一种基于锌卟啉的电致化学发光材料的制备方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于锌卟啉的电致化学发光材料的制备方法。

背景技术：

可视化的ecl技术在图像信号传导领域已展现显著的优势。传统的ecl发光体主要包括依赖于正电位响应的联吡啶钌及其衍生物或复合物。虽然包括硼-二吡咯亚甲基(即bodipy)系列在内的众多有机染料、多环芳烃、杂环类化合物和离子液晶，纷纷展现了其在ecl显色或电致变色方面的突出潜力，但存在水溶性差，反应过渡态和自由基中间体的不稳定，工作电极在水溶液中的电位窗口较窄等问题(sheehan,s.w.etal.amolecularcatalystforwateroxidationthatbindstometaloxidesurfaces.nat.commun.2014,5,doi:10.1038/ncomms7469.)。

现有的将环糊精和卟啉结合的物质，尚未应用于ecl成像方面，并且只有极少数卟啉分子发光体的ecl能在水相中重现。此外卟啉分子容易发生聚集，不能达到最佳发光效果。研究人员尝试利用天然纳米材料、表面活性剂、离子液体等来分散卟啉，以减少聚集，从而达到提高发光效率的目的，但上述材料都存在生物相容性差的问题(yaoc,etal.electro-photodynamicvisualizationofsingletoxygeninducedbyzincporphyrinmodifiedmicrochipinaqueousmedia[j].acsappliedmaterials&interfaces,1944,8(50):34833.；wu,m.-s.etal，electrochemiluminescenceonbipolarelectrodesforvisualbioanalysis.chem.sci.2013,4,1182-1188)。因此，寻找具有良好的ecl发光性能，并且能在水溶液中稳定发光，且生物相容性高的发光材料对于进一步促进ecl在生物成像方面的应用具有十分重要的意义。

技术实现要素：

针对现有的卟啉类的电致化学发光材料存在的水溶性差、发光不稳定，生物相容性差、不适于生物应用的不足，本发明提供了一种基于锌卟啉的电致化学发光材料的制备方法，所述方法通过β-环糊精和3，5-二氯甲基吡啶形成二聚体，再与锌卟啉通过轴向配位形成主客包裹，制备得到一种发光稳定，强度高，生物相性好，易溶于水的ecl发光材料。

本发明的技术方案如下：

一种基于锌卟啉的电致化学发光材料的制备方法，具体步骤如下：

步骤1，将七-(2，6-甲氧基)β-环糊精(dme-β-cd)溶于无水四氢呋喃(thf)中，按七-(2，6-甲氧基)β-环糊精与含有氢化钠的矿物油的质量比为(3～8:1)，边搅拌边缓慢加入含有氢化钠的矿物油，搅拌反应1～3h，反应结束后，按七-(2，6-甲氧基)β-环糊精与3，5-二氯甲基吡啶的摩尔比为(1～5:1)，缓慢滴加3，5-二氯甲基吡啶的n，n-二甲基甲酰胺溶液，继续搅拌过夜，得到含有β-环糊精二聚体的混合溶液；

步骤2，冰浴条件下，在含有β-环糊精二聚体的混合溶液中缓慢加入甲醇，除去过量的氢化钠，直至混合物变得透明，减压蒸馏除去有机溶剂，剩余物溶于饱和碳酸氢钠水溶液中，三氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去三氯甲烷，二氧化硅硅胶层析柱进行纯化，得到β-环糊精二聚体(py3ocd-oh)；

步骤3，按β-环糊精二聚体和间四苯磺酸基锌卟啉(zntspp)的摩尔比为1～6:2，将β-环糊精二聚体和间四苯磺酸基锌卟啉溶于甲醇中，加水，搅拌反应后，旋蒸，过滤，60～100℃下干燥，得到β-环糊精二聚体与锌卟啉的结合体(zntspp-py3ocd-oh)。

优选地，步骤1中，所述的七-(2，6-甲氧基)β-环糊精与含有氢化钠的矿物油的质量比为为5:1，所述的七-(2，6-甲氧基)β-环糊精与3，5-二氯甲基吡啶的摩尔比为2:1。

优选地，步骤2中，所述的纯化过程中，依次经过三氯甲烷：甲醇的体积比为15：1和三氯甲烷：甲醇的体积比为30：1的洗脱液。

优选地，步骤3中，所述的β-环糊精二聚体和间四苯磺酸基锌卟啉的摩尔比为1：1。

与现有技术相比，本发明利用生物相容性优良的环糊精作为包裹体，电致化学发光发光强的卟啉作为被包裹体，通过氢化钠对七-(2，6-甲氧基)β-环糊精进行还原，将3，5-二氯甲基吡啶加入其中发生取代反应，从而形成β-环糊精二聚物，之后加入锌卟啉，利用轴向配位的方式与吡啶n原子配位形成复合物，从而防止了卟啉分子之间形成聚合体，得到生物相容性高，ecl信号稳定，水溶性高的发光材料。本发明方法制备得到的ecl发光材料在光电倍增管偏置电压为1000v，放大级数为3的条件下，其信号强度下可达7000左右。

附图说明

图1为本发明的zntspp-py3ocd-oh的结构示意图。

图2为实施例1中各锌卟啉的ecl信号图。

图3为实施例2中py3ocd-oh的合成路线图。

图4为实施例2中不同洗脱剂洗脱后的薄层层析色谱图。

图5为实施例2制得的py3ocd-oh的核磁图谱。

图6为实施例5、6、7中zntspp与py3ocd-oh的摩尔比与制得的发光体的发光强度的关系图。

图7为实施例2制得的py3ocd-oh与实施例5制得的zntspp-py3ocd-oh的红外谱图。

图8为实施例5中py3ocd-oh、zntspp、zntspp-py3ocd-oh的ecl信号强度关系图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

锌卟啉的ecl信号检测。

1.将易溶于水的间四苯磺酸基锌卟啉(a)、2，4-二乙二醇次锌卟啉(b)、次锌卟啉(c)、间四(n-甲基-4-吡啶基)锌卟啉(d)、间四吡啶锌卟啉(e)五种锌卟啉统一配制成0.5mm的水溶液，并在室温下超声30min。

2.将5mm直径玻碳电极分别在0.3μm、0.05μm氧化铝的麂皮上面各抛光3min，每次皆以超纯水冲洗掉吸附在电极表面的氧化铝，之后以丙酮、乙醇、去离子水超声，氮气吹干待用。

3.分别将15μl的不同卟啉溶液滴加到处理好的玻碳电极表面，在37℃的恒温箱中干燥1h，得到工作电极。

4.以ph7.4hepes溶液为检测液，设置电致化学发光分析系统的参数为：光电倍增管偏置电压：1000v；放大级数：3；扫描速率：100mv·s^-1。以ag/agcl为参比电极，铂电极为对电极，调节扫描电位范围为-1.7v～0v，依次检测不同修饰电极的ecl信号，记录ecl信号强度。

如图2所示，五种卟啉(a-e)的电位-强度的关系图，a号卟啉zntspp的发光性质良好，发光电位为-1.4v；其中插图为zntspp的时间-强度图，可以看出，zntspp发光稳定。

实施例2

七-(2，6-甲氧基)-β-环糊精二聚体的合成，合成路线如图3所示，具体步骤为：

1.称取七-(2，6-甲氧基)β-环糊精(dme-β-cd)5g溶于80ml无水四氢呋喃中形成白色半透明溶液，继续搅拌，然后缓慢加入1g含有60％氢化钠的矿物油(与dme-β-cd的质量比为5：1)，混合物回流1h。

2.称取0.2g3，5-二氯甲基吡啶(与dme-β-cd的摩尔比为1：2)溶于20ml干燥的n，n-二甲基甲酰胺中，用恒压漏斗在超过1小时的时间内滴加到上述的反应体系中，继续搅拌反应，回流过夜。

3.反应结束后，冰浴条件下缓慢加入甲醇，直至混合物变得透明，进行减压蒸馏，所得剩余物溶于40ml饱和碳酸氢钠水溶液中，并用60ml三氯甲烷进行6次萃取，之后称取10g无水硫酸钠加入其中进行干燥，减压蒸馏除去三氯甲烷。

4.首先用三氯甲烷：甲醇(30：1)的洗脱剂，然后用三氯甲烷：甲醇(15：1)的洗脱剂过二氧化硅硅胶柱(2×25cm)进行洗脱，所得溶液最终进行旋蒸干燥后得到产物638mg。

如图4所示，a图依次为三氯甲烷：甲醇(15：1)、三氯甲烷：甲醇(9：1)三氯甲烷：甲醇(5：1)下吸附n原子的薄层层析图，b图依次为三氯甲烷：甲醇(15：1)、三氯甲烷：甲醇(9：1)、三氯甲烷：丙酮(1：1)、三氯甲烷：甲醇(5：1)对于七-(2，6-甲氧基)β-环糊精(dme-β-cd)扩散薄层层析图；每块板下面四个点依次为dme-β-cd、3，5-二氯甲基吡啶、步骤2中萃取之后的水相、步骤2中萃取之后的有机相，最终确定洗脱剂为三氯甲烷：甲醇(15：1)、三氯甲烷：甲醇(30：1)可以纯化出最终产物β-环糊精二聚体(py3ocd-oh)。

图5为最终产物的核磁谱图，如图所示，¹hnmr(500mhz,cdcl3,tms)：δ＝3.13-4.04(m,168h),4.68(m,2h),4.92-5.18(m,26h),5.27(m,2h),8.61(s,2h)；通过分析氢的化学位移以及数量完全符合理论结构要求，即两个七-(2，6-甲氧基)-β-环糊精通过3，5-二氯甲基吡啶形成二聚体。

实施例3

七-(2，6-甲氧基)-β-环糊精二聚体的合成，合成路线如图3所示，具体步骤为：

1.称取七-(2，6-甲氧基)β-环糊精(dme-β-cd)5g溶于80ml无水四氢呋喃中形成白色半透明溶液，继续搅拌，然后缓慢加入0.5g含有60％氢化钠的矿物油(与dme-β-cd为3：1)，混合物回流1h。

2.称取0.09g3，5-二氯甲基吡啶(与dme-β-cd的比为1：5)溶于20ml干燥的n，n-二甲基甲酰胺(dmf)中，用恒压漏斗在超过1小时的时间内滴加到上述的反应体系中，继续搅拌反应，回流过夜。

3.上述反应结束后，冰浴条件下缓慢加入甲醇，直至混合物变得透明，进行减压蒸馏，所得剩余物溶于40ml饱和碳酸氢钠水溶液中，并用60ml三氯甲烷进行6次萃取，之后称取10g无水硫酸钠加入其中进行干燥，减压蒸馏除去三氯甲烷。

4.首先用三氯甲烷：甲醇(30：1)的洗脱剂，然后用三氯甲烷：甲醇(15：1)的洗脱剂过二氧化硅硅胶柱(2×25cm)进行洗脱，所得溶液最终进行旋蒸干燥后得到产物234mg。

实施例4

七-(2，6-甲氧基)-β-环糊精二聚体的合成，合成路线如图3所示，具体步骤为：

1.称取七-(2，6-甲氧基)β-环糊精(dme-β-cd)5g溶于80ml无水四氢呋喃中形成白色半透明溶液，继续搅拌，然后缓慢加入1.5g含有60％氢化钠的矿物油(与dme-β-cd为8：1)，混合物回流1h。

2.称取0.4g3，5-二氯甲基吡啶(与dme-β-cd的比为1：1)溶于20ml干燥的n，n-二甲基甲酰胺(dmf)中，用恒压漏斗在超过1小时的时间内滴加到上述的反应体系中，继续搅拌反应，回流过夜。

3.上述反应结束后，冰浴条件下缓慢加入甲醇，直至混合物变得透明，进行减压蒸馏，所得剩余物溶于40ml饱和碳酸氢钠水溶液中，并用60ml三氯甲烷进行6次萃取，之后称取10g无水硫酸钠加入其中进行干燥，减压蒸馏除去三氯甲烷。

4.首先用三氯甲烷：甲醇(30：1)的洗脱剂，然后用三氯甲烷：甲醇(15：1)的洗脱剂过二氧化硅硅胶柱(2×25cm)进行洗脱，所得溶液最终进行旋蒸干燥后得到产物325mg。

实施例5

称取10.8mg实施例2中所得产物(py3ocd-oh)和2.4mg四苯磺酸基锌卟啉(zntspp)溶解于50ml甲醇中(py3ocd-oh与zntspp的摩尔比为1：1)，完全溶解之后，加入5ml超纯水，继续搅拌反应1h以后进行旋转蒸发，所得残留物用0.22μm滤膜进行过滤，取得滤液之后所得溶液装入试剂瓶中，在温度为90℃下干燥24h，得到最终产物10.2mg。

将实施例2和上一步所得产物分别称取10mg并加入溴化钾，在红外灯下进行研磨制样，之后分别对两种物质进行红外光谱(ir)分析。

如图7所示，实施例2中产物py3ocd-oh与实施例3中产物zntspp-py3ocd-oh对于中红外区吸收明显有所区分，由于py3ocd-oh在结合zntspp之后有了zntspp明显的吸收峰，2935.6cm^-1处为卟啉环上不饱和c-h键的伸缩振动，1460.8cm^-1为卟啉环上共轭双键的振动峰，1367.3cm^-1为s＝o键的对称伸缩振动，1158.1cm^-1为s＝o键的不对称伸缩振动，757.4cm^-1为卟啉环上取代基苯环上氢的伸缩振动，577.6cm^-1为c-s键的伸缩振动。

实施例6

称取5.4mg实施例2中所得产物(py3ocd-oh)和2.4mg四苯磺酸基锌卟啉(zntspp)溶解于50ml甲醇中(py3ocd-oh与zntspp的摩尔比为1：2)，完全溶解之后，加入5ml超纯水，继续搅拌反应1h以后进行旋转蒸发，所得残留物用0.22μm滤膜进行过滤，取得滤液之后所得溶液装入试剂瓶中，在温度为90℃下干燥24h，得到最终产物7mg。

实施例7

称取32.4mg实施例2中所得产物(py3ocd-oh)和2.4mg四苯磺酸基锌卟啉(zntspp)溶解于50ml甲醇中(py3ocd-oh与zntspp的摩尔比为3：1)，完全溶解之后，加入5ml超纯水，继续搅拌反应1h以后进行旋转蒸发，所得残留物用0.22μm滤膜进行过滤，取得滤液之后所得溶液装入试剂瓶中，在温度为90℃下干燥24h，得到最终产物30mg。

如图6所示，为实施例5、6、7中最终产物进行ecl发光强度测定之后得到的关系图。从图中可以看出，py3ocd-oh与zntspp的摩尔比为1：1时，发光强度可达到最优，即最优比例为1：1。

实施例8

将5mm直径玻碳电极分别在0.3μm、0.05μm氧化铝的麂皮上面各抛光3min，每次皆以超纯水冲洗掉吸附在电极表面的氧化铝，之后以丙酮、乙醇、去离子水超声，氮气吹干待用；

将实施例3中所得产物溶于水中配制成0.5mm溶液，超声分散30min，之后滴加15μl到处理过的玻碳电极上，在37℃恒温箱中干燥后，并滴加10μl的10mm四辛基溴化铵的二氯甲烷溶液作为保护，所得电极作为工作电极；

检测液为ph7.4hepes溶液4ml，依次检测不同修饰电极的ecl信号。设置电致化学发光分析系统的参数为，光电倍增管偏置电压：1000v；放大级数：3；扫描速率：100mv·s^-1。以ag/agcl为参比电极，铂电极为对电极，调节扫描电位范围为-1.7v～0v，由电致化学发光分析系统检测记录ecl信号强度。

如图8所示，zntspp在经过py3ocd-oh包裹负载后得到的zntspp-py3ocd-oh(a)之后电致化学发光(ecl)强度得到了超过150％的提升，并且所合成的包裹物py3ocd-oh(c)并没有电致化学发光，插图中则是反映了zntspp-py3ocd-oh的电致化学发光强度随着时间的变化图，可以看出此物质发光强度高而且稳定。