本发明属于生物技术药物
技术领域：
：，尤其涉及一种适配体介导腺病毒靶向给药系统及其构建方法。
背景技术：
：：恶性肿瘤的传统治疗方法如手术和化疗，仍不能根治多数癌症。因肝癌具有高侵袭性和迁移性，因此，其诊断非常困难。肝癌的手术切除率通常低于15％，但术后复发率却高达50％。此外，虽然化疗对高度增殖的肿瘤细胞能发挥作用，并在开始治疗阶段缩小大部分肿瘤，但它并不能阻止因多药耐药所导致的肿瘤复发和转移。再者，由于缺乏针对肿瘤干细胞的特定靶向制剂，由传统化疗所引起的致命性毒性和副作用在所难免。目前，肿瘤的基因治疗得到了人们的广泛关注，而寻找一种合适的载体用于基因治疗，是非常关键的。但无论选择哪种载体，关键在于此载体在局部的表达效率。因为我们最终的目的是要在局部表达目的基因，并且使其具有一定的作用。虽然腺病毒感染效率高，几乎可达100％，但由于腺病毒具有免疫原性，易引起机体本身的免疫应答反应，因此，腺病毒在体内滞留时间较短，其基因表达在体内仅能维持1-2周，随着细胞传代，外源基因会逐渐丢失而不能长时间稳定表达。另外，腺病毒有较大的宿主范围，其组织分布的靶向性不强，因此到目前为止国内外进入临床研究的腺病毒基因治疗药物多采用局部(瘤内)注射的给药方式，以避免腺病毒系统分布导致的对正常细胞和组织的毒性等不良反应，然而，由于肿瘤具有浸润、转移的特性，局部给药只能作为一种辅助的治疗手段，不可能成为肿瘤药物治疗的主流。有研究表明携载抑癌基因pten的重组腺病毒ad5-pten能抑制肝癌，但由于上述腺病毒缺陷以及缺乏靶向性，使ad5-pten的应用受到了极大地限制。因此，对ad5-pten进行结构改造或修饰，并将其制成靶向制剂，以精准靶向肝癌细胞，促使药物聚集在肿瘤细胞，在彻底杀灭癌细胞的同时最大程度降低其毒副作用。靶向制剂中，适配体介导的靶向制剂受到了人们的普遍关注。适配体(aptamer)是一类由rna或单链dna寡核苷酸组成的小核酸分子，它对靶分子具有高特异性和高亲和力。因生物标志物的发现和aptamer的优点，aptamer技术在各生物医学领域得到了广泛发展，包括体外诊断领域，体内成像和靶向治疗等。尽管aptamer具有良好的靶向性能，但仍因其诸多缺点使适配体靶向制剂的临床应用受到了限制。一是aptamer自身固有的性质，如构象灵活性和核酸酶的稳定性等。aptamer主要通过形成二级或三级结构与靶标结合，这可能受到诸如温度、ph、离子强度等体内环境微小变化的影响。此外，靶分子在体内的构象可能会与体外有所不同，这种微小的变化可能会使aptamer无法正确识别靶分子，因而无法起到靶向作用。二是aptamer的化学稳定性。在血液中，aptamer会迅速被血清核酸酶降解，这极大地限制了aptamer在临床上的应用。除了上述自身特性，还存在与靶标结合的问题。虽然aptamer能够特异性结合不同的靶标，但只有aptamer与靶分子在特定条件下结合后，才能发挥靶向作用。在体内，aptamer要避免网状内皮系统和肾的清除聚集在肿瘤组织，通过与肿瘤细胞上的受体靶标结合后才能介导腺病毒药物颗粒进入肿瘤细胞。因此，在实际的研究中，可采用一定手段增强aptamer的体内稳定性和延长其循环时间。epcam在大多数实体瘤中过表达而在人类正常上皮组织中表达低，已被确认为肝癌的肿瘤干细胞表面标记物，如hepg2细胞。而pten能够降低上皮细胞粘附分子(epithelialcelladhesionmolecule，epcam)阳性肝癌的复发率。因此，本发明中我们创新性的使用epcam阳性的rna适配体epdt3修饰ad5-pten，成功构建了新的基因给药系统epdt3-peg-ad5-pten。此给药系统的构建中需解决以下几方面的关键问题：1)如何对ad5-pten进行修饰。一要确保目标物在保留ad5的感染能力的同时最大限度地提高ad5的血清抗体中和性能，从而延长药物的半衰期；二要降低腺病毒的免疫原性。2)如何对核酸适配体epdt3进行修饰，以增强其体内外的稳定性并延长其体内循环时间。3)寻找合适的连接剂。4)反应条件的摸索和合成流程的构建。epap是以双功能peg作为连接剂，通过酰胺键将ad5-pten与核酸适体epdt3结合而成，而在ad5-pten的聚乙二醇化过程中，peg两端的羧基都有可能被活化并与腺病毒反应而形成ad5-peg-ad5，最终将没有位置再连接适配体epdt3而得到目标产物epap。因此，为了解决这一问题，需要探索该反应的最佳条件，并从反应开始就严格控制反应物的比例。总之，此给药系统epdt3-peg-ad5-pten的成功构建，提高了ad5-pten的稳定性，显著增强了ad5-pten的抗肝癌活性的同时极大降低了毒副作用，有望成为肝癌临床治疗的新的基因靶向药物。技术实现要素：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种适配体介导腺病毒靶向给药系统及其构建方法。本发明是这样实现的，一种适配体介导腺病毒靶向给药系统，所述适配体介导腺病毒靶向给药系统以peg为连接臂，epdt3修饰的ad5-pten新基因给药系统epdt3-peg-ad5-pten。epdt3的3′末端以氨基修饰，即5′-gcgacugguuacccggucg-(ch2)6-nh2-3′(并作2′-氟嘧啶修饰)，5′末端以羧基荧光素(fam)进行标记。此给药系统中的rna适配体epdt3能特异性靶向epcam阳性肿瘤细胞，能有效增强pten基因对肝癌的生长抑制作用，同时降低药物对正常细胞和组织的毒副作用。本发明的另一目的在于提供一种所述适配体介导腺病毒靶向给药系统的制备方法，所述适配体介导腺病毒靶向给药系统的构建方法包括以下步骤：步骤一，对重组腺病毒进行扩增、纯化和滴度测定；步骤二，用双功能peg作为连接剂，利用酰胺反应原理，将peg先后与ad5-pten和epdt3偶联成epap，并通过sds-page电泳法确认peg-ad5-pten的偶联；步骤三，通过荧光强度检测法、粒径及zeta电位的测定和tbe-page电泳法鉴定epap的形成。进一步，所述适配体为rna适配体；采用epdt3为epcam阳性适配体；epdt3的3′末端以氨基修饰；即5′-gcgacugguuacccggucg-(ch2)6-nh2-3′；5′末端以fam进行荧光标记。进一步，所述适配体介导腺病毒靶向给药系统的构建方法包括以下步骤：第一步，重组腺病毒表面蛋白与peg偶联形成ad5-peg-pten。将100μln-羟基琥珀酰亚胺(nhs，3.75μm)和100μl碳二亚胺盐酸盐(edc，11.25μm)与100μlcooh-peg2000-cooh(1.5μm)水溶液混合均匀；以2-乙基磺酸(mes)缓冲液调节反应液的ph值至6.0，室温下轻柔搅拌，孵育1h以活化cooh-peg2000-cooh中的羧基；加入磷酸缓冲盐溶液(phosphatebuffersaline，pbs；100nmna3po4，150nmnacl，ph7.2)，将反应液的ph值调整到7.2，立即向其中加入100μlad5-pten(1.5μm)溶液，用蒸馏水定容到500μl；在37℃水浴中以300r/min反应2h，制得ad5-peg-pten粗产物；最后，用截留分子量为100kda的超滤离心管以5000g/min的转速超滤离心10min，如此重复洗涤离心四次，以去除小分子物质，得到精制的ad5-peg-pten；第二步，epdt3与ad5-peg-peg通过酰胺键偶联形成epap。取100μl浓度为3.75μm的精制ad5-peg-pten，加入100μl浓度为11.25μm的nhs和100μl浓度为33.75μm的edc，并混合均匀；以mes缓冲液(ph6.4)将混合物ph值调整至6.0，轻柔搅拌，25℃孵育1h以活化精制peg-ad5-pten中另一个未反应的羧基，加入100μlepdt3溶液(3.75μm)，以无rna酶水将反应液稀释至500μl；37℃水浴中轻柔搅拌，避光反应2.5h，制得epdt3-peg-ad5-pten粗产物；用截留分子量为100kda的超滤离心管以5500g/min，超滤离心10min，重复洗涤离心四次，以去除未反应的小分子物质，得到精制的目标给药系统。本发明的优点及积极效果为：以epdt3修饰携载抑癌基因磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphataseandtensintomologuegene，pten)的重组腺病毒(ad5-pten)制备一种新型基因靶向给药系统epdt3-peg-ad5-pten(epap)，克服ad5-pten的免疫原性强和靶向性低以及rna适配体epdt3的弱稳定性等缺点，延长药物的循环时间，增强药物的靶向性，并初步验证epap对hepg2肝癌的抑制作用；拟考察epap能否提高其血清稳定性和基因转染率，能否改变hepg2细胞的形态并抑制其增殖和迁移，能否抑制肿瘤增长并降低毒副作用。ad5-peg-pten经sds-page电泳确认而epap经荧光强度检测、粒径及zeta电位测定和tbe-page电泳鉴定后，以人胚肾细胞(humanembryonickidney，hek293)为模型，测定epap的血清稳定性；以epcam阳性的hepg2细胞和人正常肝细胞l-02为模型，分别给予生理盐水(saline)和用携载报告基因lacz的重组腺病毒，以与epap同样方法制得的epdt3-peg-ad5-lacz(epal)，评估epap的基因转染效率以及细胞摄取；分别给予epdt3、5-氟尿嘧啶(5-fu)、ad5-pten和三组不同剂量的epap，以观察hepg2的形态改变，并检测hepg2、epcam阴性的hek293细胞和l-02的细胞活力以及hepg2的迁移能力。随后，通过小鼠体内急性毒性实验对epap的毒副作用进行考察。最后，构建hepg2裸鼠异位瘤模型，对epap的组织摄取以及epap的抗肿瘤活性进行评价。结果：实验结果表明，ad5-pten的peg化效率为95.2±4.58％，epap的产率约80-90％，其粒径和zeta电位分别为98.26±2.85nm和-21.56±9.75mv。体外实验表明，epap的血清稳定性和基因转染效率均得到了极大提高；epap能特异性靶向hepg2肝癌细胞和肿瘤组织而对正常肝细胞没有靶向性，且hepg2细胞对epap的摄取明显高于l-02；epap能显著改变体外hepg2肝癌细胞的形态并降低其活力和迁移能力，而对hek293细胞和正常肝细胞的活力却无明显影响。体内急性毒性实验表明，高剂量epap(1.73×1010pfu/ml)对小鼠肝脏有轻微毒性，而低、中剂量epap对实验小鼠均无明显无毒副作用。epap能抑制裸鼠异位瘤的生长与分化。本发明成功构建了靶向基因给药系统epap，其在体内外均能特异性靶向epcam阳性肝癌细胞，并抑制其增殖和迁移，具有抗肿瘤活性，能抑制hepg2肝癌的生长和分化。低、中剂量的epap更适用于抗肝癌治疗，epap有望成为一种人肝癌临床基因治疗新药物。本发明的适配体是一种合成的单链寡核苷酸序列，epdt3的3′末端以氨基修饰，即5′-gcgacugguuacccggucg-(ch2)6-nh2-3′(并作2′-氟嘧啶修饰)，5′末端以羧基荧光素(fam)进行标记。此给药系统中的rna适配体epdt3能特异性靶向epcam阳性肿瘤细胞，能有效增强pten基因对肝癌的生长抑制作用，同时降低药物对正常细胞和组织的毒副作用；不仅可以折叠，也可与各种不同的配体高度亲和及特异性的结合，而且具有良好的清除率，无免疫原性和无毒性；能克服ad5-pten的无选择性和无特异性，增强其在血清中的稳定性，降低腺病毒对正常细胞和组织的毒性，并增强ad5-pten对人肝癌的抗肿瘤效应。附图说明图1是本发明实施例提供的适配体介导腺病毒靶向给药系统的构建方法流程图。图2是本发明实施例提供的质谱分析的报道单链epdt3适体示意图。图中：条件为:探针(esi)，锥(50v)desovation临时(350℃)，毛细管(3.00kv)，提取器(5v)，气体流量(3.5升/分钟)。图3是本发明实施例提供的通过sds-pade电泳检测peg-ad5-pten示意图。图中：(a)被考马斯亮蓝染色，(b)由0.1mol/l碘溶液染色；1～5分别代表标志，牛血清白蛋白bsa，ad5-pten和peg-ad5-pten。图4是本发明实施例提供的超滤前后epap滤液荧光强度比较示意图。图5是本发明实施例提供的epap由etbrtbe-page电泳染色示意图。图中1～4分别代表标志，核糖核酸适体epdt3，peg-ad5-pten和epap。图6是本发明实施例提供的转基因表达抑制测定中和结果示意图。图中：人血清稀释范围从1/10至1/20480；结果表示为相对转导效率。图7是本发明实施例提供的epal在hepg2和l-02细胞中的基因转染效率(a)和(b)细胞摄取(n＝3)示意图。图中：*p＜0.01，ad5-lacz组与epal组比较。图8是本发明实施例提供的hepg2细胞加入7组药物72h后的细胞形态(a)和各组药物抑制细胞hepg2(b)、hek293(c)和l-02(d)生长的mtt实验结果(n＝5)示意图。图中：*p<0.05，**p<0.01，pbs组与其他给药组比较；#p<0.05，##p<0.01，ad5-pten与epap高剂量组比较。图9是本发明实施例提供的体外划痕愈合实验(a和c)和transwell迁移实验(b和d)的hepg2细胞迁移抑制分析结果(n＝5)示意图。图中：*p＜0.05，**p＜0.01，pbs组与其他给药组比较。图10是本发明实施例提供的实验小鼠心、肝、肺和肾的病理切片h&e染色结果(放大200倍)示意图；图11是本发明实施例提供的不同给药组对hepg2异位瘤的抗肿瘤效应(n＝5)示意图。图中：(a)肿瘤体积变化图(mm3,从第21天起，*p<0.01)；(b)实验小鼠代表性肿瘤块；(c)瘤重(*p<0.05，**p<0.01，saline组与其他给药组比较)；(d)肿瘤转移的代表性小鼠；(e)和(f)分别为放大100倍和200倍的肿瘤病理切片。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。本发明实施例提供的适配体介导腺病毒靶向给药系统以peg为连接臂，开发出一种epdt3修饰的ad5-pten新基因给药系统epdt3-peg-ad5-pten(epap)。如图1所示，本发明实施例提供的适配体介导腺病毒靶向给药系统的构建方法包括以下步骤：s101：对重组腺病毒进行扩增、纯化和滴度测定，再用双功能peg作为连接剂；s102：利用酰胺反应原理，将peg先后与ad5-pten和epdt3偶联成epap，并通过sds-page电泳法确认peg-ad5-pten的偶联；s103：通过荧光强度检测法、粒径及zeta电位的测定和tbe-page电泳法鉴定epap的形成。下面结合实验对本发明的应用原理作进一步的描述。1主要实验试剂重组腺病毒ad5-pten-北京vgtc基因技术有限公司；重组腺病毒ad5-lacz-北京vgtc基因技术有限公司；epdt3适配体-上海吉玛制药技术有限公司合成；cooh-peg2000-cooh-北京键凯科技有限公司；n-羟基琥珀酰亚胺nhs-上海伊卡生物技术有限公司；碳化二亚胺盐酸盐edc-上海伊卡生物技术有限公司；蛋白质marker-美国thermo公司；牛血清白蛋白bsa-北京索莱宝科技技术有限公司；考马斯亮蓝染液-北京索莱宝科技技术有限公司；溴化乙锭etbr-美国amresco公司；dmem高糖培养基-美国gibco公司；胎牛血清-浙江天杭生物科技有限公司；x-gal-碧云天生物技术有限公司；β-半乳糖苷酶活性检测试剂盒-碧云天生物技术有限公司；dapi-北京方程生物科技有限公司；氟尿嘧啶-天津金耀药业有限公司；mtt-北京biosharp生物技术公司；其它试剂和化学药品均为分析纯-泸州科阳化学试剂公司。2主要实验仪器与设备移液枪-德国eppendrof公司；细胞培养板-美国corning公司；th4-200倒置光学显微镜-日本olympus公司；rf-5301荧光分光光度计-日本岛津公司；dhg-9240电热鼓风干燥箱-上海齐欣科学仪器有限公司；co2恒温培养箱-美国thermo公司；立式高温压力蒸汽灭菌器-上海申安医疗器械厂；cu-420电热恒温水槽-上海齐欣科学仪器有限公司；高速冷冻离心机-贺利氏集团公司；5702台式低速离心机-德国艾本德公司；fc104电子天平-上海精科天平厂；电泳仪-美国bio-rad公司；凝胶成像分析系统-美国bio-rad公司；kq3200型超声波清洗器-昆山市超声仪器有限公司；-80℃超低温冰箱-美国thermo公司；4℃/-20℃冰箱-midea公司；bhc-1300a2生物洁净安全柜-苏州智净净化设备有限公司；infinitem200全功能酶标仪-上海安景科技有限公司；激光共聚焦显微镜-美国hamamatsu公司；台式恒温振荡器-北京北方利辉设备有限公司；xw-80a涡旋混合器-海门市其林贝尔仪器有限公司；游标卡尺-北京亚中博克工具有限公司；ms300磁力搅拌器-上海上海潁特科技公司。3实验细胞和动物人胚肾细胞hek293，人肝癌细胞hepg2和人正常肝细胞l-02均购于中国科学院上海细胞库，并由本室保存。hepg2细胞和hek293细胞均用含10％胎牛血清的dmem培养基，l-02细胞用含10％胎牛血清的rpmi1640培养基，在37℃、5％co2培养箱中培养。人体细胞的所有实验均按西南医科大学人类细胞伦理委员会的原则进行。6～8周balb/c雌性裸小鼠(18～22g)购于成都达硕实验动物有限公司(中国成都，证书号scxk2015-030)。雌性昆明小鼠(～30g)，6～8周，购自西南医科大学实验动物中心(中国泸州，证书号syxk2013-065)。实验前，所有小鼠均适应性饲养至少5天。实验过程中，小鼠以5只/笼在恒定的湿度、温度和无病原体的条件下饲养。所有动物实验均严格按准则执行，并遵循《西南医科大学动物使用和管理委员会》协议(许可证编号20160141)。4实验方法4.1rna适配体序列设计及合成本发明选用的epdt3为epcam阳性适配体。epdt3的3′末端以氨基修饰，即5′-gcgacugguuacccggucg-(ch2)6-nh2-3′(并作2′-氟嘧啶修饰)，5′末端以fam进行荧光标记。适配体由上海吉玛制药有限公司采用固相化学法合成，产品经hplc纯化后再进行质谱鉴定。4.2重组腺病毒扩增、纯化、滴度测定4.2.1重组腺病毒的扩增用重组腺病毒ad5-pten感染hek293细胞，待细胞全部出现球型或葡萄样病变时，收集细胞先后于-20℃及37℃下快速冻融3次，使细胞破碎释放出病毒，于4℃下，5000rpm离心10min，收集含重组腺病毒的上清液，-80℃冰箱中保存备用。4.2.2重组腺病毒的纯化重组腺病毒的纯化采用氯化铯(cscl)密度梯度离心法，其中氯化铯密度分别为1.45g/ml和1.25g/ml。离心后收集cscl之间的乳白色病毒带，并将收集的病毒条带置于10mmtris-hcl(ph8)，2mm氯化镁，5％蔗糖的溶液中，于4℃条件下透析24h(截留分子量为25000)，期间每5h更换一次透析液，以除去氯化铯盐，收集纯化的重组腺病毒原液，分装保存于-80℃备用。4.2.3重组腺病毒滴度检测重组腺病毒滴度由细胞病变效应(cpe)法检测得到。将dmem培养液培养所得hek293细胞的密度调整至105个/ml，以100μl/孔接种于96孔板，然后于5％co2、37℃培养箱中培养至细胞长满。用培养液将病毒原液稀释成10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13、10-14共八个梯度的稀释度。吸出96孔板中原有的细胞培养液，于96孔板的每行12个孔中的10个孔中分别加入100μl同一病毒稀释液，其余两个孔不加病毒(作为阴性对照)，8行依次加入不同浓度梯度的病毒稀释液。于37℃、5％co2培养箱中培养，10天后，显微镜下观察每一行中出现cpe的孔数。病毒滴度由karber统计方法lgtcid50＝-[x+0.5d-ds]计算得到。其中，x为出现100％感染的最高稀释度的对数；d为稀释间隔倍数的对数；s为出现100％感染的最高稀释度开始的各个稀释度病变细胞比例之和。4.3目标给药系统epap的制备4.3.1重组腺病毒与peg偶联制备ad5-pten经rna适配体修饰的基因给药系统epap的制备过程包括两个部分。第一步是重组腺病毒表面蛋白与peg偶联形成ad5-peg-pten。首先,将100μln-羟基琥珀酰亚胺(nhs,3.75μm)和100μl碳二亚胺盐酸盐(edc,11.25μm)与100μlcooh-peg2000-cooh(1.5μm)水溶液混合均匀。以2-乙基磺酸(mes)缓冲液(ph6.4)调节反应液的ph值至6.0，室温下轻柔搅拌，孵育1h以活化cooh-peg2000-cooh中的羧基。加入pbs缓冲(100nmna3po4,150nmnacl,ph7.2)，将其ph值调整到7.2，立即向反应液中加入100μlad5溶液(1.5μm)，用蒸馏水定容到500μl。以300r/min搅拌，37℃水浴反应2h，制备得到ad5-peg-pten粗产物。最后，用截留分子量为100kda的超滤离心管以5000g/min，超滤离心10min，重复洗涤离心四次，以去除小分子物质后最终得到精制的ad5-peg-pten。4.3.2适配体与peg化的重组腺病毒的偶联epap制备的第二步是将epdt3与ad5-peg-pten通过酰胺键偶联形成epap。取100μl浓度为3.75μm的精制ad5-peg-pten，加入100μl浓度为11.25μm的nhs和100μl浓度为33.75μm的edc，并混合均匀。以mes缓冲液(ph6.4)将混合物ph值调整至6.0，轻柔搅拌，25℃孵育1h，以活化精制peg-ad5中另一个未反应的羧基。然后,加入100μlepdt3(3.75μm)溶液，以无rna酶水将反应液稀释至500μl。37℃下轻柔搅拌(300r/min)，避光反应2.5h，制备得到epdt3-peg-ad5-pten(epap)或epdt3-peg-ad5-lacz(epal)粗产物。最后，用截留分子量为100kda的超滤离心管以5500g/min，超滤离心10min，重复洗涤离心四次，以去除未反应的小分子物质，最终得到精制的目标给药系统epap或epal。4.4peg-ad5-pten与epap的鉴定4.4.1sds-page电泳鉴定peg-ad5本发明采用sds-page凝胶电泳法，以考马斯亮兰对蛋白质染色，以0.1mol/l碘溶液对peg染色来进行peg-ad5-pten合成情况的鉴定。以荧光检测、粒径测定和tbe-page电泳法来确认epap的合成，并评估其产率。4.4.2荧光强度检测法确认epap的形成epdt3适配体上修饰有羧基荧光素fam，其激发波长为492nm，发射波长为518nm。为进一步确认未反应的epdt3是否除尽，每次超滤离心后，立即用荧光分光光度计测定超滤离心管的外部滤液和内部样品的平均荧光强度(ex＝492nm；em＝518nm)，重复测量三次。当滤液的荧光强度几乎不能被检测到，而样品荧光强度值仍较高，且几乎不变时，说明游离epdt3已基本除尽，得到了较纯的目标产物epap。此外，将2.5nmol的epdt3标准品溶于1ml无rna酶水中，得到浓度为2.5×10-6mol/l的epdt3溶液，标为a液，并检测其荧光强度。然后，将a液稀释成一系列具有浓度梯度的epdt3稀释液，分别测定各梯度液的荧光强度，由此建立epdt3的荧光标准曲线。最后，结合epdt3反应前的荧光强度和反应后产物的荧光强度来计算epap的产率。4.4.3epap的粒径及zeta电位的测定通过马尔文激光粒度仪测定epap复合物的平均粒径及zeta电位。测量之前，用无rna酶水将样品按1:3(v/v)的比例稀释。常温下，在90°的固定角度下进行测定。每次测量时间为3min(n＝3)。通过比较裸ad5-pten和目标物epap的粒径和zeta电位差别来断定epap的制备是否成功。4.4.4tbe-page电泳鉴定epaptbe-page电泳检测前，准备好tbe缓冲液(89nmtris，89mm硼酸，2mmedta，ph8.3)和浓度为20％的page胶后，预电泳30min。将样品蛋白marker，epdt3，peg-ad5和epap分别与上样缓冲液以10：1(v/v)的比例混匀，将混合液置于95℃水浴中变性5min。于冰上冷却后立即取每种样品约10μg按上面的顺序加样。在80v恒定电压下电泳5h。电泳结束后，用5mg/ml的溴化乙锭溶液对凝胶块染色10分钟，之后用tbe缓冲液洗涤凝胶3次。在紫外光照下，用凝胶成像系统观察凝胶上各条带的确切位置并照相。4.5体外血清稳定性实验为了探索epap的血清稳定性，本发明将用报告基因lacz代替抑癌pten制得epal。本发明的人血清来自于健康志愿者西南医科大学的附属医院(泸州,中国)。使用前，咋西南医科大学伦理委员会的批准下，筛选具有最高滴度抗腺病毒抗体的血清。中和实验前一天，在96孔板中接种hek293(2×104cells/每孔)。56℃下，60分钟灭活血清中的补体。随后，用无血清dmem培养基倍比稀释血清，得到一系列梯度稀释液(稀释度从1/10到1/20480，终体积为200μl)。阴性对照孔不加血清，以使hek293细胞最大限度表达lacz基因。50μl样品，即裸ad5-lacz(moi20)组，epal(moi20)组，加到50μl无血清dmem培养基中，分别与对应的准备好的人血清一起37℃孵育1h。每个样品200μl感染hek293细胞，37℃孵育4h，以便于病毒吸附和感染。去除上清液，加入200μll新鲜的含10％新生牛血清的dmem培养液，于37℃，5％co2的孵箱中继续培养24h。通过x-gal染色法检测lacz基因表达。通过酶联免疫吸附实验测定其在490nm处的光密度。以未加人血清的阴性对照孔作为100％转染率，计算各实验组相对转染率。4.6epap在不同细胞中的基因转染效率检测基因转染实验在hepg2和l-02细胞中进行。将处于对数生长期的细胞以3×105个/ml的密度接种于24孔板中培养至细胞达到约70％的融合度。弃去原有培养基，用pbs洗涤3次。接下来，分别加入以无血清培养基配制所得的500μl含裸ad5-lacz(moi＝20)和epal(moi＝20)药物溶液。置于37℃，转染4h后，移除转染液，加入新鲜的完全培养液，置于37℃、5％co2培养箱内继续培养48h。本发明通过检测转染细胞中的总蛋白和β-半乳糖苷酶活性，可对β-半乳糖苷酶的表达进行定量分析，从而评估转染率。实验以piercebca蛋白分析法测定细胞裂解液总蛋白的含量，并用β-半乳糖苷酶分析系统测定β-半乳糖苷酶的活性。转染率以每微克总蛋白所含β-半乳糖苷酶的量(pg)来表示(pg/μg蛋白)。4.7目标给药系统的体内外摄取考察4.7.1目标给药系统的体外细胞摄取和共定位为了方便追踪epap的摄取，用alexa555对ad5-lacz进行红色荧光标记后与fam绿色荧光标记的epdt3反应制得epal。将对数生长期的hepg2和l-02细胞悬液浓度调整为7.5×104个/ml。将细胞爬片平铺于24孔培养板，每孔接种1ml细胞悬液，培养至细胞完全贴壁后，弃去原有培养基，分别加入500ml/孔生理盐水(saline)和epal(moi＝20)稀释液，继续培养2h。然后吸去原有药物培养液，用4％多聚甲醛将细胞固定15min，再用dapi染色5min，将染液吸除后用pbs充分洗涤。最后将细胞浸泡于少量pbs中，置于激光共聚焦显微镜下观察荧光在细胞中的位置并分析其强度。4.7.2目标给药系统的体内组织摄取为了考察epap在体内的组织摄取及靶向性，本发明用fam荧光标记的epdt3和携带lacz报告基因的ad5制得epal。用pbs重悬对数生长期的hepg2细胞，密度为5×107个/ml，取约0.2ml皮下接种于裸鼠右侧腋，以形成异位瘤。当肿瘤体积达到约300mm3，荷瘤balb/c小鼠(每组三只)分别一次性静脉注射0.2ml生理盐水或epap(4.32×109pfu/ml)。给药4h后，处死所有小鼠，收集正常肝脏和肿瘤组织。并立即制成冰冻切片(8μm)，用激光共聚焦观察其绿色荧光并拍照记录。4.8epap体外对癌细胞的抑制作用为考察epap对细胞形态的改变、对肿瘤细胞增殖和迁移的抑制作用以及对正常细胞的毒性作用，进行了细胞形态学观察实验、mtt实验、划痕愈合实验和transwell迁移实验。实验分组如下：a:pbs组；b:epdt3(200nm)；c:5-fu(20μg/ml)阳性对照组；d:裸ad5-pten(moi40)组；e:epap(moi20)低剂量组；f:epap(moi40)中剂量组；g:epap(moi80)高剂量组。4.8.1癌细胞形态学观察取2ml对数生长期的hepg2细胞以1×106个/孔接种于6孔板，培养过夜以达到～70％的融合度。移去原有培养液，分别加入各分组药物稀释液2ml，继续培养72h。在倒置显微镜下，放大200倍，观察细胞形态并拍照。4.8.2mtt实验检测细胞活力为定量评价epap的细胞抗肿瘤效果及对正常细胞的毒性，在epcam阳性的hepg2细胞、epcam阴的hek293细胞和人正常肝细胞l-02中进行了mtt实验。将密度为5×104个/ml的细胞悬液以100μl/孔接种于96孔板中。培养箱细胞达70-80％的融合时，除去原有培养基，分别加入各分组药物稀释液100μl/孔，继续分别培养24h、48h和72h。每组设置5个复孔。每孔加入5mg/ml的mtt溶液20μl(ph7.4)，避光轻轻振荡5min后，继续孵育4h，移去培养基，每孔加入150μl的dmso，轻轻振摇15min。用酶标仪测定各孔在595nm处的吸收值(abs值)，按如下公式计算细胞存活率：viability＝(abssample-absblank)/(abscontrol-absblank)×100％。4.8.3划痕愈合实验先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划条横线。对数增长期的epcam过表达hepg2细胞以1.0×106个/孔接种于6孔板，培养过夜待细胞完全贴壁并刚好铺满。用10μl枪头比着直尺，垂直于背后的横线划痕。吸除培养基，用pbs清洗3次，除划下的细胞，置于显微镜下拍照并记录划痕的宽度sw。每孔分别加入2ml含药物的细胞维持液。置于37℃、5％co2培养箱中，分别继续培养24h和48h后，再次置于显微镜下观察并拍照记录同一位置划痕的宽度sw。每组3个平行孔，实验重复3次，划痕愈合率(％)＝(划痕宽度0h-划痕宽度24h或48h)/划痕宽度0h×100％。4.8.4transwell迁移实验transwell迁移实验的目的是进一步考察epap对hepg2细胞迁移能力的影响。将100μl密度为1.16×106个/ml的细胞接种于transwell上室(8.0μm)，分别加入100μl含药物的饥饿培养基。下室加入500μl含20％(v/v)fbs的dmem培养基，作为化学引诱剂。为了更准确地对迁移细胞进行计数，培养24h后，用pbs清洗上室3次，并用棉签把上室上表面未迁移的细胞仔细擦掉。上室下表面的迁移细胞用4％甲醛固定25min后，用0.1％结晶紫染色10min，再用清水充分清洗。在倒置显微镜下，随机选取5个不同视野，计算每个视野下的平均迁移细胞数，并在200倍镜下拍照。4.9epap小鼠急性毒性实验为了考察epap在体内的潜在毒性并为接下来的体内抗肿瘤研究提供参考，给昆明小鼠单次大剂量静脉注射药物，之后观察epap在7天内对小鼠的毒性。选取35只健康小鼠按体重随机分为如下七组(n＝5)：a：生理盐水对照组；b：epdt3组(200nm)组；c：5-fu(125mg/kg)组；d：ad5-pten(8.64×109pfu/ml)组；e：epap低剂量组(4.32×109pfu/ml)；f：epap中剂量组(8.64×109pfu/ml)；g：epap高剂量组(1.73×1010u/ml)组。药物均溶于无菌生理盐水，注射体积均为200μl/只。给药前和给药后第3天、7天，从各组小鼠眼眶后静脉丛处采血，样本送西南医科大学附属医院进行血清肝肾功能检测，检测指标包括丙氨酸氨基转移酶(alt)，天门冬氨酸转氨酶(ast)，血尿素氮(bun)和血肌酐(cr)。实验期间所有小鼠自由饮水，给予普通饲料，每天测量体重并观察其饮食、尿液和粪便变化以及中毒和死亡情况，做好记录。给药后第7天结束实验，处死小鼠，迅速摘取心、肝、肺和肾，并观察其形态和色泽。这些脏器经生理盐水洗涤后用滤纸吸干称重,根据以下公式：脏器指数(％)＝脏器重量(g)/体重(g)×100％计算脏器指数。4％甲醛固定，石蜡包埋切片，脱蜡，he染色，制成病理切片，显微镜下观察，通过与正常组织的对比评价药物的毒性。4.10epap体内抗肿瘤活性实验4.10.1肿瘤模型的建立按体内组织摄取实验的方法接种肿瘤细胞。随后，通过在裸小鼠右侧皮下移植～50mg无坏死的肿瘤组织块将异位瘤传代3次。简言之，注射肿瘤细胞悬液约21天后，当肿瘤直径达约10mm时，处死小鼠并取出肿瘤块。之后，将新鲜肿瘤组织块在无菌生理盐水中剪成1-2mm3的小块，再将其接种到裸鼠背部右前方皮下。当肿瘤块达到100mm3时，即植入肿瘤块第12天时开始给药治疗。4.10.2药物剂量和给药方案肿瘤接种12天后，当肿瘤体积达到100mm3左右时，hepg2肝癌荷瘤小鼠随机分为七组，每组5只，按如下分组给药：a：生理盐水(对照)；b：epdt3200nm；c：5-fu25mg/kg(阳性对照)；d：nakedad5-pten2.16×109pfu/ml；e：epap1.08×109pfu/ml；f：epap2.16×109pfu/ml；g：epap4.32×109pfu/ml。每次治疗静脉注射0.2ml药物，每3天给药一次，共给药7次。4.10.3抗肿瘤活性评价与病理分析裸鼠体重及其hepg2异位瘤的体积测量从给药前开始，之后每3天给药一次，直到小鼠处死。用游标卡尺测量肿瘤的长和宽(l为长，w为宽)，同时测量小鼠体重。肿瘤体积(mm3)按1/2(lxw2)(mm)计算。抗肿瘤活性通过肿瘤生长抑制(tgi)评估，即第35天时，每个给药组(tg)相对生理盐水对照组(cg)的平均瘤重(mtw)，根据之前文献报道的公式：(mtwtg–mtwcg)÷mtwcg×100％计算结果。4.11统计学处理所有结果的比较和分析均采用spss17.0统计软件，实验数据均以表示。平均值之间的差异在不同的治疗组间进行分析用tukey-kramer多重比较测试单因素方差分析。p<0.05为具有统计学意义。显著性水平越高被设定为p<0.01。每个实验都至少独立重复操作3次，除非另有说明。结果1epdt3的质谱鉴定epdt3合成后，对其进行标准化纯化和质谱鉴定。如图2所示，合成产物的分子量约为7422kda。由此可知，纯化的产物正是所需要的适配体epdt3。2重组腺病毒滴度观察并计算每种浓度出现cpe现象的百分数，由karber统计方法lgtcid50＝-[x+0.5d-ds]计算得到重组腺病毒的滴度t为1.34×109.5ifu/ml(＝4.32×109pfu/ml)。3重组腺病毒成功地peg化基于考马斯亮蓝染色和碘染色的方法，未修饰peg的腺病毒蛋白能被考马斯亮蓝染色而不能被碘染色，而已修饰peg的腺病毒蛋白能被碘染色而不能被考马斯亮蓝染色。如图3所示，图3a为考马斯亮蓝染色结果，图3b为碘染色结果。图3b中，泳道1自上而下均为蛋白质marker(250kda，130kda，100kda，70kda，55kda)的条带；泳道2为牛血清白蛋白(bsa，～66kda)的条带；泳道3中130～250kda之间的条带为重组腺病毒ad5-pten(～200kda)的显色条带；泳道4中的peg-ad5-pten(～202kda)不显色。而图3b中，只有泳道4中的peg-ad5-pten显色，其余泳道均无现色带。由此可知，peg与ad5表面的衣壳蛋白成功地偶联耦合成peg-ad5。通过nihimagej软件分析可知peg-ad5-pten的产率为95.2±4.58％，这为下一步连接适配体奠定了基础。4目标给药系统epap合成的确认4.1荧光检测超滤前，样品的平均荧光强度为13582±324.18。如图4所示，随着超滤次数的增加，滤液的荧光强度逐渐减弱。第4次超滤时，滤液的荧光强度几乎不能被检测到，这提示只有极其微量的游离epdt3表1不同浓度的epdt3标准溶液及其对应的荧光强度(n＝3)table1differentconcentrationsofepdt3standardsolutionandtheircorrespondingfluorescenceintensity(n＝3)存在；而此时样品的荧光强度仍保持在4989±163.58的较高水平，这部分荧光应该来自目标复合物epap。此外，本研究中的epdt3经fam荧光修饰，其荧光强度与epdt3或epap的浓度呈线性关系，因此，可以通过检测滤液中的荧光强度变化来确定游离epdt3是否被超滤完全。一系列浓度的epdt3标准水溶液的荧光强度如表1所示，当浓度在1.9531×10-8-2.5×10-6mol/l范围时，epdt3的浓度和荧光强度才有正相关关系。选择epdt3溶液浓度在1.9531×10-8-2.5×10-6mol/l范围内的溶液荧光强度建立epdt3溶液的标准曲线，其回归方程为y＝2×109x+30.73(r2＝0.9996)。结合epdt3反应前的荧光强度和反应后产物的荧光强度，计算epap的产率为90.44±3.09％。4.2epap的粒径和zeta电位如表2所示，epap的平均粒径(98.26±2.85nm)与裸ad5-pten(92±3.22nm)比较，并没有显著的增加(p＞0.05)。但是，裸ad5-pten表面的zeta电位为-10.17±1.28mv，适配体epdt3的为-7.66±3.51mv，而epap表面的zeta电位则降为-21.56±9.75mv。由此可知，反应产物主要为epap。在储存过程中发现epap的zeta电位并未发生明显改变，这也许表明其具有较好的动力学稳定性。表2检测物的粒径分布及其zeta电位(n＝3)table2sizedistributionandzetapotentialoftestsample(n＝3)pdi(polydispersityindex)：多分散指数4.3tbe-page电泳基于溴化乙锭染色的方法，只有rna适配体epdt3和epdt3修饰物epap能被标记，而peg-ad5-pten不能被标记。由图5可知，marker(lane1)、epdt3(～7kda，lane2)和epap(～209kda,lane4)泳道有条带，而peg-ad5-pten(～200kda,lane3)泳道没有条带出现。此外，epdt3的条带比marker中10kda的条带要稍微低一点，而epap的条带在marker中130kda和250kda条带之间。结果表明目标给药系统epap的制备是成功的，且由nihimagej软件分析可知epap的产率为81.68±2.95％。5epap的血清稳定性由于血液循环中存在抗腺病毒抗体，腺病毒载体在体内的广泛应用受到了极大的挑战。中和抗体可影响腺病毒的转运及其功能的发挥。为了评价epap的血清稳定性，用lacz报告基因代替pten基因，通过转基因抑制法来检测ad5的中和作用。如图6所示，在与抗血清作用后，裸ad5-lacz和epal的转染效率均明显降低，即使稀释度为1：320，抗血清仍对裸ad5-lacz有完全的抑制作用，而对epal复合物的感染性影响有限。在60％的基因表达水平，epal(清稀释度为1：160)需要比裸ad5-lacz(稀释度为1：2560)浓度高出16倍的抗血清才能保持与ad5-pten相同的转导抑制作用。这一结果表明，epal能在一定程度上免受中和抗体的影响。6epdt3增强外源基因在epcam阳性细胞中的表达和摄取裸ad5-pten和epal转染后，hepg2和l-02细胞中lacz基因的表达水平如图7a所示。对epcam阳性hepg2细胞，经epal转染后，细胞中β-半乳糖苷酶的平均表达量为(1.26±0.15)×106pgβ-gal/μg蛋白，是裸ad5-pten转染(7.52±0.28)×104pgβ-gal/μg蛋白后的15倍多(p<0.01)。但对正常epcam阴性肝细胞l-02，ad5-pten和epal转染后的β-半乳糖苷酶的平均表达量分别为(5.94±0.36)×106和(6.35±0.44)×106pgβ-gal/μg蛋白pgβ-gal/μg蛋白，两者之间没有显著性差异(p>0.05)。这一结果表明，epdt3修饰的epap可提高腺病毒介导的pten基因在epcam阳性肝癌细胞中的表达，这可能是因为epdt3适配体能被相应的epcam受体所识别。如图7b所示，epal在hepg2细胞中的红色和绿色荧光强度均远强于正常l-02细胞。通过nihimagej图像软件分析可知，hepg2和l-02细胞对epal的摄取率分别为89.25±1.21％和8.02±1.52％。这一结果表明，适配体epdt3能够增强epcam过表达的hepg2细胞对epal的摄取，但不能增强人正常肝细胞l-02的。这一结论与基因转染的结果是一致的。另外，红色和绿色荧光在细胞中的位置相同，这表示epdt3和ad5-pten成功地连接成为了一个整体，这也说明了epap的制备是成功的。7目标给药系统epap的体内组织摄取量正常肝和肿瘤组织冰冻切片在激光共聚焦显微镜下的观察发现，生理盐水组的正常肝和肿瘤切片中均未检测到绿色荧光，而epap组的肿瘤组织切片中检测到强荧光而正常肝组织切片中未检测到。这一发现表明epap能够特异性地靶向epcam阳性hepg2肿瘤组织，而不能靶向正常肝组织。8目标给药系统epap改变肝癌细胞的形态并抑制其增殖8.1对细胞形态观察结果hepg2细胞经过7组药物作用72h后的形态变化见图8a。pbs对照组的细胞贴壁生长，呈梭形，排列整齐，边界清晰(8a-a)；epdt3组的细胞略有改变，细胞间隙也略有增大，轮廓也没有pbs组的清晰(8a-b)。其他五个给药组(8a-c-g)的细胞均出现不同程度的死亡，形态呈现不同程度的改变(变圆或变得不规则)，细胞间隙明显增大，边界变得模糊，其中5-fu(8a-c)和epap高剂量组(8a-g)表现最为突出。epap的3个浓度组的细胞均呈现类似地改变，即细胞形态先变成长梭形，然后变圆，呈网状聚集，且这种改变呈现浓度依耐性；而5-fu组的细胞则变圆，分散存在。epap的三个组和5-fu组的细胞形态变化存在本质上的区别，这表明epap和5-fu的作用机制肯定是不同的。8.2epap抑制hepg2细胞的增殖本通过mtt法进一步定量考察epap对hepg2、hek293和l-02细胞作用24h、48h和72h后的体外增殖抑制作用，其结果见图8b-d。对hepg2细胞(图8b)，和pbs组比较，给药48h和72h后，epdt3组具有一定的细胞增殖抑制作用(p<0.05)，而其余5个给药组都有较强的抑制效应。epap高剂量组(moi80)的抑制作用最强(p<0.05,p<0.01)；5-fu给药组如预期的那样，大大降低了细胞生存率(p<0.01)。与同浓度的裸ad5-pten(moi40)比较，给药48h和72h后，epap中剂量组(moi40)组的增殖抑制作用更强(p<0.05和p<0.01)。对hek293和l-02细胞(图8c，d)，只有5-fu治疗组对细胞增殖有抑制作用(p<0.05)，其余6组均无明显抑制效果，这一结果说明epap对hek293和l-02细胞均无明显毒性。基于上述结果，可以得出如下结论：第一，epdt3、裸ad5-pten和epap对epcam阴性hek293细胞的增殖没有明显抑制效应，且对正常肝细胞l-02也无明显毒性。其次，epdt3、ad5-pten和epap对epcam阳性hepg2细胞的有增殖抑制作用，其中，epdt3在48h和72h显示出较弱的抑制作用。相同剂量下，epap对hepg2细胞的抑制作用明显强于ad5-pten，这表明epdt3能增强ad5-pten的细胞增殖抑制作用。第三，5-fu降低所有细胞的存活率表明5-fu的细胞抑制作用没有选择性，而epap选择性抑制epcam阳性hepg2细胞的增殖说明epap对epcam阳性的hepg2细胞有靶向性，而对epcam阴性细胞没有靶向性。9epap抑制肝癌细胞的迁移早期的报道表明pten基因能够调节肿瘤细胞的扩散和迁移，抑制肿瘤细胞，并有促进细胞凋亡、抵抗转移和抗血管生成的特性。本研究通过划痕愈合实验和transwell迁移实验考察epap对高度侵袭性的hepg2细胞的迁移抑制作用。从图9a，c可以看出，给药后24h和48h后，pbs对照组的细胞划痕愈合率分别为37.89±0.72％和69.08±0.55％，与其他各给药组比较均有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)。epap对细胞迁移的抑制作用呈剂量依赖性(p＜0.05或p＜0.01)；与同浓度的裸ad5-pten比较，epap中剂量能显著抑制细胞迁移；epap高剂量组的细胞迁移抑制作用在这两个时间点均显著强于5-fu组。有趣的是，epdt3在200nm下也能抑制hepg2细胞的迁移(p＜0.05)，这与mtt在48h时的检测结果一致。而且，transwell迁移实验在给药后24h后得到与划痕实验类似的结果(图9b，d)。这两个实验的结果均表明epap对hepg2细胞的迁移抑制效应明显强于裸ad5-pten，这说明了适配体epdt3能够显著增强ad5-pten对人肝癌细胞的迁移抑制作用，且在一定浓度范围内，这种抑制效果具有剂量和时间依耐性。10epap小鼠急性毒性实验结果10.1小常规观察结果昆明小鼠体内的急性毒性实验发现，5-fu组小鼠饮食减少，平均体重也下降了5.28％，并且有2只小鼠在给药后第7天死亡(表3)。而其余六个处理组小鼠毛发、饮食及行为活动均无异常，生长良好，未出现中毒症状和死亡情况。其体重均呈平稳增长态势，给药后第7天其体重均升高了6-8％，但和生理盐水对照组比较无显著性差异(p＞0.05)。小鼠体重等常规观察显示一次性静脉注射高剂量epap(1.73×1010pfu/ml)对实验小鼠一般活动没有明显影响。10.2epap对小鼠脏器指数的影响脏器外观观察发现各给药组的心、肺、肾脏与生理盐水对照组比较均未见明显异常，只有ad5-pten(8.64×109pfu/ml)组和epap高剂量组(1.73×1010pfu/ml)的肝脏有轻微的水肿、肥大，颜色比生理盐水组的更淡。由表4可知，生理盐水对照组的肝脏系数为3.3±0.267％，ad5-pten(8.64×109pfu/ml)组和epap高剂量组(1.73×1010pfu/ml)的肝脏系数分别升高到了4.2±0.294％和4.6±0.354％(p<0.05)，但其余脏器系数的变化无统计学意义(p>0.05)，但浓度同样为8.64×109pfu/ml的epap组、epdt3(200nm)组和epap(4.32×109pfu/ml)组的心、肝、肺、肾的脏器系数均无明显变化(p>0.05)。结果表明，腺病毒peg化后能降低其毒性。结合各组脏器外观来看，目标复合物epap毒性的靶器官为肝脏，且浓度达1.73×1010pfu/ml时才可能对肝脏产生毒性。此外，5-fu(125mg/kg)组小鼠的心、肾脏系数较生理盐水对照组的均显著升高了，这提示5-fu对小鼠的心脏和肝脏可能都有毒性。表3试验小鼠的存活数和体重变化(n＝5)table3survivalandbodyweightchangeofthetestedmice(n＝3)**p<0.01，saline组与其他给药组比较表4实验小鼠的脏器系数(n＝3)table4visceraindexofthetreatedmice(n＝3)*p<0.05,salinegroupvstheothertreatedgroups.10.3epap对小鼠肝肾功能的影响由表5可知，与生理盐水对照组比较，在给药后第3天和第7天，ad5-pten(8.64×109pfu/ml)治疗组的alt和ast以及epap(1.73×1010pfu/ml)治疗组的ast均显著升高(p＜0.05)，这两组的bun和cr无明显变化(p>0.05)，而其余各给药组给药后第3d和第7d血清生化指标均无显著变化(p>0.05)。结果表明目标复合物epap对肾功能无明显毒性，但达到一定浓度时对小鼠的肝功能有损伤。10.4病理切片结果he染色病理切片由病理学家采取随机双盲原则进行观察。图10为各实验组小鼠的心、肝、肺和肾在给药后第7天的病理组织学代表图。如图10可知，与生理盐水对照组相比，5-fu组的心脏有明显病变：心肌轮廓不清、部分心肌细胞脂肪变性或横纹肌断裂消失；肾脏有轻微的病理变化，主要表现为肾小管部分血管扩张和充血，系膜细胞增殖和核染色加深。epap(1.73×1010pfu/ml)和ad5pten(8.64×109pfu/ml)组的肝脏组织均出现了轻微的病变，主要表现为肝细胞的轻度水肿、肝肿大、肝血窦狭窄和一些炎症细胞浸润。其余各组的心、肝、肺和肾脏结构均正常，未出现明显病变。心肌细胞排列紧密，边界清晰，心肌细胞胞浆红染；肝细胞形态正常，结构清晰，围绕中央静脉排列，肝血窦正常；肺泡及肺小动脉结构清晰正常；肾细胞数量正常、分布均匀，肾小球和肾小管结构清晰可见。表5检测小鼠的血清生化指标表4实验小鼠的脏器系数(n＝5)table5bloodbiochemicalparametersofserumfromthetestedmice(n＝5)*p<0.05,salinegroupvstheothertreatedgroups.以上小鼠急性毒性实验结果表明，epap(1.73×1010pfu/ml)和ad5pten(8.64×109pfu/ml)对小鼠的肝脏均有毒性，而epap(4.32×109pfu/ml和8.64×109pfu/ml)对小鼠没有明显毒性。因此，选取浓度为4.32×109pfu/ml和8.64×109pfu/ml的epap用于后续研究也许更合适，但这仍需要通过接下来的体内抗肿瘤活性实验进行确认。11epdt3增强epap的体内抗肿瘤活性11.1epap的肿瘤增长抑制作用因为体内急性毒性实验结果显示浓度为4.32×109和8.64×109pfu/ml的epap对实验小鼠没有副作用，因此本实验中，选择4.32×109pfu/ml作为高剂量epap。移植肿瘤块35天后，处死hepg2异位瘤裸鼠，相关结果如图11所示。图11a为不同药物对hepg2裸鼠异位瘤的抗肿瘤活性的曲线图。由图可知，epap显示出明显的抗肿瘤活性(与生理盐水组和5-fu组比较，p＜0.05或p＜0.01)，且呈剂量依耐性，其中，epap高剂量组(与生理盐水组比较，p＜0.01)的肿瘤生长抑制作用最强；在接种肿瘤后第21天(给药后第9天)时，中剂量epap组开始表现出比同浓度的ad5-ten组更高的抗肿瘤疗效(p＜0.05)。各组的肿瘤图(图11b)表明，与生理盐水对照组比较，其余各组均有显著性差异。肿瘤平均重量，epdt3200nm，5-fu25mg/kg，裸ad5-pten2.16×109pfu/ml，epap(1.08×109pfu/ml)，epap(2.16×109pfu/ml)，epap(4.32×109pfu/ml)各组对hepg2肿瘤的平均抑瘤率分别为14.3±6.6％、55.4±9％、50±6.3％、46.4±6％、69.6±5.5％，和87.5±2.9％。ad5pten(2.16×109pfu/ml)和epap(2.16×109pfu/ml)处理组之间的显著性(p＜0.05)表明，核酸适配体epdt3对肿瘤的生长也产生较弱的的抑制作用，且与ad5-pten的结合后，能显著增强其ad5-pten的肿瘤抑制作用。如图11d所示，生理盐水组中有些裸鼠的肿瘤从原来的侧面(点1)自发转移到了头部位置(点2)，这表明epap也许能抑制hepg2肿瘤的迁移和侵袭。此外，试验期间，小鼠没有发生给药相关的死亡，且除5-fu治疗组的小鼠体重降低了约12.20％外(从22.14±0.56g降低到了19.44±0.95g)，其余各组小鼠的体重均逐渐增加。这说明治疗剂量下，小鼠对epap安全又耐受，而5-fu对实验小鼠有极大毒性。11.2肿瘤组织病理学分析如图11e，f所示，5-fu、ad5-pten和epap治疗组的小鼠肿瘤组织均有典型的坏死，如核裂解、收缩，和溶解。与生理盐水对照组相比，epdt3组的肿瘤组织平均坏死率约为15％，5-fu组为45％，ad5-pten组为50％，epap(1.08×109pfu/ml)组为50％，epap(2.16×109pfu/ml)组为70％，而epap(4.326×109pfu/ml)组为85％。此外，epap高剂量组中大多数癌细胞呈高度分化，这也进一步说明了epap能有效抑制恶性肝癌细胞的生长分化，从而发挥抗肿瘤作用。肝癌因其高致死率，危害极大。目前传统方法仍不能根治肝癌在内的多种癌症，而基因治疗有望克服这一难题。基于epdt3具有epcam阳性细胞特异性靶向能力，本研究使用epdt3修饰ad5-pten，成功构建了新的基因给药系统epap。通过体外细胞摄取和体内肿瘤组织摄取实验，首次证实了epdt3能够高效靶向epcam阳性的人肝癌hepg2细胞，并显著提高pten基因对人hepg2肝癌的治疗效果，而对正常细胞和组织没有明显毒性。与裸ad5-pten相比，结合了epdt3的ad5-pten具有更高的稳定性和基因表达能力，这可能是由于两个方面的原因：首先，peg(cooh-peg2000-cooh)与epdt3的结合降低了血液循环对药物的清除率，从而延长了药物的半衰期；其次，peg与腺病毒的结合保留了ad5的感染能力，同时能一定程度上防止ad5受抗体中和。体内外实验表明，epap的抗肝癌作用可能不仅与肿瘤细胞的抑制作用有关，也与其对正常细胞和组织的毒性小有关。此外，高剂量epap(1.73×1010pfu/ml)对小鼠肝脏有毒性，表明在有肝功能损伤的情况下，此给药系统的使用要慎重。本发明初步发现epap和5-fu的作用机制具有本质的不同。shigdar等人研究表明，epdt3靶向到epcam后，通过内吞作用进入细胞，该机制可用于包括化疗药物在内的多种药物。曾有报道称pten在多种肿瘤中耐药，而hsu等人发现pten基因过表达的细胞系对5-fu化疗药物敏感。因此，epap与5-fu联合应用有望成为癌症治疗的一种有效手段。特别地，epap是以peg作为连接剂，通过酰胺键将ad5-pten与核酸适体epdt3结合而成，而在ad5-pten的聚乙二醇化过程中，peg两端的羧基都有可能被活化并与腺病毒反应而形成ad5-peg-ad5，最终将没有位置再连接适配体epdt3而得到目标产物epap。因此，为了解决这一问题，应从反应开始就严格控制反应物的比例。此后sds-page电泳结果表明，反应产物主要为cooh-peg-ad5-pten。另外epap的荧光强度测定、粒径测定和tbe-page电泳鉴定结果均显示反应的最终产物为epap，表明ad5-peg-ad5产物是可以通过控制反应条件避免的。本发明发现单独的epdt3在体内外具有一定的抗肿瘤活性，但目前尚无法确定药物到达体内后，epap中的pten能否与epdt3协同作用从而放大抗肿瘤效果，因此需要进一步研究以阐明epap的抗癌机制。此外，为了改进epap，可从以下几个方面展开工作：1)优化epap的制备方法，如寻找更好的连接剂；2)改进剂型，如脂质体或纳米粒，从而最大限度地提高epap的抗肿瘤疗效，同时降低其潜在毒性；3)将epap推广到肝癌之外的其他肿瘤的治疗；4)研究epap与其他抗癌药物联合用药的疗效。本发明成功合成了一种新型肝癌靶向基因药物传递系统epap，其体内外实验结果显示：1)epap在人血清中的稳定性较裸ad5-pten高，表明ad5-pten通过peg与rna适配体epdt3连接后能够一定程度上免受中和抗体的影响；2)适配体epdt3增强了ad5-pten在epcam阳性hepg2细胞中的表达和摄取；3)epap能够特异性地高效靶向到epcam阳性hepg2肿瘤组织，却不能靶向到正常肝组织；4)化疗药物5-fu的细胞抑制作用和细胞毒性对肿瘤细胞和正常细胞没有选择性，而epap的作用机制与其具有本质的不同；5)epap在体内外对hepg2细胞增殖和迁移的抑制效应明显强于裸ad5-pten，且在一定浓度范围内，这种抑制效果具有剂量和时间依耐性；6)小鼠体内急性毒性实验表明，epap达到一定浓度后会对肝脏有毒性作用，因此应用epap时应控制其浓度在安全范围内。总之，本发明成功构建了基因治疗给药系统epap，其对肝癌具有很好的治疗作用，而对正常细胞和组织的毒副作用很低。epap有望成为有效的抗肝癌给药系统，后续还将继续开展相关工作。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12当前第1页12