一株善变副球菌菌株及其应用的制作方法

本发明涉及一株副球菌菌株，特别是涉及一种可在缺氧条件下利用硝酸盐作为电子受体氧化脱除沼气中硫化氢(H₂S)的善变副球菌菌株。

背景技术：

沼气是一种新兴的清洁可再生能源，以沼气为目标产物的厌氧发酵技术因其良好的能源、环境效益得到越来越广泛的应用，将对缓解我国能源危机，保护环境具有重要意义。沼气是一种生物原料经厌氧生物发酵转化产生的一种生物燃料，用于沼气厌氧发酵的生物原料主要包括畜禽粪便、秸秆、能源植物、生活垃圾、有机废水等废弃物。目前，我国沼气发酵主要原料为畜禽养殖场粪便和污水，由于畜禽粪便和污水中含有大量蛋白质和其它含硫化合物，经厌氧发酵转化，产生的沼气中含有H₂S气体成份。H₂S是一种腐蚀性很强的化合物，严重腐蚀管道设备，H₂S还具有极强的急性毒性，是一种神经性毒气，H₂S含量0.6mg/L时可使人在0.5-1h内致死，含量在1.2-2.8mg/L时可使人立即致死。同时，混有H₂S的沼气燃烧后，H₂S会转化为硫的氧化物释放到空气中，造成大气污染。因此，为了达到安全利用沼气能源和保护环境的目标，必须在使用前对沼气进行脱硫处理。

目前，沼气脱除H₂S的方法主要包括物化法和生物法。物化法脱除H₂S需要大量的化学药剂和较高的能耗，还要对吸附剂或吸收剂进行处置，费用较高，存在二次污染。在生物脱硫法中，具有高效生物氧化H₂S的功能微生物菌种是脱硫能否实现的关键。根据微生物的代谢类型，能够将H₂S(或硫化物)转化为单质硫或硫酸盐的微生物可分为两大类：①光能自养型硫细菌；②化能自养型无色硫细菌。光能自养型微生物在去除H₂S的过程中,虽有较高的H₂S去除率和厌氧条件下无安全隐患等优点，但需要大量的辐射能，其经济成本较高，且容易受光源的限制。故化能自养型微生物成为生物去除沼气H₂S的较好选择，在有氧存在条件下，化能自养微生物利用氧气作为电子受体，但氧气的调控比较困难，供氧过多时存在爆炸隐患，同时供氧的同时会引入氮气等其它惰性气体，降低了沼气中甲烷的浓度，降低了沼气的能量效率。而在缺氧条件下，利用氧气以外的硝酸盐等其它备选电子受体，可实现温和条件下的H₂S脱除。因此，在缺氧条件下，以硝酸盐作为电子受体，替代氧气作为电子受体的沼气生物脱硫研究成为热点，可有效避免氧气和沼气混合引起的安全隐患以及加氧而引入氮气对沼气能量效率的降低，为我国沼气脱硫提供了一条新的技术途径。

以硝酸盐作为电子受体进行沼气生物脱硫的核心是高效功能微生物菌株，因此，高效专性功能菌株的获得直接关系到脱硫系统能否构建成功，通过分离筛选高效专性功能菌株再接种于脱硫反应器中，可构建以专性功能菌株为生物催化剂、硝酸盐为电子受体的沼气生物脱硫系统。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种能够以硝酸盐作为电子受体脱除沼气中H₂S的副球菌菌株，该菌株可以作为脱硫微生物接种于脱硫反应器中并有良好的脱硫效果。

为实现上述目的，本发明提供善变副球菌(Paracoccus versutus)2#CGMCC No.13321，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101；保藏日期2016年11月18日，保藏编号CGMCC No.13321。

善变副球菌菌株CGMCC No.13321采自四川某污水处理厂厌氧污泥。将采集的污泥在厌氧条件下用含硫化合物的富集培养基进行驯化，7d后进行梯度稀释，从10^-2、10^-4、10^-6、10^-8、10^-10稀释度下吸取0.1ml于分离培养基平板涂布，30℃厌氧恒温培养，经多次分离后获得的该菌株。其中富集培养基：Na₂S₂O₃·5H₂O 5g、KNO₃ 4g、KH₂PO₄ 2g、NaHCO₃ 1g、MgCl₂·6H₂O 0.5g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、pH值7.0、自来水1000mL。121℃，30min高温灭菌处理。分离培养基：Na₂S₂O₃·5H₂O 10g、KNO₃ 4g、KH₂PO₄ 2g、NaHCO₃ 1g、MgCl₂·6H₂O 0.5g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、琼脂20g、自来水1000mL、pH7.0-7.5。121℃,30min高温灭菌处理。

本发明的菌株在显微镜下观察，菌株细胞短杆状，较小；菌落白色凸起,边缘整齐光滑，表面湿润，平板培养基菌落形态见图1，显微镜放大1000倍的菌体形态见图2。经生理生化鉴定为革兰氏阴性菌。菌株不耐盐，不能利用柠檬酸盐；当硝酸盐、亚硝酸盐或氧化氮存在时，能以它们为电子受体营厌氧生长。菌株可在15-45℃范围生长，最适生长温度30-35℃；可在pH7.0-7.5范围内生长，最适生长pH7.0。

善变副球菌菌株CGMCC No.13321的固体活化培养基组分为：Na₂S₂O₃·5H₂O 10g、KNO₃ 4g、KH₂PO₄ 2g、NaHCO₃ 1g、MgCl₂·6H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g、琼脂20g，蒸馏水1000mL,pH7.0-7.5，121℃,30min高温灭菌处理。

善变副球菌菌株CGMCC No.13321的液体发酵培养基组分为：Na₂S₂O₃·5H₂O 10g、KNO₃ 4g、KH₂PO₄ 2g、NaHCO₃ 1g、自来水1000ml、pH7.0-7.5，121℃、30min高温灭菌处理。

善变副球菌菌株CGMCC No.13321的脱硫培养基组分为：KNO₃ 4g、KH₂PO₄ 1g、NaHCO₃ 1g、自来水1000ml、pH7.0-7.5，121℃、30min高温灭菌处理。

本发明还提供了善变副球菌菌株CGMCC No.13321以硝酸盐为电子受体在沼气脱硫中的应用。将经活化培养与扩大培养的善变副球菌菌株CGMCC No.13321的菌液接种到含硝酸盐的脱硫反应器中，连续通入沼气，能够显著降低沼气中的H₂S浓度。

善变副球菌菌株CGMCC No.13321应用于沼气脱硫的技术原理在于善变副球菌菌株CGMCC No.13321接种至脱硫反应器后，可以在反应器中以硝酸盐作为电子受体对H₂S进行生物氧化，并进行生长繁殖，达到沼气中H₂S脱除的目的。

本发明中善变副球菌菌株CGMCC No.13321的使用方法：

(1)使用前用固体活化培养基进行活化；

(2)将灭菌处理过的液体发酵培养基定量备用；

(3)将活化后的菌种分别接种至灭菌处理过的液体发酵培养基培养，静止培养1d-3d；

(4)将菌液按10％比例接种于装有灭菌处理过的脱硫培养基的反应器中；

(5)通入沼气，开始以小流量通入，以后流量逐渐增大，开始进行沼气H₂S脱除处理。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)提供了新的沼气脱硫菌株：善变副球菌菌株CGMCC No.13321；

(2)善变副球菌菌株CGMCC No.13321从四川省某污水处理厂厌氧污泥中筛选得到，不会对周围环境和生态平衡造成危害，符合生态安全法规；

(3)善变副球菌菌株CGMCC No.13321具有自养反硝化能力，能够在没有有机物存在的条件下快速生长，将硝酸盐还原成氮气，将硫化氢氧化为硫单质或硫酸盐。这一特性利于通过外源培养后用于强化对沼气硫化氢的去除效率；

(4)善变副球菌菌株CGMCC No.13321能够在厌氧条件以硝酸盐作为电子受体去除沼气中的H₂S，有效避免了传统以氧气作为电子受体进行沼气H₂S脱除时引入甲烷与氧气混合所带来的安全隐患；

(5)善变副球菌菌株CGMCC No.13321以硝酸盐作为电子受体，对沼气中H₂S的去除率高达93.8％。

说明书附图

图1是善变副球菌菌株CGMCC No.13321在平板培养基中的菌落形态；

图2是善变副球菌菌株CGMCC No.13321经显微镜放大1000倍的菌体形态。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术内容作进一步描述。

实施例一

1、菌株分离纯化

取四川成都市第三污水处理厂厌氧污泥。将采集的污泥在厌氧条件下用含硫化合物的富集培养基进行驯化，7d后进行梯度稀释，从10^-2、10^-4、10^-6、10^-8、10^-10稀释度下吸取0.1ml于分离培养基平板涂布，在平板表面出现分散的单个菌落，挑取单个菌落，重复以上操作数次，最终获得能够以硝酸盐作为电子受体脱除沼气中H₂S的纯化菌株。

其中富集培养基为：Na₂S₂O₃·5H₂O 5g、KNO₃ 4g、KH₂PO₄ 2g、NaHCO₃ 1g、MgCl₂·6H₂O 0.5g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、pH值7.0、自来水1000mL。121℃，30min高温灭菌处理。分离培养基：Na₂S₂O₃·5H₂O 10g、KNO₃ 4g、KH₂PO₄ 2g、NaHCO₃ 1g、MgCl₂·6H₂O 0.5g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、琼脂20g、自来水1000mL、pH7.0-7.5。121℃，30min高温灭菌处理。

2、菌株形态特征和生理生化特性的鉴定

本发明菌株在显微镜下观察，菌株细胞短杆状，较小；菌落白色凸起,边缘整齐光滑，表面湿润，平板培养基菌落形态见图1，显微镜放大1000倍的菌体形态见图2。经生理生化鉴定为革兰氏阴性菌。菌株不耐盐，不能利用柠檬酸盐；当硝酸盐、亚硝酸盐或氧化氮存在时，能以它们为电子受体营厌氧生长。菌株可在15-45℃范围生长，最适生长温度30-35℃；可在pH7.0-7.5范围内生长，最适生长pH7.0。

3、16SrDNA序列分析鉴定

①首先用购买于天根生化科技(北京)有限公司的DP302细菌试剂盒提取纯化菌株的总DNA。

②以通用引物27F/1492R进行16SrDNA序列扩增，扩增的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度，当紫外投射灯下观察到和marker相对应位置的清晰条带时，初步判断扩增的PCR产物浓度合格；当OD260/OD280比值应为1.7-1.9时，表明扩增的PCR产物纯度合格。

③浓度和纯度都合格的条件下，对扩增的PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司专业测序公司进行测序分析。将测序得到的16S rDNA序列在NCBI上进行Blast比对，获知与善变副球菌(Paracoccus versutus)的序列同源性高达98％以上,确定纯化菌株的分类学地位。其16S rDNA序列如下：

GCGCACCTTCGGGTGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATATGCCCTTTGGTACGGAATAGTCCTGGGAAACTGGGGGTAATACCGTATGCGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGCCAAAGGATTAGCCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGCCGACGATCCATAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTAGACAATGGGGGCAACCCTGATCTAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCAGCTGGGAAGATAATGACGGTACCAGCAGAAGAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGACCGGAAAGTTGGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCTTCAAAACTATCGGTCTGGAGTTCGAGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAATGCTGGTTAGCGCACGGCCGTCGGGTAGACCCAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGTTCCGCGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGATGGCTTTTGGGGATTAACCCACTGTCACCACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAACCCGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCACACCTTCCTCCGACTTATCATCGGCAGTTCTTCCAGAGTGCCCAACCAAATGATGGCAACTGGAAGTGTGGGTTGCGCTCGTTGCCGGACTTAACCGAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCCAGGTCACCGAAGTGAAAGACCCGTCTCCGGGCCGGTCCTGGGATGTCAAGGGTTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATCCGTTAGGT

4、纯化菌株的种名确定

综合纯化菌株形态特征、生理生化特性和16SrDNA序列分析，确定该纯化菌株为善变副球菌(Paracoccus versutus)。

菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101；保藏日期2016年11月18日，保藏编号CGMCC No.13321。

实施例二

本发明善变副球菌菌株CGMCC No.13321应用于沼气中H₂S脱除。

1、培养基及接种菌液制备

固体活化培养基：Na₂S₂O₃·5H₂O 10g、KNO₃ 4g、KH₂PO₄ 2g、NaHCO₃ 1g、MgCl₂·6H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g、琼脂20g，蒸馏水1000mL,pH7.0-7.5，121℃,30min高温灭菌处理。液体发酵培养基：Na₂S₂O₃·5H₂O 10g、KNO₃ 4g、KH₂PO₄ 2g、NaHCO₃ 1g、自来水1000ml、pH7.0-7.5，121℃、30min高温灭菌处理。脱硫培养基：KNO₃ 4g、KH₂PO₄ 1g、NaHCO₃ 1g、自来水1000ml、pH7.0-7.5，121℃、30min高温灭菌处理。

将善变副球菌菌株CGMCC No.13321接种到固体活化培养基中，活化培养1d得活化菌种，待用；将活化的菌种接入液体发酵培养基中，30℃下静止培养1d-3d得接种菌液(菌液浓度10⁷-10⁸CFU/ml)，待用。

2、沼气中H₂S脱除处理

将接种菌液按10％的比例接种至装有250mL的脱硫培养基的反应器中；同时做不加接种菌液的对照，每组实验设置三个重复，恒温30℃连续通入沼气，其中沼气中H₂S的浓度为2000ppm。连续测定沼气中H₂S的去除率，测定结果见表1。

表1沼气H₂S的去除率

由上表可知，温度为30℃，接种善变副球菌菌株CGMCC No.13321实验组中的沼气H₂S浓度比对照组明显降低，其中对照组沼气H₂S的去除率仅为17.4％，而实验组沼气H₂S的去除率高达92.2％。

实施例三

善变副球菌菌株CGMCC No.13321用于沼气H₂S脱除，其与实施例三相同之处不再重复，其不同之处在于接种菌液至脱硫反应器的处理条件。

处理温度20℃，连续测定沼气中H₂S的去除率，测定结果见表2。

表2沼气H₂S的去除率

由上表可知，温度为20℃，接种善变副球菌菌株CGMCC No.13321实验组中的沼气H₂S浓度比对照组明显降低，其中对照组沼气H₂S的去除率仅为6.2％，而实验组沼气H₂S的去除率高达77.1％。与温度条件30℃相比，虽然善变副球菌菌株CGMCC No.13321对沼气H₂S的去除率下降，但依然表现出较好的H₂S脱除效果。

实施例四

善变副球菌菌株CGMCC No.13321用于沼气H₂S脱除，其与实施例三相同之处不再重复，其不同之处在于通入沼气中的H₂S浓度。

恒温30℃连续通入沼气，其中沼气中H₂S的浓度为3000ppm。连续测定沼气中H₂S的去除率，测定结果见表2。

表2沼气H₂S的去除率

由上表可知，接种善变副球菌菌株CGMCC No.13321实验组中的沼气H₂S浓度比对照组明显降低，其中对照组沼气H₂S的去除率仅为11.6％，而实验组沼气H₂S的去除率高达88.6％。与通入沼气H₂S浓度为2000ppm相比，善变副球菌菌株CGMCC No.13321对沼气H₂S的去除率仅略微下降，依然表现出较好的H₂S脱除效果。

实施例五

善变副球菌菌株CGMCC No.13321用于沼气H₂S脱除，其与实施例三相同之处不再重复，其不同之处在于沼气中H₂S处理规模。

将接种菌液按10％的比例接种至装有10L的脱硫培养基的反应器中，连续测定沼气中H₂S的去除率，测定结果见表4。

表4沼气H₂S的去除率

由上表可知，接种善变副球菌菌株CGMCC No.13321实验组中的沼气H₂S浓度比对照组明显降低，其中对照组沼气H₂S的去除率仅为21.6％，而实验组沼气H₂S的去除率高达93.8％。说明处理规模放大后，善变副球菌菌株CGMCC No.13321依然表现出较好的H₂S脱除效果。

序列表

<110>中国科学院成都生物研究所

<120>一株善变副球菌菌株及其应用

<160>1

<210>1

<211>1142

<212>DNA

<213>善变副球菌(Paracoccus versutus)

<400>1

gcgcaccttc gggtgagcgg cggacgggtg agtaacgcgt gggaatatgc cctttggtac 60

ggaatagtcc tgggaaactg ggggtaatac cgtatgcgcc cttcggggga aagatttatc 120

gccaaaggat tagcccgcgt tggattaggt agttggtggg gtaatggcct accaagccga 180

cgatccatag ctggtttgag aggatgatca gccacactgg gactgagaca cggcccagac 240

tcctacggga ggcagcagtg gggaatctta gacaatgggg gcaaccctga tctagccatg 300

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gtaccagcag aagaagcccc ggctaactcc gtgccagcag ccgcggtaat acggaggggg 420

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aggtgagtgg aattccgagt gtagaggtga atgctggtta gcgcacggcc gtcgggtaga 600

cccaactccc atggtgtgac gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc 660

atgctgttcc gcgattacta gcgattccaa cttcatgggg tcgagttgca gaccccaatc 720

cgaactgaga tggcttttgg ggattaaccc actgtcacca ccattgtagc acgtgtgtag 780

cccaacccgt aagggccatg aggacttgac gtcatccaca ccttcctccg acttatcatc 840

ggcagttctt ccagagtgcc caaccaaatg atggcaactg gaagtgtggg ttgcgctcgt 900

tgccggactt aaccgaacat ctcacgacac gagctgacga cagccatgca gcacctgtct 960

ccaggtcacc gaagtgaaag acccgtctcc gggccggtcc tgggatgtca agggttggta 1020

aggttctgcg cgttgcttcg aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc 1080

aattcctttg agttttaatc ttgcgaccgt actccccagg cggaatgctt aatccgttag 1140

gt 1142