一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法与流程

文档序号:12413158阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法,其特征在于,包括以下步骤:

(1)对棉花进行DNA提取;

(2)根据与陆地棉果枝形态共分离的基因Gorai.001G121800_ATC中的SNP位点设计dCAPS引物,所述dCAPS引物如下:

正向引物SEQ ID No.1:5’-TTCAACACCAACAAGCAGGT-3’;

反向引物SEQ ID No.2:5’-GGTCACTAGGACCAGGAACAA-3’;

并且以步骤(1)得到的DNA为模板进行PCR扩增;

(3)使用限制性内切酶Mun I对步骤(2)得到的产物进行酶切,37℃水浴2-4个小时;

(4)对步骤(3)得到的酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,并进行染色,根据226bp处的特异性酶切条带判断共分离基因的有无。

2.根据权利要求1所述的一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法,其特征在于:所述步骤(1)中,棉花DNA的提取方法如下:

(a)取棉花材料真叶期幼嫩未展开叶片一片,加入DNA提取液,电钻或磨样机研磨充分后进行离心;

(b)弃去步骤(a)中离心后的上清液,加入DNA裂解缓冲液,混匀后置于水浴锅中进行水浴;

(c)将步骤(b)中的裂解混合物从水浴中取出,加入氯仿与异戊醇的混合液颠倒混匀,静置后离心;

(d)吸取步骤(c)中离心后的上清液,加入与所述上清液等体积的冰异丙醇,静置待絮状DNA成团析出,挑取絮状物,再用70%乙醇浸泡清洗2到3次,最后将离心管倒置,使DNA风干,加入ddH2O于温室溶解后测定浓度,并稀释到25ng/μl,-20℃保存备用。

3.根据权利要求2所述的一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法,其特征在于:所述DNA提取液成分为:0.35M葡萄糖,0.1M Tris-HCl,5mM EDTA-Na,2%PVP,1%(V/V)β-巯基乙醇,pH值为8.0。

4.根据权利要求2所述的一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法,其特征在于:所述DNA裂解缓冲液成分为1.4M NaCl,0.1M Tris-HCl,20mM EDTA-Na,2%CTAB,2%PVP,1%(V/V)β-巯基乙醇,pH值为8.0。

5.根据权利要求1所述的一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法,其特征在于:所述步骤(2)中PCR扩增的反应体系为:模板1μl,10mM正向引物1μl,10mM反向引物1μl,10×PCR Buffer 1μl,10mM dNTPs 0.2μl,25mM MgCl21μl,2U/μl TaqDNA聚合酶0.1μl和ddH2O 4.7μl。

6.根据权利要求1所述的一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法,其特征在于:所述步骤(2)中PCR扩增的循环程序为:95℃预变性3min,95℃变性45s,58℃退火45s,72℃延伸60s,30个循环;72℃延伸5min,4℃保存。

7.根据权利要求1所述的一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法,其特征在于:所述步骤(3)中酶切反应体系为:Mun I 1μl、10×M Buffer 2μl、0.1%BSA2μl、DNA 3μl、灭菌水2μl。

8.根据权利要求1所述的一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法,其特征在于:所述步骤(4)中的具体方法为:向步骤(3)得到的酶切产物中加入2μl上样缓冲液,于8%的聚丙烯酰胺凝胶、1×TBE的电泳缓冲液中进行电泳检测;电泳结束后将聚丙烯酰胺凝胶置于染色液中染色10min,用蒸馏水快速清洗两遍,置于显色液中显色10min,待电泳条带清晰后,使用蒸馏水清洗两遍即可。

9.根据权利要求8所述的一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法,其特征在于:所述染色液为将0.5ml浓度为40%的硝酸银加入200ml纯水中即得。

10.根据权利要求8所述的一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法,其特征在于:所述显色液为3g氢氧化钠和1ml甲醛溶于200ml蒸馏水中混合均匀制得。

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