本发明属生物
技术领域：
，具体涉及一种甲型流感病毒全基因组通用扩增方法（pan-influenzaawhole-genomeamplificationassay,pifawga），本发明通过使用接力半特异扩增策略，提高病毒全基因组扩增效率。该方法可用于低病毒拷贝临床样本中流感病毒核酸富集，使其达到二代测序所要求目标核酸启始量要求。
背景技术：
：现有技术公开了流感病毒（influenzavirus，iv）是全球主要传染病原之一，不仅能感染家禽（avianflu）和猪（swineflu）等重要家畜，还可引起人类散发性季节流感（seasonalflu）,地区性流行（epidemic）以及全球大流行(pandemic)。因此，流感病毒的病原学诊断对我国传染病防控至关重要，开发相应的快速诊断分型试剂具有重大的社会和经济意义。研究显示了流感病毒属于正黏液病毒科（orthomyxoviridae）,是rna负链病毒，基因组由8个单链rna节段(pb2,pb1,pa,ha,np,na,m和ns)组成，分别编码11个病毒蛋白（ha,na,np,m1,m2,ns1,ns2,pa,pb1,pb1-f2和pb2）。流感病毒可利用基因组重配（reassortment）机制使基因序列突然发生重大变异，引起病毒蛋白抗原性的剧烈改变，导致免疫暴露（naïve）人群中流感爆发。根据m蛋白抗原性，流感病毒可分为3个种（species）：甲，乙，丙（a，b，c）。血凝素（hemagglutinin，ha）蛋白和神经氨酸酶（neuraminidase，na）是病毒主要表面抗原蛋白，目前已知甲型流感病毒有18种ha血清型和11种na血清型，病毒株的命名根据ha和na亚型以及毒株分离时间和地点确定。研究报道，目前已知的16种ha血清型,能在禽类中全部检测到，其中h5n1，h7n7和h7n9为高致病性禽流感；在人类中已检测到的有h1,h2,h3,h5,h7和h9亚型，其中h1和h3（和流感b）引起人季节流感。此外，2013年新发现的人感染h7n9和h10n8病例说明新型重组流感仍源源不断出现并且可能感染到人，以致威胁公众安全。因此，业内公认，对流感病毒的分子诊断应当能鉴别高／低致病性禽流感，人季节性流感和猪流感，特别是未知新型流感。目前市场上流感病毒诊断分型试剂盒以荧光定量pcr方法为主流技术，实践显示其检测特异性高，成本低，操作方便，但是，该类试剂盒是根据已知流感病毒序列设计特异性引物和探针，因此，只能鉴别已知常见流感亚型，尚不能鉴定未知新型病毒；此外，由于频发的流感基因序列突变常导致引物和探针扩增失败，检测敏感性降低，因此，需要定期更新引物和探针，重新进行试剂评估，导致此类试剂盒的研发维护成本高，而且市场接受度不高，因此，本领域需要能鉴定已知和未知新型流感的流感病毒诊断分型试剂盒。近年，二代测序技术应用于病毒的分子快速诊断，包括roche公司的454flx/gs测序平台、thermofisher公司的iontorrentpgm平台和illumina公司hiseq/miseq测序平台，其中，一次对几十万到几百万条dna分子进行序列测定，比原有sanger测序法（一代测序）具有高通量、高敏感性，更适用于全基因组重测序，特别是对低病毒拷贝的临床标本进行检测，并且可以发现样本中低拷贝数量的（新）变异毒株的存在。thermofisher公司推出基于iontorrent平台的商业化pathamptmflua流感病毒全基因组扩增试剂盒，该方法采用8对针对8段基因的特异性引物混合物，对样本进行多重pcr扩增，但是实践应用证实该试剂盒对培养毒株（病毒载量在106rnacopies/ml以上）检测效果较好，但是对临床标本检测敏感性较低，而且随着流感病毒序列的不断变异，该方法的敏感性也随之下降，因此，低病毒拷贝临床标本的流感病毒测序是本领域存在的一个共同的技术难点。基于现有技术的现状，尤其针对低病毒拷贝临床标本技术难点，本申请的发明人拟提供一种甲型流感病毒全基因组通用扩增方法（pan-influenzaawhole-genomeamplificationassay,pifawga），该方法可用于低病毒拷贝临床样本中流感病毒核酸富集，使其达到二代测序所要求目标核酸启始量要求。与本发明相关的现有技术有：1.zhoub,donnellyme,scholesdt,stgeorgek,hattam,kawaokay,wentworthde.single-reactiongenomicamplificationacceleratessequencingandvaccineproductionforclassicalandswineoriginhumaninfluenzaaviruses.jvirol.2009oct;83(19):10309-13.2.huy,lus,songz,wangw,haop,lij,etal.associationbetweenadverseclinicaloutcomeinhumandiseasecausedbynovelinfluenzaah7n9virusandsustainedviralsheddingandemergenceofantiviralresistance.lancet.2013;381(9885):2273-9.3.who:cdcprotocolofreal-timert-pcrforinfluenzaa(h1n1),30april2009。技术实现要素：本发明的目的在于针对现有技术中低病毒拷贝临床标本技术难点，提供一种甲型流感病毒全基因组通用扩增方法（pan-influenzaawhole-genomeamplificationassay,pifawga），该方法可用于低病毒拷贝临床样本中流感病毒核酸富集，使其达到二代测序所要求目标核酸启始量要求。本发明方法中，采用病毒接力式半特异性扩增策略，包括一级甲型流感病毒通用扩增引物和二级随机引物，提高病毒全基因组扩增效率，建立甲型流感病毒全基因组扩增方法，该方法可用于富集临床标本中病毒核酸，使其达到二代测序对样本dna起始量的要求（通常在100ng以上）。更具体的，本发明公开了一种甲型流感病毒全基因组通用扩增方法，其中采用病毒接力式半特异性pcr扩增策略，包括步骤：1）第一级rt-pcr扩增反应，采用一对甲型流感病毒特异性引物，该对引物3’端12或13个碱基分别针对全部病毒8节段基因的两端uni-12或uni-13序列，该两部分序列已经被证实不仅在8段基因之间高度保守，而且在所有甲型流感病毒亚型之间也高度保守；所述引物5’端则包含设计的标签序列碱基；本轮引物的扩增其目的是从临床标本中得到流感病毒8节段基因组全长；2）第二级pcr扩增反应，采用半随机引物，该条引物包括3’端6个随机碱基和5’端与一级流感引物标签序列互补的9个碱基，其目的是将一级扩增中得到的带标签序列的流感病毒基因组全长片段二次扩增，从而达到将标本中病毒核酸最大化扩增富集的效果。本发明的实施例中，采用两轮扩增策略，对流感病毒8段基因组进行全长扩增和富集；检测体系包括两组引物,第一组引物为one-steprt-pcr甲型流感通用全基因组引物p1-f和p1-r，第二组pcr引物为半随机引物p2-fr。表1为所采用的引物和探针序列。表1引物名称序列5’→3’p1-fcaggatcagcaaaagcaggp1-rcaggatcagtagaaacaaggp2-frcaggatcagnnnnnn相对于现有技术的第二轮扩增步骤中：1.采用随机引物，非特异性地结合到第一轮pcr扩增产物dsdna任意位置上，获得的二次扩增产物为病毒基因组8个节段的部分短片段，且片段之间长度相差较大，产物均一化比较差；本方法的第二轮扩增步骤中，所述的二级半随机引物，带有识别一级引物标签序列的特异性碱基，引导二级引物更多地与第一轮产物位于两端位置的标签序列结合，能获得更多的病毒全长基因，同时随机碱基部分可保证引物结合不受限于流感病毒不同亚型的序列差异，使得所述引物更具备流感病毒通用性。检测实验结果显示，本方法能稳定有效的扩增甲流病毒基因组，适用的病毒核酸样本最低原始浓度为104copies/ml，本方法能获得更多的流感病毒全长基因扩增产物，而且产物长度均一化好，减少了后期二代测序dna建库过程中样本损耗，有利于其达到二代测序对样本dna起始量的要求，适用于低病毒拷贝临床标本。附图说明图1显示了73例甲流病毒阳性标本病毒载量分布。具体实施方式本实施方式中，采用2013年1至2014年12月期间收集的73例甲型流感病毒感染患者临床咽拭子标本。临床标本和病毒毒株采用敏感细胞系培养常见呼吸道病毒毒株，包括甲型流感季节性h3n2和h1n1亚型病毒、pamh1n1亚型、乙型流感、呼吸道合胞病毒、鼻病毒和肠道病毒ca16和ev71。甲型流感病毒基因组定量检测中，病毒核酸提取自临床标本或病毒培养细胞上清，采用试剂盒为qiaampviralrnaminikit(qiagen,valencia,ca,usa)，按照说明书操作。荧光定量pcr采用试剂盒onestepfluorescentquantitativert-pcrkit(takarabio,dalian,liaoning,china)和甲型流感m基因特异性引物和探针[相关文献3]，病毒rna浓度根据104-108copies/ml已知浓度阳性质粒梯度稀释标准品的反应标准曲线定量。阳性标准品质粒的构建通过将流感病毒m基因特异性rt-pcr阳性扩增产物采用gelextractionandpcrcleanupkit（takarabio）纯化后插入pmd18-t载体（takarabio）转染感受态细胞，然后采用takaraminibestplasmidpurificationkit（takarabio）收集带有插入目的片段的质粒，按照试剂盒厂商说明书操作；插入片段验证通过商业测序公司sanger测序（sangonbiotech,shanghai,china），然后使用blast对测序结果进行序列比对分析；质粒浓度定量采用微量紫外分光光度计nanodropnd-2000c（thermo，usa）。实施例1甲型流感通用全基因组扩增反应采用两轮扩增策略，对流感病毒8段基因组进行全长扩增和富集；检测体系包括两组引物,第一组引物为one-steprt-pcr甲型流感通用全基因组引物p1-f和p1-r，第二组pcr引物为半随机引物p2-fr（如表1所示），第一轮one-steprt-pcr扩增，反应体系使用的试剂盒为takaraonestepprimescript™rt-pcrkit（rr064a），反应条件为42℃，30分钟；40个循环包括94℃，30秒；55℃，30秒；72℃，3分钟；第二轮pcr扩增，反应体系使用的试剂盒为takaraextaqkit(rr001a),反应条件为94℃，5分钟；30个循环包括94℃，30秒；55℃，30秒；72℃，1分钟;72℃，5分钟；扩增产物采用minelutepcrpurificationkit(qiagen)纯化，并采用原qpcr方法定量；表1引物和探针序列引物名称序列5’→3’p1-fcaggatcagcaaaagcaggp1-rcaggatcagtagaaacaaggp2-frcaggatcagnnnnnn结果显示，甲型流感病毒通用全基因组扩增反应（pan-influenzaawhole-genomeamplificationassay,pifawga）特异性和灵敏性显示，基于m基因是流感8段基因组保守性较强片段，片段长度约为800bp，因此采用m基因拷贝数代表流感病毒8段全基因组拷贝数；本实施例采用甲流季节性h3n2和h1n1亚型毒株作为阳性对照，检测pifawga方法的敏感性，病毒毒株样品提取核酸后10倍梯度稀释，采用特异性荧光pcr方法比较原始样品和各自pifawga扩增产物中病毒基因组含量（如表2所示），结果显示原始浓度为104-1010copies/ml的核酸样品经过pifawga扩增后基因拷贝数明显升高，可达到1012copies/ml，但是更低稀释浓度核酸样品扩增效果不明显，结果说明pifawga方法能稳定有效的扩增甲流病毒基因组，适用的病毒核酸样本最低原始浓度为104copies/ml；同时检测了其他常见呼吸道病毒毒株，包括乙型流感、呼吸道合胞病毒、鼻病毒和肠道病毒ca16和ev71，未见扩增，验证了本方法的特异性。表2是h1n1和h3n2甲流病毒毒株10倍梯度稀释样本中病毒基因组浓度和pifawg扩增产物中病毒基因组浓度变化。表2其中*-：未检出。实施例2检测临床标本将73份甲型流感病毒感染患者咽拭子样本抽提核酸后，采用同样荧光定量pcr方法和阳性质粒标准品对标本病毒核酸拷贝数定量，结果显示，标本中病毒载量分布从103-107rnacopies/ml（如图1所示），多数标本的病毒载量集中在104-105rnacopies/ml；随机抽取了27份标本核酸同时进行了pifawga扩增，扩增产物纯化后依旧采用荧光定量pcr方法和阳性质粒标准品对病毒基因拷贝数定量，结果显示，病毒基因组初始浓度在104-107copies/ml及所述的临床标本扩增后基因组拷贝数明显上升(如表3所示，结果表明，本发明方法是有效的，适用于含低拷贝病毒的临床标本。表3是甲流阳性临床标本和pifawga扩增后产物病毒基因组拷贝数(copies/ml)变化。表3样本编号初始定量pifawga产物定量67421.86e+049.72e+0760511.90e+04＞1.0e+1260912.70e+044.91e+0767483.08e+04＞1.0e+1267653.30e+049.67e+0760856.00e+041.03e+0861471.50e+055.85e+0666382.19e+05＞1.0e+1266422.32e+05＞1.0e+1267442.44e+05＞1.0e+1261362.63e+051.20e+0860554.46e+05＞1.0e+1261325.81e+051.34e+0666778.06e+05＞1.0e+1261928.26e+05＞1.0e+1261098.50e+055.84e+0667391.44e+06＞1.0e+1267381.68e+06＞1.0e+1262212.11e+06＞1.0e+1267322.19e+06＞1.0e+1267142.94e+06＞1.0e+1261346.50e+064.40e+0760768.02e+06＞1.0e+1260838.73e+061.33e+0860541.30e+071.28e+0860931.49e+07＞1.0e+1260462.17e+071.18e+08当前第1页12