本发明涉及大豆分子育种领域，尤其涉及一种与大豆根表面积相关的QTL、SNP分子标记及应用。
背景技术：
根在大豆的生长发育中起着极为重要的作用。大豆的根有主、侧根之分，可入土1.5米深，呈钟罩状根系。大豆的大部根分分布在0～20cm的表土耕作层内，地表下7～8cm的主根粗大，且主要的支根亦分生于此部分，支根自主根分生以后，即向四方平行扩展，可达40～50cm以上。不同品种根的延伸长度及表面积差异很大，一般根表面积大的品种，丰产性好、抗逆能力强。但是，有关大豆根表面积的研究远不如地上部深入。
大豆育种中由于根系研究信息的缺乏往往只注重对于地上部的选择，而很少顾及到根表面积，这在很大程度上影响了育种工作的成效。深入的研究大豆品种的根表面积特性，可选出综合性状良好的品种。但是，根表面积难于直观观察，不利于直接选择，分子标记辅助选择可显著提高根表面积遗传改良进程。目前，通过连锁分析对大豆根表面积相关基因进行数量性状基因位点(Quantitative trait locus，QTL)定位研究的较少，仅发现3个大豆根表面积相关QTL分布在1号与11号染色体上，相关的作用机理及应用研究还尚未充分进行。因此，有必要寻找一个可以更有效反应大豆根表面积QTL以及与其相关的SNP(Single nucleotide polymorphism，单核苷酸的多态性)分子标记，进而在大豆根表面积遗传改良中应用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种与大豆根表面积相关的QTL、SNP分子标记及应用，以解决上述技术问题。本发明发掘到1个与根表面积相关的QTL，标记区间仅为0.252cM，筛选到SNP标记与目标性状紧密连锁，可用于分子标记辅助选择育种，显著提高根表面积较大材料的选择效率。
本发明所要解决的技术问题采用以下技术方案来实现：
一种与大豆根表面积相关的QTL，其特征在于：与大豆根表面积有关的QTL位于9号染色体的M45646-M45636区间，由SNP分子标记M45646、M45636定位。
一种与QTL紧密连锁的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记为M45646，M45646的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，M45636的扩增引物为：
M46F：5’-GTGCTTGGTGTTTAGATAAGGG-3’，如SEQ ID NO.3所示；
M46R：5’-ATACCTGGGTCATTCTCCC-3’，如SEQ ID NO.4所示。
一种与QTL紧密连锁的SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记为M45636，M45636的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，M45636的扩增引物为：
M36F：5’-CGATCCTTTGTGAGTGTGGGT-3’，如SEQ ID NO.5所示；
M36R：5’-GTTGTGAGCACGATTCGGC-3’，如SEQ ID NO.6所示。
与大豆根表面积相关的QTL在大豆根表面积性状选育中的应用。
所述的SNP分子标记，在大豆根表面积性状分子标记辅助选择选育中的应用，是按照以下技术方案进行的：
1)利用CTAB法提取待鉴定材料基因组DNA；
2)分别利用M45646、M45636的引物进行PCR扩增，分别得到M45646扩增产物和M456366扩增产物；
3)分别将M45646扩增产物和M45636扩增产物进行测序；
4)M45646扩增产物自5’端第140位为A根表面积大，M45636扩增产物自5’端第88位为G根表面积大。
本发明，更进一步的技术方案：
一种与大豆根表面积相关的QTL，其特征在于：与大豆根表面积有关的QTL，所述的QTL位于9号染色体作图区间为M45646-M45636，它是按照以下技术方案进行的：
一、将大豆品种一千粒和长岭野生豆杂交，对F1代获得的种子进行自交，获得高世代重组自交系群体(RIL)；
二、利用SLAF-seq(Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing)技术和HighMap软件对RIL分离群体开发高密度分子标签，进行遗传图谱构建；
三、采用软件rQTL的CIM方法进行QTL分析，以LOD≥3为标准，对大豆根表面积进行遗传作图；
利用大豆品种一千粒和长岭野生豆杂交，产生的200个后代中选择种子继续种植，多代自交得到一个由200个F5:8株系组成的重组自交系群体，利用此重组自交系群体构建大豆20条染色体的遗传图谱，步骤包括：
(1)利用CTAB法对父母本及200个子代基因组DNA进行提取；
(2)对检测合格的各样品基因组DNA利用RsaI和HaeIII分别进行酶切，选择基因组片段范围在364-414bp的SLAF片段，对得到的SLAF片段进行3′端加A处理、连接Dual-index测序接头、PCR扩增、纯化、混样、切胶选取目的片段，文库质检合格后用IlluminaHiSeqTM 2500进行测序；
(3)根据测序Reads在参考基因组上的定位结果，GATK进行局部重比对(Local Realignment)、GATK变异检测，samtools变异检测，取GATK和samtools两种方法得到的交集变异位点等步骤，以保证检测得到的SNP的准确性，最终筛选可用的SNP标签为111399个；
(4)根据完整度低于70％及严重偏分离的SNP标签过滤规则，筛选出4902个SNP标签，通过与参考基因组的定位将SNP分为20个连锁群，通过两两标签之间计算MLOD值，共上图4564个SNP标签，以连锁群为单位，采用HighMap软件分析获得连锁群内Marker的线性排列，并估算相邻Marker间的遗传距离，最终得到总图距为3,403.90cM的遗传图谱；
本发明利用rQTL作图软件的多区间作图法，以LOD≥3为标准，对大豆根表面积进行QTL分析；在2号染色体上发现QTL区间M45646-M45636，如表1所示，
表1大豆根表面积QTL区间
一种与大豆根表面积相关的QTL的应用，其特征在于：与大豆根表面积相关的QTL紧密连锁的SNP分子标记为M45646、M45636，其是以待鉴定材料的基因组DNA作为模板，以引物进行PCR扩增所得的片段；
其中，M45646的扩增引物为：
M46F：5’-GTGCTTGGTGTTTAGATAAGGG-3’如SEQ ID NO.3所示；
M46R：5’-ATACCTGGGTCATTCTCCC-3’如SEQ ID NO.4所示。
M45636的扩增引物为：
M36F：5’-CCAATGAGTGTAACTTGTCCAG-3’如SEQ ID NO.5所示；
M36R：5’-GTTGTGAGCACGATTCGGC-3’如SEQ ID NO.6所示。
利用上述SNP分子标记辅助判断根表面积的具体步骤如下：
1.利用CTAB法提取待鉴定材料基因组DNA
1)取大豆新鲜叶片加入液氮研磨成粉状，取适量放入1.5mL离心管中；
2)加入0.6mL预热的CTAB提取液，颠倒混匀几次，在65℃的温度下水浴一小时，每15min混匀一次，12000rpm离心15min；
3)加入0.6mL 24：1(V/V)的氯仿：异戊醇溶液，颠倒混匀5-10次，10000rpm离心15min；
4)取上清溶液转移到另外一个空的离心管中，用24:1(V/V)的氯仿：异戊醇溶液重新抽提一次，然后加50μL RNase(10mg/mL)室温下放置30min；
5)加等体积-20℃预冷的异丙醇，于-20℃冰箱中30min，5000rpm离心10min去上清；
6)用70％乙醇清洗两次，吹干后用灭菌水溶解，得到基因组模板DNA，将基因组模板DNA放入4℃冰箱保存备用；
7)用0.8％的琼脂糖检测DNA的浓度，稀释到工作浓度用于PCR扩增；
2.分别利用M45646、M45636的引物进行PCR扩增，分别得到M45646扩增产物、M45646扩增产物和M456366扩增产物；
1)PCR扩增体系：总体积为20μL，包括10ng基因组模板DNA 2μL，2×Es Taq MasterMix 10μL，10mM的引物各2μL和ddH2O 4μL；
2)PCR扩增条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸45s；循环35次；72℃终延伸10min；
3.根据序列比对结果判断根表面积
分别将M45646扩增产物和M45636扩增产物进行测序分析，M45646扩增产物自5’端第140位在母本一千粒中为A、父本长岭野生豆中为G；M45636扩增产物自5’端第88位在母本一千粒中为G、父本长岭野生豆中为T；当子代这些位点的SNP与母本一致时，根表面积大，当与父本一致时根表面积小，M45646的判断准确率为89.2％，M45636的判断准确率为83.4％，因此上述SNP分子标记M45646、M45636可作为大豆根表面积的共显性分子标记。
本发明的有益效果是：
本发明M45646-M45636的区间都是大豆根表面积的理想标记区间(见表1所示)，其中M45646为LOD最高点，其贡献率为13.11％。与此标记紧密相连的QTL的加性效应为负值，即一千粒的该QTL等位基因使根表面积增加。因此，无论是从QTL的定位，还是QTL对表型的贡献率来看，M45646-M45636的区间都是大豆根表面积的理想标记区间。利用本发明提供的如表1所示的大豆根表面积染色体作图区间M45646-M45636的重要意义在于，为进一步丰富大豆根表面积调控网络提供了一种最经济有效的分子育种新途径。
附图说明
图1是位于9号染色体上M45646-M45636区间的遗传图谱及QTL作图区间。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
一、遗传群体的构建
以根表面积大的大豆地方品种一千粒为母本，根表面积小的长岭野生豆为父本，进行有性杂交，F1代选择长势良好，结实多的单株收获，然后采用单粒传法，繁种加代到F5，接着单株收获，次年种成株行，连续种植3代，获得F5:8家系，从中随机选取200个家系进行遗传图谱构建。
二、遗传图谱的构建
1.用CTAB法提取亲本及200个子代F5:8家系的DNA，用Thermo nanodrop2000检测DNA浓度并用1％琼脂糖电泳检测DNA纯度及完整性。
2.利用北京百迈客生物科技有限公司自主研发的SLAF-seq技术和HighMap软件对2个亲本和200个子代开发高密度分子标签，进行遗传图谱构建，具体步骤如下：
(1)酶切方案：利用酶切预测软件对已公布大豆参考基因组进行酶切预测，选择内切酶RsaI和HaeIII对检测合格的各样品基因组进行酶切，选择基因组片段范围在364-414bp的SLAF片段。
(2)测序流程：对得到的SLAF片段用Klenow Fragment(3′→5′exo–)(NEB)和dATP在37℃下进行3′端加A处理、连接Dual-index测序接头、PCR扩增(PCR扩增引物：F AATGATACGGCGACCACCGA RCAAGCAGAAGACGGCATACG)、纯化(Agencourt AMPure XP beads(Beckman Coulter,High Wycombe,UK))、混样、切胶选取目的片段，文库质检合格后用IlluminaHiSeqTM2500进行测序。为评估建库实验的准确性，选用水稻(Oryza sativa)作为对照(Control)进行相同的处理参与建库和测序。
(3)SNP标签与基因分型：(3)根据测序Reads在参考基因组上的定位结果，GATK进行局部重比对(Local Realignment)、GATK变异检测，samtools变异检测，取GATK和samtools两种方法得到的交集变异位点等步骤，以保证检测得到的SNP的准确性，最终筛选可用的SNP标签为111399个。
(4)上图标签筛选：为了避免染色体上的SNP聚集现象对遗传图谱构建过程中的影响，在进行分析之前，对部分标签进行了去除冗余处理，对每个contig/supercontig，在一定大小的窗口(本项目采用120kb)内，取唯一一个深度均值最高的Marker代表该区段用于后续分析，共计筛选出的4902个SNP标签。
(5)连锁分析：将筛选出的4902个SNP标签，通过与参考基因组的定位将SNP分为20个连锁群，通过两两标签之间计算MLOD值，共上图4564个，定位为上图标记(Marker)。以连锁群为单位，采用HighMap软件分析获得连锁群内Marker的线性排列，并估算相邻Marker间的遗传距离，最终得到总图距为3403.90cM的遗传图谱。
三、人工接种鉴定亲本及200个子代的根表面积
试验于2015年1月至2016年12月在吉林省农业科学院安普智能温室进行了两批次。
1.大豆植株培养：以河沙作为栽培介质，栽培桶高30cm、直径25cm，每份材料3个桶，每桶4株。同期播种，出苗后，每隔10天浇1L营养液(常规配方)。
2.根表面积鉴定：在材料达到R7期，取子叶节以下根系，利用LA-S系列植物根系分析仪/根系分析系统扫描根系，获得根表面积数据。
四、大豆根表面积的QTL分析
利用两批次根表面积的平均值及构建的总图距为3403.90cM的遗传图谱，采用rQTL作图软件的多区间作图法，以LOD≥3为标准，对大豆根表面积进行QTL分析。在9号染色体上发现QTL区间M45646-M45636，如表1所示。
表1大豆根表面积QTL区间
五、根表面积QTL区间标记的应用
与大豆根表面积相关的QTL紧密连锁的SNP分子标记为M45646、M45636，其是以待鉴定材料的基因组DNA作为模板，以引物进行PCR扩增所得的片段；其中M45646的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，M45636的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
其中，M45646的扩增引物为：
M46F：5’-GTGCTTGGTGTTTAGATAAGGG-3’如SEQ ID NO.3所示；
M46R：5’-ATACCTGGGTCATTCTCCC-3’如SEQ ID NO.4所示。
M45636的扩增引物为：
M36F：5’-CCAATGAGTGTAACTTGTCCAG-3’如SEQ ID NO.5所示；
M36R：5’-GTTGTGAGCACGATTCGGC-3’如SEQ ID NO.6所示。
利用上述SNP分子标记辅助判断根表面积的具体步骤如下：
1.利用CTAB法提取待鉴定材料基因组DNA
1)取大豆新鲜叶片加入液氮研磨成粉状，取适量放入1.5mL离心管中。
2)加入0.6mL预热的CTAB提取液，颠倒混匀几次，在65℃的温度下水浴一小时，每15min混匀一次，12000rpm离心15min。
3)加入0.6mL 24：1(V/V)的氯仿：异戊醇溶液，颠倒混匀5-10次，10000rpm离心15min。
4)取上清溶液转移到另外一个空的离心管中，用24:1(V/V)的氯仿：异戊醇溶液重新抽提一次，然后加50μL RNase(10mg/mL)室温下放置30min。
5)加等体积-20℃预冷的异丙醇，于-20℃冰箱中30min，5000rpm离心10min去上清。
6)用70％乙醇清洗两次。吹干后用灭菌水溶解，得到基因组模板DNA，将基因组模板DNA放入4℃冰箱保存备用。
7)用0.8％的琼脂糖检测DNA的浓度，稀释到工作浓度用于PCR扩增。
2.分别利用M45646、M45636的引物进行PCR扩增，分别得到M45646扩增产物、M45646扩增产物和M456366扩增产物。
1)PCR扩增体系：总体积为20μL，包括10ng基因组模板DNA 2μL，2×Es Taq MasterMix 10μL，10mM的引物各2μL和ddH2O 4μL。
2)PCR扩增条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸45s；循环35次；72℃终延伸10min。
3.根据序列比对结果判断根表面积
分别将M45646扩增产物和M45636扩增产物进行测序分析，M45646扩增产物自5’端第140位在母本一千粒中为A、父本长岭野生豆中为G；M45636扩增产物自5’端第88位在母本一千粒中为G、父本长岭野生豆中为T。当子代这些位点的SNP与母本一致时，根表面积大，当与父本一致时根表面积小，M45646的判断准确率为89.2％，M45636的判断准确率为83.4％，因此上述SNP分子标记M45646、M45636可作为大豆根表面积的共显性分子标记。
本发明M45646-M45636的QTL区间都是大豆根表面积的理想标记区间(见表1所示)，其中M45646为LOD最高点，其贡献率为13.11％。与此标记紧密相连的QTL区间的加性效应为负值，即一千粒为该QTL的供体。因此，无论是从该QTL区间的定位，还是该QTL区间对表型的贡献率来看，以M45646-M45636的区间都是大豆根表面积的理想标记区间。
图1是位于9号染色体上M45646-M45636区间的遗传图谱及QTL作图区间，如图1所示，利用本发明提供的如表1所示的大豆根表面积染色体(09)作图区间M45646-M45636仅为0.252cM，距离很小，且筛选出的分子标记M45646、M45636与大豆根表面积紧密连锁、显著相关，可用于分子标记辅助选择育种，显著提高根表面积大的材料选择效率，为进一步丰富大豆根表面积调控网络提供了一种最经济有效的分子育种新途径。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序 列 表
序列表
<110> 吉林省农业科学院
<120> 一种与大豆根表面积相关的QTL、SNP分子标记及应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 220
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtgcttggtg tttagataag ggtgatatat ggctatttaa tgtggtctca catggtattc 60
cacttaacat ttttgcagga tccagacaac aatgcttgca tggcttattg gctatccaac 120
acatcttctt tgtttttcca tcttcagcaa tgtctaagag tacctacaac acggaaacca 180
cccactccaa cgtcattttt cgggagaatg acccaggtat 220
<210> 2
<211> 212
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccaatgagtg taacttgtcc agcgagcaga acaagctgaa gagtgacttt tggaatttac 60
aaagaactcg cccagtgagt cttactcgct caacgagtat tgtgttctct aaagtgatga 120
gacaacgaca ttgggcccat tataaaaggg gcattccctt aaggataaaa aagaatcaac 180
ttagggcaca tcgaggtgcg gaaatacaaa gc 212
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtgcttggtg tttagataag gg 22
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atacctgggt cattctccc 19
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgatcctttg tgagtgtggg t 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gttgtgagca cgattcggc 19