本发明涉及一种酶的提取方法，具体是一种从马血中提取乙酰胆碱酯酶的方法。
背景技术：
乙酰胆碱酯酶是生物神经传导中的一种关键性的酶，在胆碱能突触间，该酶降解乙酰胆碱，终止神经递质对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号在生物体内的正常传递。由于乙酰胆碱酯酶对于乙酰胆碱的高速水解作用，使得其近年来得到越来越多的研究人员的关注。乙酰胆碱酯酶在生物防治、农药残留检测、分子生物学以及各种神经性疾病治疗方面有广泛的应用。最近研究表明，氨基甲酸乙酯在一定程度上可以抑制乙酰胆碱酯酶的活性，因此乙酰胆碱酯酶有可能应用在氨基甲酸乙酯的检测上。
乙酰胆碱酯酶广泛存在于各种动植物组织中，对于动物来说，主要集中在肝脏、血液和脑组织中。现有的乙酰胆碱酯酶的提取方法普遍存在酶活性差的缺陷。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种从马血中提取乙酰胆碱酯酶的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种从马血中提取乙酰胆碱酯酶的方法，步骤如下：
1)取新鲜马血，加入混合缓冲提取液，在4℃冰浴、100-200rpm的转速下搅拌混合15-20min，获得第一混合液；
2)将第一混合液在0-4℃下静置12-24小时，获得第二混合液；
3)将第二混合液在4℃冰浴、300-400rpm的转速下匀浆8-12min，获得第三混合液；
4)将第三混合液在4℃、7500-8000rpm的条件下冷冻离心23-28min，取上清液，获得第四混合液；
5)采用Procainamide亲和层析法对第四混合液进行纯化处理，获得初次纯化物；
6)采用SephadexG-200凝胶柱对初次纯化物进行纯化处理，获得最终纯化物；
7)将最终纯化物浓缩，干燥，即得产品。
作为本发明进一步的方案：步骤1)中，所述混合缓冲提取液的加入量为所用的新鲜马血体积的3-5倍。
作为本发明再进一步的方案：步骤1)中，所述混合缓冲提取液中含有质量百分比为0.5-0.8％的聚乙二醇辛基苯基醚，余量为磷酸盐缓冲液。
作为本发明再进一步的方案：步骤1)中，所述混合缓冲提取液的pH为7.2-7.6。
作为本发明再进一步的方案：步骤5)中，体系pH为7.3。
作为本发明再进一步的方案：步骤6)中，体系pH为7.5。
作为本发明再进一步的方案：步骤7)中，采用透析法于4℃下浓缩最终纯化物，然后进行真空冷冻干燥。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提取方法所获得的乙酰胆碱酯酶的酶活性高，纯度高，灵敏度高的优点，且所制得的产品为粉末状，易于存储，具有广阔的市场前景。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1
一种从马血中提取乙酰胆碱酯酶的方法，步骤如下：
1)取新鲜马血，加入混合缓冲提取液，在4℃冰浴、100rpm的转速下搅拌混合15min，获得第一混合液，其中，所述混合缓冲提取液的加入量为所用的新鲜马血体积的3倍；所述混合缓冲提取液中含有质量百分比为0.5％的聚乙二醇辛基苯基醚，余量为磷酸盐缓冲液；所述混合缓冲提取液的pH为7.2；
2)将第一混合液在0℃下静置12小时，获得第二混合液；
3)将第二混合液在4℃冰浴、300rpm的转速下匀浆8min，获得第三混合液；
4)将第三混合液在4℃、7500rpm的条件下冷冻离心23min，取上清液，获得第四混合液；
5)采用Procainamide亲和层析法对第四混合液进行纯化处理，获得初次纯化物，其中，Procainamide亲和层析体系pH为7.3；
6)采用SephadexG-200凝胶柱对初次纯化物进行纯化处理，获得产物，其中，SephadexG-200凝胶柱体系pH为7.5；
7)将最终纯化物浓缩，干燥，即得产品，具体为，采用透析法于4℃下浓缩最终纯化物，然后进行真空冷冻干燥，获得产品。
实施例2
一种从马血中提取乙酰胆碱酯酶的方法，步骤如下：
1)取新鲜马血，加入混合缓冲提取液，在4℃冰浴、150rpm的转速下搅拌混合16min，获得第一混合液，其中，所述混合缓冲提取液的加入量为所用的新鲜马血体积的3倍；所述混合缓冲提取液中含有质量百分比为0.6％的聚乙二醇辛基苯基醚，余量为磷酸盐缓冲液；所述混合缓冲提取液的pH为7.3；
2)将第一混合液在0℃下静置15小时，获得第二混合液；
3)将第二混合液在4℃冰浴、320rpm的转速下匀浆9min，获得第三混合液；
4)将第三混合液在4℃、7600rpm的条件下冷冻离心24min，取上清液，获得第四混合液；
5)采用Procainamide亲和层析法对第四混合液进行纯化处理，获得初次纯化物，其中，Procainamide亲和层析体系pH为7.3；
6)采用SephadexG-200凝胶柱对初次纯化物进行纯化处理，获得产物，其中，SephadexG-200凝胶柱体系pH为7.5；
7)将最终纯化物浓缩，干燥，即得产品，具体为，采用透析法于4℃下浓缩最终纯化物，然后进行真空冷冻干燥，获得产品。
实施例3
一种从马血中提取乙酰胆碱酯酶的方法，步骤如下：
1)取新鲜马血，加入混合缓冲提取液，在4℃冰浴、150rpm的转速下搅拌混合18min，获得第一混合液，其中，所述混合缓冲提取液的加入量为所用的新鲜马血体积的4倍；所述混合缓冲提取液中含有质量百分比为0.7％的聚乙二醇辛基苯基醚，余量为磷酸盐缓冲液；所述混合缓冲提取液的pH为7.4；
2)将第一混合液在2℃下静置18小时，获得第二混合液；
3)将第二混合液在4℃冰浴、350rpm的转速下匀浆10min，获得第三混合液；
4)将第三混合液在4℃、7800rpm的条件下冷冻离心25min，取上清液，获得第四混合液；
5)采用Procainamide亲和层析法对第四混合液进行纯化处理，获得初次纯化物，其中，Procainamide亲和层析体系pH为7.3；
6)采用SephadexG-200凝胶柱对初次纯化物进行纯化处理，获得产物，其中，SephadexG-200凝胶柱体系pH为7.5；
7)将最终纯化物浓缩，干燥，即得产品，具体为，采用透析法于4℃下浓缩最终纯化物，然后进行真空冷冻干燥，获得产品。
实施例4
一种从马血中提取乙酰胆碱酯酶的方法，步骤如下：
1)取新鲜马血，加入混合缓冲提取液，在4℃冰浴、180rpm的转速下搅拌混合19min，获得第一混合液，其中，所述混合缓冲提取液的加入量为所用的新鲜马血体积的5倍；所述混合缓冲提取液中含有质量百分比为0.7％的聚乙二醇辛基苯基醚，余量为磷酸盐缓冲液；所述混合缓冲提取液的pH为7.5；
2)将第一混合液在4℃下静置20小时，获得第二混合液；
3)将第二混合液在4℃冰浴、400rpm的转速下匀浆10min，获得第三混合液；
4)将第三混合液在4℃、8000rpm的条件下冷冻离心26min，取上清液，获得第四混合液；
5)采用Procainamide亲和层析法对第四混合液进行纯化处理，获得初次纯化物，其中，Procainamide亲和层析体系pH为7.3；
6)采用SephadexG-200凝胶柱对初次纯化物进行纯化处理，获得产物，其中，SephadexG-200凝胶柱体系pH为7.5；
7)将最终纯化物浓缩，干燥，即得产品，具体为，采用透析法于4℃下浓缩最终纯化物，然后进行真空冷冻干燥，获得产品。
实施例5
一种从马血中提取乙酰胆碱酯酶的方法，步骤如下：
1)取新鲜马血，加入混合缓冲提取液，在4℃冰浴、200rpm的转速下搅拌混合20min，获得第一混合液，其中，所述混合缓冲提取液的加入量为所用的新鲜马血体积的5倍；所述混合缓冲提取液中含有质量百分比为0.8％的聚乙二醇辛基苯基醚，余量为磷酸盐缓冲液；所述混合缓冲提取液的pH为7.6；
2)将第一混合液在4℃下静置24小时，获得第二混合液；
3)将第二混合液在4℃冰浴、400rpm的转速下匀浆12min，获得第三混合液；
4)将第三混合液在4℃、8000rpm的条件下冷冻离心28min，取上清液，获得第四混合液；
5)采用Procainamide亲和层析法对第四混合液进行纯化处理，获得初次纯化物，其中，Procainamide亲和层析体系pH为7.3；
6)采用SephadexG-200凝胶柱对初次纯化物进行纯化处理，获得产物，其中，SephadexG-200凝胶柱体系pH为7.5；
7)将最终纯化物浓缩，干燥，即得产品，具体为，采用透析法于4℃下浓缩最终纯化物，然后进行真空冷冻干燥，获得产品。
采用本发明实施例1-5的提取方法对马血进行提取，采用乙酸-β-萘酯显色法测定活力，所获得的乙酰胆碱酯酶的活力为85.25-90.57U/mg。采用靛酚乙酸酯显色法对获得的乙酰胆碱酯酶进行灵敏度测定，其检出极限为10-15μg/mL。
本发明提取方法所获得的乙酰胆碱酯酶的酶活性高，纯度高，灵敏度高的优点，且所制得的产品为粉末状，易于存储，具有广阔的市场前景。
上面对本发明的较佳实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。