一种利用基因枪法介导遗传转化毛竹的方法与流程

本发明涉及一种利用基因枪法介导遗传转化毛竹的方法，属于植物转基因技术领域。

背景技术：

竹类是禾本科(gramimineae)竹亚科(bambusoideae)多年生常绿植物。全世界竹类资源约70多属，1250种，我国竹类资源共有39属，500多种，竹林面积、蓄积量等均居世界第一位，主要分布在北纬40°以南地区，既是重要森林资源之一，同时也是重要的可再生资源。对于竹纤维品质的提高主要有两种方法：一是常规育种方式，但因竹开花具有不确定性，且开花后即死亡等特点，受到的限制巨大；二是通过基因工程手段在分子水平上对其进行改良。然而目前为止，竹纤维的优越性主要通过一些理化分析得到验证，却未在分子水平上进行深入研究。

目前，竹类基因克隆及其遗传改良方面的研究尚处起步和探索阶段。在基因克隆方面，尽管相继在慈竹、绿竹、毛竹上克隆了调控竹木质素相关合成酶基因，但未见在竹中成功进行遗传转化的研究报道。

毛竹(phyllostachyspubescens)作为我国南方一种重要的森林资源，具有较高的社会、经济和生态效益，在竹产业中具有重要地位。毛竹(phyllostachyspubescens)是单轴散生型竹类植物。毛竹种子基因型差异大，不同基因型的毛竹种胚愈伤组织诱导率和愈伤组织质量差异也较大，重复性不好，目前仅有少量有关毛竹愈伤组织诱导和再生的报道；而且在筛选培养的过程中常用农杆菌抑菌剂如羧卞青霉素和头孢青霉素等，对毛竹愈伤组织的伤害较大，目前尚无成功遗传转化毛竹的例子被报道。

农杆菌介导法主要应用于双子叶植物，而在单子叶植物应用上受到诸多限制，主要的问题是农杆菌主要侵染双子叶植物和极少数单子叶植物，对大部分单子叶植物特别是禾本科植物不敏感，而世界上大部分最重要的粮食、经济作物均为禾本科单子叶植物，从而限制了它的适用范围。此外，农杆菌介导的遗传转化能否取得成功对基因型的依赖性也比较强，即使是双子叶植物也有不少品种受基因型的限制而难以被农杆菌转化。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种竹子的遗传转化的方法。

本发明提供的竹子的遗传转化的方法包括如下步骤：

(1)将竹子种子的胚在预培养基中进行预培养，得到预培养后的成熟胚；

(2)利用基因枪法将目的基因转化所述预培养后的成熟胚，培养，得到转基因竹子。

上述方法中，所述基因枪法的轰击参数如下：金粉量：80-240ug；轰击距离：6-12cm；轰击压力：1100-1550psi；真空度：27。

上述方法中，所述基因枪法的轰击参数如下：金粉量：160ug；轰击距离：6cm；轰击压力：1350psi；真空度：27。

上述方法中，所述预培养基是将ms大量元素溶液、b5有机元素溶液、b5微量元素溶液、ms铁盐溶液、2,4-d、kt、iba、蔗糖和凝固剂混匀得到的培养基。

上述方法中，所述ms大量元素溶液包括kno3、nh4no3、cacl2、mgso4·7h2o和kh2po4。

上述方法中，所述b5有机元素溶液包括肌醇、烟酸、烟酸硫铵和盐酸吡哆醇。

上述方法中，所述b5微量元素溶液包括ki、h3bo3、mnso4·4h2o、znso4·7h2o、na2moo4·2h2o和cocl2·6h2o。

上述方法中，所述ms铁盐溶液包括feso4·7h20和na2edta。

上述方法中，

所述2,4-d在所述预培养基中的浓度为2mg/l；

所述kt在所述预培养基中的浓度为0.2mg/l；

所述iba在所述预培养基中的浓度为0.4mg/l；

所述kno3在所述预培养基中的浓度为1.9g/l；

所述nh4no3在所述预培养基中的浓度为1.65g/l；

所述cacl2在所述预培养基中的浓度为0.33224g/l；

所述mgso4·7h2o在所述预培养基中的浓度为0.37g/l；

所述kh2po4在所述预培养基中的浓度为0.17g/l；

所述肌醇在所述预培养基中的浓度为0.1g/l；

所述烟酸在所述预培养基中的浓度为0.001g/l；

所述烟酸硫铵在所述预培养基中的浓度为0.01g/l；

所述盐酸吡哆醇在所述预培养基中的浓度为0.001g/l；

所述ki在所述预培养基中的浓度为0.00075g/l；

所述h3bo3在所述预培养基中的浓度为0.003g/l；

所述mnso4·4h2o在所述预培养基中的浓度为0.01g/l；

所述znso4·7h2o在所述预培养基中的浓度为0.002g/l；

所述na2moo4·2h2o在所述预培养基中的浓度为0.00025g/l；

所述cocl2·6h2o在所述预培养基中的浓度为0.000025g/l；

所述feso4·7h20在所述预培养基中的浓度为0.0279g/l；

所述na2edta·2h2o在所述预培养基中的浓度为0.0373g/l；

所述蔗糖所述预培养基中的浓度为30g/l；

所述凝固剂为琼脂；

所述琼脂在所述预培养基中的浓度为8g/l。

上述方法中，所述预培养基的ph值为5.8。

上述方法中，所述预培养的时间为5天。

上述方法中，所述预培养的条件为25℃，黑暗。

上述方法中，所述步骤(1)和步骤(2)还包括高渗培养的步骤。

上述方法中，所述高渗培养的培养基为将甘露醇、山梨醇和所述预培养基混匀得到的培养基。

上述方法中，

所述甘露醇在所述高渗培养基中的浓度为0.2mol/l；

所述山梨醇在所述高渗培养基中的浓度为0.2mol/l。

上述方法中，

所述目的基因为gus基因；

所述gus基因是通过植物双元载体pcambia1303-n转化所述预培养后的成熟胚。

上述方法中，所述竹子种子的胚为竹子种子的成熟胚。

本发明的另一个目的是提供上述预培养基。

本发明还有一个目的是提供上述高渗培养基。

本发明的最后一个目的是提供上述预培养基和/或上述高渗培养基的新用途。

本发明提供了上述预培养基和/或上述高渗培养基在竹子的遗传转化中的应用。

上述方法或上述应用中，所述竹子为毛竹。

本发明的有益效果：目前，基因枪法广泛应用于玉米、水稻、小麦等多种植物的基因转化，特别是对多倍体小麦的的转化尤为突出。因竹属于禾本科单子叶植物，同样也是多倍体，故本发明选择基因枪法对竹进行遗传转化。与农杆菌介导法相比，本发明的基因枪法它不受宿主、靶受体类型及组织类型限制，可进行多基因及大片段的转化，可控度高，操作简便、快速。

本发明选用毛竹成熟胚为材料，利用基因枪轰击法探索竹的高效遗传转化技术，提供了一种利用基因枪法介导遗传转化毛竹的方法。该方法可以解决毛竹难于进行遗传转化的问题，缩短获得转基因植物的周期，大大提高了获得转基因毛竹的几率。本发明的方法不仅可作为其他工业用竹如慈竹、梁山慈竹等基因枪法介导遗传转化的参考，也为实施并突破工业用竹中基因定向改良育种研究、通过基因枪法创制优良种质新资源及探索工业用竹遗传改良的新途径奠定了基础。在工业用竹遗传改良和竹功能基因组学研究等方面具有重要的作用及广阔的应用前景。

附图说明

图1为不同基因枪参数组合轰击预培养不同天数成熟胚的瞬时转化效率。

图2为不同基因枪参数组合轰击预培养不同天数成熟胚的筛选成活率。

图3为不同基因枪参数组合轰击预培养不同天数成熟胚的阳性率。

图4为基因枪轰击毛竹成熟胚转化再生过程。a：毛竹种子；b：预培养3d毛竹成熟胚；c：预培养5d毛竹成熟胚；d：预培养7d毛竹成熟胚；e：预培养7d毛竹成熟胚高渗培养；f：轰击后毛竹成熟胚gus染色；g：转化苗抗性筛选；h：转化苗移栽；i：转基因毛竹成苗；j：转化苗分子鉴定；其中，1泳道为2000bpdnamaker，2泳道为阳性对照，3泳道为阴性对照，4-15泳道为转化植株；k：阳性转基因毛竹叶片gus染色。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的毛竹种子的获取时间为2016年07月，获取方式属于购买。直接来源的提供者为谭汝学(个体经营)，所处地区为云南省昆明市，联系方式：云南省昆明市中联花园18幢1-103，邮编：650106。原始来源的采集者为谭汝学，联系方式同上，获取时间为2016年05月，获取地点为云南省昭通市。

实施例1、一种基因枪法介导遗传转化毛竹的方法

一、实验材料的制备

1、pcambia1303-n载体质粒的制备

将植物双元载体pcambia1303-n(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，mcv035-n)记作目标载体，该载体携带有gus报告基因、卡那霉素和潮霉素抗性基因。

通过热激法将目标载体转化至大肠杆菌dh5a。挑取大肠杆菌单菌落，在含有100mg/l卡那霉素的lb培养液中，37℃，150rpm，过夜培养。经菌液pcr验证后使用质粒小提试剂盒提取含有目标载体的质粒，并浓缩或稀释至所需浓度，备用。

2、毛竹种子的消毒处理

在25℃条件下用水浸泡毛竹种子(图4a)24h，然后在超净工作台上，用70％乙醇浸泡30s，无菌水冲洗3次，再用5％-6％的次氯酸钠溶液浸泡10min(期间每隔2-3min进行振荡)，无菌水冲洗5次，最后用0.1％的升汞溶液浸泡10min，无菌水冲洗5次，得到消毒后的毛竹种子。

二、基因枪法介导遗传转化毛竹

1、毛竹种子的预培养

将消毒后的毛竹种子置于带纸平皿上，使用胚钩取出毛竹成熟胚，置于mb6培养基上在25℃，黑暗条件下进行预培养，预培养的天数分别为3天、5天和7天，分别得到预培养不同天数的毛竹成熟胚(预培养3天后的毛竹成熟胚、预培养5天后的毛竹成熟胚、预培养7天后的毛竹成熟胚)。预培养3天后的毛竹成熟胚、预培养5天后的毛竹成熟胚和预培养7天后的毛竹成熟胚的形态分别如图4b、4c、4d所示。

上述预培养基(mb6)的配方如下:ms大量元素溶液+b5有机元素溶液+b5微量元素溶液+ms铁盐溶液+2,4-d2mg/l+kt0.2mg/l+iba0.4mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8g/l，ph5.8。

上述ms大量元素溶液由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其在预培养基中的终浓度如下：kno31.9g/l、nh4no31.65g/l、cacl20.33224g/l、mgso4·7h2o0.37g/l、kh2po40.17g/l；

上述b5有机元素溶液由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其在预培养基中的终浓度如下：肌醇0.1g/l、烟酸0.001g/l、烟酸硫铵0.01g/l、盐酸吡哆醇0.001g/l；

上述b5微量元素溶液由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其在预培养基中的终浓度如下：ki0.00075g/l、h3bo30.003g/l、mnso4·4h2o0.01g/l、znso4·7h2o0.002g/l、na2moo4·2h2o0.00025g/l、cocl2·6h2o0.000025g/l；

上述ms铁盐溶液由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其在预培养基中的终浓度如下：feso4·7h200.0279g/l，na2edta·2h2o0.0373g/l。

2、毛竹成熟胚的高渗培养

分别将预培养不同天数的毛竹成熟胚置于高渗培养基平皿中心(直径3cm范围)上高渗暗培养4h，培养条件为25℃，黑暗，分别得到高渗培养后的毛竹成熟胚。其中，预培养7天后的毛竹成熟胚在高渗培养后的形态如图4e所示。

上述高渗培养基的配方为：mb6培养基+甘露醇0.2mol/l+山梨醇0.2mol/l，ph5.8。

3、毛竹成熟胚的基因枪轰击

超净工作台上，使用基因枪分别对步骤2获得的高渗培养后的毛竹成熟胚进行轰击。选择不同的基因枪参数(金粉用量、轰击距离、轰击压力)进行基因枪轰击(真空度：27)，筛选最佳的轰击条件。基因枪参数的正交设计表见表1。pds-1000/he型基因枪的具体实验步骤如下：

(1)微弹制备(金粉母液配制)

1)称取80mg金粉加入eppendorf管。

2)加入1ml75％乙醇，充分涡旋，静置15min，1500rpm离心5min。

3)弃上清，加入1ml无菌水，充分涡旋，1500rpm离心5min。重复3次。

4)弃上清，加入1ml无菌的50％甘油，充分涡旋，-20℃保存。

(2)dna的包裹及基因枪轰击操作

1)取50μl金粉悬液(指金粉母液)于eppendorf管。

2)依次加入5μl质粒dna(1μg/μl)，50μl2.5mcacl2和20μl0.1m亚精胺。(边涡旋边加入，每加完一样，可振荡2-3秒)。

3)将上述混好的样品，涡旋1min，冰上静置1min，重复10次。

4)冰上静置30min。10000rpm离心10sec，去上清。

5)用250μl无水乙醇冲洗沉淀2次(10000rpm离心10sec，去上清)。

6)最后用60μl无水乙醇重悬颗粒。

7)在超净台上，75％酒精棉擦洗轰击室，75％乙醇消毒各配件15min，然后晾干。

8)取10μldna包被的金颗粒点于颗粒子弹载体膜中心(一滴一滴滴加，待第一滴干燥后，滴加第二滴，防止金粉颗粒扩散太大)。

9)打开真空泵和基因枪的电源开关。

10)打开氦气瓶阀门，旋转氦气调节杆，使气压高于所选可裂膜压为1500psi左右。

11)旋下可裂膜挡盖，将可裂膜放在挡盖中央(要放正，防止漏气)，将挡盖旋上，用专用扳手加固。

12)把微粒发射装置移出轰击室，旋下盖子，加入阻挡网，把微粒载片安装在固定槽中(有微粒的一面朝下)，旋上盖子，将微粒发射装置放回轰击室。

13)将样品盘放置在轰击室的适当位置，关上轰击室门。

14)将样品盘放置在轰击室的适当位置，关上轰击室门。

15)取出微粒发射装置，卸下微粒载膜和阻挡网(阻挡网和微粒载片固定槽放入70％的酒精中浸泡)。

16)旋下可裂膜挡盖，清除可裂膜碎片。

17)若pds-1000/he不再使用时，关掉氦气瓶的主阀，按住fire开关，放掉气体加速管内的氦气压力，最后关掉一切电源。

表1基因枪参数正交试验表

基因枪轰击后，超净工作台上，将基因枪轰击后的毛竹成熟胚继续在25℃，黑暗条件下进行高渗暗培养16h。

4、恢复培养

高渗暗培养后，超净工作台上，将毛竹成熟胚转至mb6培养基上在25℃，黑暗条件下恢复暗培养7d，得到轰击恢复培养后的毛竹成熟胚。并在第3d取部分轰击后的毛竹成熟胚置于无菌ep管中，加入大于毛竹成熟胚3倍体积的gus染液(50mm磷酸缓冲液,0.1％tritonx-100,2mm铁氧化钾，2mm亚铁氧化钾，10mmedta，2mmx-gluc)，然后置于37℃恒温培养箱进行暗反应，反应48-72h后，检查染色呈蓝色的毛竹成熟胚，并计算瞬时转化效率。瞬时转化效率＝呈蓝色毛竹胚个数/染色总个数。

结果表明：不同基因枪参数组合轰击预培养不同天数成熟胚的瞬时转化效率结果如图1所示。由图1可知，随着金粉量的加大，瞬时转化效率增大；预培养5天后的胚是较适合的遗传转化材料。基因枪轰击参数为如下数值时：金粉量：160ug；轰击距离：6cm；轰击压力：1350psi(基因枪参数组合6)，瞬时转化效率最高(图1)。

5、筛选培养

恢复培养后，将轰击恢复培养后的毛竹成熟胚转至1/2ms筛选培养基(1/2ms培养基+潮霉素5mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8g/l，ph5.8)上长芽长根，培养条件为25℃，昼夜时间为14/8h，培养30d，获得转基因毛竹成苗(图4i)。并统计不同基因枪参数组合轰击预培养不同天数的毛竹成熟胚的筛选成活率。筛选成活率＝成苗个数/总胚数。

不同基因枪参数组合轰击预培养不同天数的毛竹成熟胚的筛选成活率如图2所示。从图2中可以看出：160ug金粉量轰击毛竹成熟胚，毛竹筛选成活率最高，240ug金粉量次之，80ug金粉量最低。

6、转基因植株的pcr检测

采用潮霉素抗性基因特异引物hyg-f(gcagccactggtaacaggat)和hyg-r(actgtcgggcgtacacaaat)对上述获得的转基因毛竹成苗进行pcr检测，pcr扩增得到大小为2000bp的转基因毛竹成苗为外源基因成功整合到基因组dna中的阳性转基因毛竹，并统计不同基因枪参数组合轰击预培养不同天数的毛竹成熟胚的阳性率。经多批次重复pcr，检测到近100株能扩增出2000bp的目标条带的阳性转基因毛竹。部分pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图4j所示。

不同基因枪参数组合轰击预培养不同天数的毛竹成熟胚的阳性率如图3所示，从图中可以看出：预培养5天后的毛竹成熟胚的阳性率最高，尤其基因枪参数组合为金粉量160ug/枪，轰击距离6cm，轰击压力1350psi时，阳性率更高，最高可达10％。

根据上述瞬时转化效率、筛选成活率和转基因植株阳性率，最终基因枪轰击参数的最优组合如下：金粉量：160ug；轰击距离：6cm；轰击压力：1350psi。

7、转基因毛竹的gus检测

洗净上述步骤6获得的阳性转基因毛竹的根部培养基，移入营养钵(泥炭土：石英砂：土壤＝2:1:1)中培养，利用人工喷水保持环境湿度，培养条件为：昼温度25℃，夜温度18℃，光照时间14h/d。经过驯化炼苗20-30天后，移栽入装有花园土、直径为30cm的花盆中(图4h)。

对阳性转基因毛竹的叶片进行gus组织化学分析。具体步骤如下：于组培瓶中取出毛竹部分叶片，加入大于叶片3倍体积的gus染液，置于37℃恒温培养箱进行暗反应，反应48-72h后，在100％，75％，50％梯度酒精中进行脱色处理，脱色完成后，于倒置显微镜下，观察报告基因gus的表达情况。

通过对阳性转基因毛竹叶片的gus检测分析，发现阳性转基因毛竹叶片上均表达报告基因gus，说明pcambia1303-n载体成功整合到毛竹基因组中并进行了翻译和表达(如图4k)。

对比例、农杆菌介导的毛竹遗传转化方法

按照文献“农杆菌介导法生产大型丛生竹类的方法”(专利授权号为zl20101023093.x，专利授权时间为2012-06-13)中的方法，以毛竹为受体材料采用农杆菌介导法进行遗传转化，经过愈伤组织诱导增殖、预培养、农杆菌侵染和共培养、抗性愈伤组织筛选的步骤，未在筛选培养基上获得阳性的毛竹愈伤组织和再生苗。因此，文献“农杆菌介导法生产大型丛生竹类的方法”中的农杆菌介导的遗传转化方法，包括转化各过程中的专用培养基并不适合毛竹的遗传转化。