个月。

实验结果如图2-1和图2-2所示，为未转基因银腺杨和本发明过量表达mptgrf1/2d的转基因银腺杨的比较图，分别为扦插6个月后株系的植株(图2-1)及其叶片(图2-2)的比较图，采用普通的相机拍照；其中，图2-1从左至右、图2-2从上至下依次为未转基因银腺杨(ck)、转基因银腺杨#20、#23的照片。从图2-1和图2-2可以看出，与未转基因银腺杨(ck)相比，转基因银腺杨(#20、#23)的叶片明显更大，说明mptgrf1/2d基因促进叶片增大。

图3为本发明过量表达mptgrf1/2d的转基因杨树的转录水平定量检测图，用1个月左右的组培苗作材料，提取rna并进行反转录，用sybrpremixextaqtmkit(takara)试剂盒，以actin基因为内参，用lightcycler480(roche)实时定量仪器完成)，图中柱形图显示mptgrf1/2d基因分别在未转基因银腺杨(ck)和转基因银腺杨(#20、#23)(为过量表达mptgrf1/2d的转基因杨树的2个株系)中的表达量。从图3可以看出，与未转基因银腺杨(ck)相比，转基因银腺杨(#20、#23)的mrna的水平明显更高。

图4是本发明测量的过量表达mptgrf1/2d的转基因杨树的叶面积图，将叶片扫描成图片，利用imagej软件测量得到。

从图4可以看出，与未转基因银腺杨(ck)相比，转基因银腺杨(#20、#23)的mrna的水平明显更高。

从结果可以看出，本发明通过将mptgrf1/2d基因转入杨树，过量表达mptgrf1/2d的转基因银腺杨与未转基因银腺杨比较，叶片明显变大，说明ptgrf-1/2d基因是调控杨树叶片发育的关键调节基因，在林木基因工程领域有重要应用价值。

本发明以银腺杨为材料，克隆了ptgrf1/2d基因(序列1)，并对其mir396靶位点核苷酸进行6个碱基的同义突变，获得突变形式的ptgrf1/2d(mptgrf1/2d，序列2)；同时，构建过量表达载体pmdc32-mptgrf1/2d，该基因位于启动子p35s之后，在启动子p35s的驱动下，mptgrf1/2d可在杨树体内不被mir396降解而高效表达，从而调控杨树叶片的发育。

sequencelisting

<110>中国林业科学研究院林业研究所

<120>一种调控杨树叶片发育的生长调节因子基因及其应用

<130>

<160>9

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1830

<212>dna

<213>生长调节因子ptgrf1/2d

<400>1

atggattttggggttcaggtgggtttggatgggttggtgggttcagacacaagtaatagt60

ggttttgcttctcttgctagctcagatcctgaagcaaagcagaagttgtacggatctggg120

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<213>突变形式mptgrf1/2d

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