技术领域：
本发明涉及用豌豆蛋白废水发酵生产聚谷氨酸的培养基、菌株及方法，属于生物工程发酵技术领域。
背景技术：
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豌豆是制取粉丝用淀粉的主要豆类产品之一，含有丰富的淀粉、蛋白质和膳食纤维。在我国，除少量豌豆用来直接食用外，约98%的豌豆用来加工成淀粉、蛋白和生产粉丝。无论是传统的“酸浆法”豌豆淀粉生产工艺，还是现代的豌豆蛋白、豌豆淀粉生产工艺过程中都会产生大量废水，造成严重的环境污染。目前我国豌豆粉丝生产企业中，每生产一吨豌豆粉丝会产生13-15吨废水，而“粉丝之都”招远每年产生的粉丝废水高达600万吨。这些废水中含有丰富的蛋白质，膳食纤维，低聚糖等多种营养物质，COD、BOD、SS等指标特别高，此类污水治理难度非常大，投入成本很高，同时造成了资源的严重浪费。
聚谷氨酸作为一种新型功能性肥料，可以改良土壤环境、修复污染土壤、增强化肥农药效果，市场前景广阔。
聚谷氨酸的合成方式主要有：化学合成法、固体发酵法和液体发酵法。化学合成法工艺复杂，副产物多，很难得到纯度较高的产品，没有工业应用价值。固体发酵法产量低且不稳定，不利于工业化生产，已经逐渐退出历史舞台。目前，利用微生物发酵生产聚谷氨酸的研究十分活跃，但生产上培养基原料成本高、产量低，导致其销售价格高，严重制约了其在肥料领域的应用，急需开发新的生产工艺技术，降低其生产成本，扩大市场应用范围。
技术实现要素：
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本发明的目的在于提供一种利用豌豆蛋白废水采用微生物液体发酵生产聚谷氨酸的方法，该方法培养基原料成本低、操作简单、发酵周期短，产量高。
本发明的目的还在于提供一种针对于纳豆枯草芽孢杆菌液体发酵生产聚谷氨酸的液体发酵培养基。
本发明的技术方案：本发明用豌豆蛋白废水发酵生产聚谷氨酸的菌株为纳豆枯草芽孢杆菌，保藏名称为：Bacillus subtilis LD-9308，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.13465，保藏日期：2016年12月19日。保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
用豌豆蛋白废水发酵生产聚谷氨酸的发酵培养基，其特征在于其组分(g/L)为：葡萄糖10-30，谷氨酸或谷氨酸钠 30-50，硫酸铵20-40，磷酸氢二钾1-3，余量为豌豆蛋白废水，pH 6.5-7.5。
用豌豆蛋白废水发酵生产聚谷氨酸的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）菌种活化：
采用斜面培养基对保存的纳豆枯草芽孢杆菌种进行活化，菌种活化用的斜面培养基为固体LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，琼脂粉15，余量水，pH 7.0-7.5；
在斜面培养基上无菌操作，划线，置于37℃的培养箱内培养10-24小时，备用；
（2）摇瓶种子制备：
摇瓶种子培养基 (g/L)：葡萄糖10-20，蛋白胨 5-15，谷氨酸钠 5-10，酵母提取物3-5， KH2PO4 1-3，MgSO4 0.2-0.5，硫酸铵0.2-0.8，余量水，pH 6.5-7.5；
250ml三角瓶装液量为20-50ml，500ml三角瓶装液量为40-80ml，115℃灭菌20-30分钟；
在超净工作台上，无菌操作接种三角瓶培养基，每瓶接种一环上述活化后的菌种，置于恒温摇床37℃培养，摇床转速200-250 rpm，培养时间6-15小时；
（3）发酵种子罐液体菌种制备：
发酵罐种子培养基(g/L)：葡萄糖5-25，硫酸铵5-10，余量为豌豆蛋白废水，以氨水调节pH 6.5-7.5；
115℃灭菌30分钟，降温至38℃以下，接种摇瓶种子，接种量0.5%-2.0%（V/V）；
培养参数：温度37±1℃，搅拌转速150-250 rpm，通气量1：0.2-0.5,培养时间6-12小时；
（4）发酵培养：
发酵培养基(g/L)：葡萄糖10-30，谷氨酸或谷氨酸钠 30-50，硫酸铵20-40，磷酸氢二钾1-3，余量为豌豆蛋白废水，pH 6.5-7.5。
115℃灭菌30分钟，降温至38℃以下，接种种子罐液体菌种，接种量1%-3%（V/V）。
培养参数：温度37±1℃，搅拌转速150-250 rpm，通气量前10小时1：0.2-0.3,后期1：0.3-0.5,培养时间20-25小时，聚谷氨酸产量2.5-4.5%。
本发明同已有技术相比可产生如下积极效果：申请人通过多年的菌种选育工作，筛选到一株适合利用豌豆蛋白废水生产聚谷氨酸的纳豆枯草芽孢杆菌，经过发酵生产工艺优化，确定了生产工艺，生产工艺及产品具有高质量、低成本、环境效益突出的优势。本发明是利用豌豆蛋白废水进行聚谷氨酸发酵产品的高效合成，对豌豆蛋白废水进行高质化利用，在处理废水的同时还能够产生巨大的社会和经济效益。与其他方法相比，它具有成本低、产量大、提取率高、几乎没有环境破坏性等优势。本发明能够很好地解决掉工厂废液利用和资源循环问题。同时本生产技术获得的聚谷氨酸产品不仅创造收入，还能够为农业带来更多的利益。
具体实施方式：下面对本发明的具体实施方式做详细说明：
本发明用豌豆蛋白废水发酵生产聚谷氨酸的菌株为纳豆枯草芽孢杆菌，保藏名称为：Bacillus subtilis LD-9308，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.13465，保藏日期：2016年12月19日。
菌种选育、鉴定及培养条件优化：以自然菌种富集法制作纳豆，从拉丝好的纳豆制品中分离芽孢杆菌菌株。从分离纯化的685株菌中，筛选到一株聚谷氨酸产量高的菌株，首先按芽孢杆菌的要求进行了传统方法鉴定，包括形态学鉴定和生理生化鉴定，如革兰氏染色和芽孢染色，接触酶、甲基红、V-P 反应、硝酸盐培养基生长、糖发酵产酸、水解淀粉、明胶液化、卵磷脂酶、柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、形成吲哚、分解酪素等试验，表明为芽孢杆菌属。又进行了16S rDNA 的PCR 扩增、PCR 产物纯化和测序，利用Blast软件与基因库中已登录的16S rDNA序列进行同源性比较，菌株l6S rDNA与枯草芽孢杆菌的16s rDNA序列同源性达99.12% ，表明该菌株确为枯草芽孢杆菌。对该菌株的产生聚谷氨酸的培养条件进行了优化。菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
实施例1：用豌豆蛋白废水发酵生产聚谷氨酸的方法，其包括如下步骤：
（1）菌种活化：
采用斜面培养基对保存的纳豆枯草芽孢杆菌种进行活化，菌种活化用的斜面培养基为固体LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，琼脂粉15，余量水，pH 7.0；
在斜面培养基上无菌操作，划线，置于37℃的培养箱内培养10小时，备用。
（2）摇瓶种子制备：
摇瓶种子培养基 (g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，谷氨酸钠8，酵母提取物4， KH2PO4 2，MgSO4 0.3 ，硫酸铵0.5，余量水，pH 7；
250ml三角瓶装液量为35ml，500ml三角瓶装液量为60ml，115℃灭菌25分钟；
在超净工作台上，无菌操作接种三角瓶培养基，每瓶接种一环上述活化后的菌种，置于恒温摇床37℃培养，摇床转速220 rpm，培养时间12小时。
（3）发酵种子罐液体菌种制备：
发酵罐种子培养基(g/L)：葡萄糖15，硫酸铵8，余量为豌豆蛋白废水，以氨水调节pH 7；
115℃灭菌30分钟，降温至38℃以下，接种摇瓶种子，接种量1.0%（V/V）；
培养参数：温度37±1℃，搅拌转速150-250 rpm，通气量1：0.3,培养时间8小时。
（4）发酵培养：
发酵培养基(g/L)：葡萄糖20，谷氨酸或谷氨酸钠 40，硫酸铵30，磷酸氢二钾2，余量为豌豆蛋白废水，pH 7；
115℃灭菌30分钟，降温至38℃以下，接种种子罐液体菌种，接种量2%（V/V）。
培养参数：温度37±1℃，搅拌转速220 rpm，通气量前10小时1：0.25,后期1：0.4,培养时间23小时，聚谷氨酸产量4.5%。
实施例2：用豌豆蛋白废水发酵生产聚谷氨酸的方法，其包括如下步骤：
（1）菌种活化：
采用斜面培养基对保存的纳豆枯草芽孢杆菌种进行活化，菌种活化用的斜面培养基为固体LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，琼脂粉15，余量水，pH 7.2；
在斜面培养基上无菌操作，划线，置于37℃的培养箱内培养15小时，备用。
（2）摇瓶种子制备：
摇瓶种子培养基 (g/L)：葡萄糖10，蛋白胨5，谷氨酸钠 5，酵母提取物3， KH2PO4 1，MgSO4 0.2 ，硫酸铵0.2，余量水，pH 6.5；
250ml三角瓶装液量为20ml，500ml三角瓶装液量为40ml，115℃灭菌20分钟；
在超净工作台上，无菌操作接种三角瓶培养基，每瓶接种一环上述活化后的菌种，置于恒温摇床37℃培养，摇床转速200 rpm，培养时间6小时。
（3）发酵种子罐液体菌种制备：
发酵罐种子培养基(g/L)：葡萄糖5，硫酸铵5，余量为豌豆蛋白废水，以氨水调节pH 6.5；
115℃灭菌30分钟，降温至38℃以下，接种摇瓶种子，接种量0.5%（V/V）；
培养参数：温度37±1℃，搅拌转速150 rpm，通气量1：0.2,培养时间6小时。
（4）发酵培养：
发酵培养基(g/L)：葡萄糖10，谷氨酸或谷氨酸钠 30，硫酸铵20，磷酸氢二钾1，余量为豌豆蛋白废水，pH 6.5。
115℃灭菌30分钟，降温至38℃以下，接种种子罐液体菌种，接种量1%（V/V）。
培养参数：温度37±1℃，搅拌转速150 rpm，通气量前10小时1：0.2,后期1：0.3,培养时间20小时，聚谷氨酸产量3.5%。
实施例3：用豌豆蛋白废水发酵生产聚谷氨酸的方法，其包括如下步骤：
（1）菌种活化：
采用斜面培养基对保存的纳豆枯草芽孢杆菌种进行活化，菌种活化用的斜面培养基为固体LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，琼脂粉15，余量水，pH7.5；
在斜面培养基上无菌操作，划线，置于37℃的培养箱内培养24小时，备用。
（2）摇瓶种子制备：
摇瓶种子培养基 (g/L)：葡萄糖20，蛋白胨15，谷氨酸钠 10，酵母提取物5， KH2PO43，MgSO4 0.5，硫酸铵0.8，余量水，pH 7.5；
250ml三角瓶装液量为50ml，500ml三角瓶装液量为80ml，115℃灭菌30分钟；
在超净工作台上，无菌操作接种三角瓶培养基，每瓶接种一环上述活化后的菌种，置于恒温摇床37℃培养，摇床转速250 rpm，培养时间15小时。
（3）发酵种子罐液体菌种制备：
发酵罐种子培养基(g/L)：葡萄糖25，硫酸铵10，余量为豌豆蛋白废水，以氨水调节pH 7.5；
115℃灭菌30分钟，降温至38℃以下，接种摇瓶种子，接种量2.0%（V/V）；
培养参数：温度37±1℃，搅拌转速250 rpm，通气量1： 0.5,培养时间12小时。
（4）发酵培养：
发酵培养基(g/L)：葡萄糖30，谷氨酸或谷氨酸钠50，硫酸铵40，磷酸氢二钾3，余量为豌豆蛋白废水，pH 7.5。
115℃灭菌30分钟，降温至38℃以下，接种种子罐液体菌种，接种量3%（V/V）。
培养参数：温度37±1℃，搅拌转速250 rpm，通气量前10小时1： 0.3,后期1： 0.5,培养时间25小时，聚谷氨酸产量4.2%。
以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，其它优选实施方式在此不一一累述，且并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落于本发明的权利要求书确定的保护范围内。