一种特异结合膜联蛋白A2的核酸适体wh3及用途的制作方法

本发明属于适体领域，具体涉及特异结合膜联蛋白a2的核酸适体，还涉及该核酸适体的应用。

背景技术：

膜联蛋白a2(annexina2，anxa2)是由339个氨基酸组成的分子量为36kda的蛋白质,是一种ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，在细胞中可以单体(p36)、异源二聚体(p36/p11)和异源四聚体(p362/p112)三种形式存在。它在结构上高度保守并且在几乎所有真核生物中表达，主要分布在细胞膜、细胞浆中，一小部分存在于细胞核中。anxa2主要表达于内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞、神经细胞和某些肿瘤细胞中，在脑癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌和结肠癌以及血液肿瘤中表达上调。anxa2在肿瘤中的高表达与肿瘤的发生、发展、浸润、转移及预后密切相关。anxa2在高侵袭、高转移的恶性肿瘤中高表达，提示anxa2有望成为判断肿瘤浸润和转移能力及肿瘤病人预后的标志物，可作为肿瘤治疗潜在的靶分子，该核酸适体可用于肿瘤早期检测及治疗。

目前，anxa2的检测方法主要有免疫组化法，酶联免疫法等免疫学检测法。依赖抗体的免疫学检测法操作简单，灵敏度高，无需大型昂贵仪器设备，适用于大量样品的检测，但是这种方法检测的假阳性率比较高，定量也不够准确。并且检测所用抗体等试剂稳定性差，储存条件较dna核酸适体严格。核酸适体能与各种有机物或无机物靶标分子高特异性、高亲和力结合，同时具有分子量小，免疫原性低，稳定性好，制备和标记方便等优点。核酸适体作为抗体分子的替代分子，在疾病的诊断和治疗中发挥重要作用。但迄今尚无针对anxa2的dna核酸适体报道或公开，因此有必要开发一种可特异结合anxa2的核酸适体。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明目的在于提供特异结合并作用anxa2的核酸适体。

本发明人采用消减筛选的策略，利用gst-anxa2融合蛋白作为筛选靶标，可获得与融合蛋白结合的dna序列，通过将gst蛋白作为负性筛选，将与gst蛋白结合的dna序列去除，从而得到能与anxa2蛋白特异结合的核酸适体，通过筛选获得了一条特异结合anxa2的核酸适体（命名为wh3）。所述核酸适体的核苷酸序列如seqidno.3所示。

本发明提供所述特异结合anxa2的核酸适体wh3在制备检测anxa2试剂中的应用。具体地，通过将anxa2蛋白与酶标板结合，然后利用生物素标记的wh3核酸适体孵育结合；pbs洗板后，加入过氧化物酶标记的链霉亲和素孵育，加入过氧化物酶的底物显色，通过酶标仪检测并计算anxa2的浓度。

本发明提供特异结合anxa2的核酸适体wh3在纯化和浓缩anxa2中的应用。具体地，anxa2蛋白与生物素标记的wh3核酸适体结合，然后加入链霉亲和素磁珠孵育，通过磁粉可将anxa2纯化和浓缩。

本发明提供特异结合anxa2的核酸适体在制备靶向anxa2药物中的应用。具体而言，细胞膜表面的anxa2蛋白能与多种蛋白结合发挥其生理作用，，wh3能与anxa2蛋白结合，可能阻断anxa2蛋白与其它蛋白的相互作用，其功能表现为wh3阻断anxa2蛋白促进mm.1s和rpmi-8226细胞的生长，wh3能抑制mm1.s和rpmi-8226细胞对anxa2蛋白的粘附作用。

本发明的有益效果在于：

本发明公开了特异结合anxa2的核酸适体，该核酸适体能够与anxa2特异性结合，为anxa2纯化和浓缩，靶向anxa2的药物以及定量或定性检测anxa2提供了靶分子，同时为检测血清中anxa2的水平，反映机体肿瘤负荷状态提供了工具，也为临床选择最佳的治疗方案提供了策略，为观察治疗效果和判断预后提供帮助。

附图说明

图1.wh3核酸适体的空间结构；

图2.elisa检测wh3与anxa2蛋白结合；

图3.aptamer-pulldown检测wh3与anxa2蛋白结合；

图4.wh3抑制anxa2刺激mm.1s和rpmi-8226细胞的生长；

图5.wh3抑制hs-5细胞刺激mm.1s和rpmi-8226细胞的生长；

图6.wh3抑制mm.1s和rpmi-8226细胞与anxa2蛋白的粘附。

具体实施方式

实施例1

合成长度为80nt的核苷酸文库序列（上海生工生物工程（上海）股份有限公司），具体序列如下：5'-accgaccgtgctggactca(n)42actatgagcgagcctggcg-3'，两端为固定序列，本文库中间42n代表42个随机碱基，保证其库容量大约为10¹⁴，足够大库容量可形成不同的三维空间结构，从而保证具有与靶标结合的空间结构的序列存在，并在后面的筛选过程中筛选出来，库序列为p80ss库。然后将随机寡聚ssdna文库用如下引物进行扩增：

p80-sf：5'-fam-accgaccgtgctggactca-3'（seqidno.1）

p80-ap:5'-biotin-cgccaggctcgctcatagt-3'（seqidno.2）

随机ssdna文库（首轮筛选量为5000pmol，相当于4个od随机库）用1ml1×选择缓冲液溶解于ep管中（1%bsa包被，4℃封闭过夜），95℃变性10min，变性后立即置于0℃放置10min。将包被了gst蛋白的磁珠混匀，取100μl置于bsa包被的ep管中，用150μl结合缓冲液洗涤3次。将ssdna文库（5nmol）与包被了gst蛋白的磁珠混匀，室温孵育1h，去除与gst蛋白磁珠结合的ssdna序列。取上清ssdna文库与包被了anxa2磁珠混匀孵育1h，同时加入酵母trna竞争结合。将ep管置磁力架上2-3min，弃上清，用1×洗涤缓冲液洗去未结合的ssdna序列,每次3min，重复3次。置磁力架2-3min，弃上清。ep管中加入200μl去离子水，95℃加热5min，置磁力架2min，取上清为pcr的模板，进行pcr扩增。

配置pcr体系：模板2μl，引物p80-sf（10μm）1μl，引物p80-ap（10μm）1μl，dntp（各2.5mm）4μl，10×buffer5μl，taqdna聚合酶0.25μl，ddh2o36.75μl(总体积为50μl)。按如下条件，在pcr仪上扩增：95℃预变性3min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共25个循环，72℃延伸5min。扩增后将pcr产物转移到1.5ml的离心管中。用200μl1×磁珠结合洗涤缓冲液重悬链霉亲和素琼脂糖珠，使链霉亲和素琼脂糖珠的终浓度为5μg/μl,加入1mlpcr产物，室温摇床孵育结合1h，然后1000rpm，离心2min，弃上清。用1×磁珠结合洗涤缓冲液洗涤链霉亲和素琼脂糖珠，每次5min，重复3次。去上清，加入400μl的200mmnaoh与链霉亲和素琼脂糖珠孵育5min，使dsdna解链，然后1000rpm，离心2min，含生物素的一条ssdna仍留在链霉亲和素琼脂糖珠上，而另一条不带生物素的ssdna存在于上清中。分离上清中ssdna即为下一轮筛选的富集库。重复进行9个循环筛选。

克隆测序及序列分析

将第9轮筛选得到的核酸适体富集库用无修饰的引物扩增，送上海生工生物工程有限公司进行高通量测序，测序成功后获得了两条与anxa2结合的核酸适体，其中一条序列如seqidno.3所示，命名为wh3（另一条命名为wh6，另案予以申请）。具体序列如下：

anxa2核酸适体(wh3)为：5'-accgaccgtgctggactcaggccgattgactttccaacaaacttaggcccactagacagaaactatgagcgagcctggcg-3'(seqidno.3)

然后通过mfold软件对wh3核酸适体序列的二级结构进行分析，结构如图1.所示。

实施例2

1×10⁷个anbl-6细胞用westernblot及ip细胞裂解液(碧云天，p0013)冰上裂解30min，提取细胞总蛋白,取20μl蛋白液作为input。平均分到三个ep管中，分别加入50pmol的5’端生物素修饰的wh3核酸适体和dna-lib,并设链霉亲和素琼脂糖珠的阴性对照组,4℃摇床孵育1h。然后加入20μl的链霉亲和素琼脂糖珠，4℃摇床孵育1h。1000rpm，离心2min，弃上清，加入1ml的dpbs洗5min，1000rpm，离心2min，弃上清。重复用dpbs洗三次，加入40μl的westernblot上样缓冲液到ep管中，95℃加热5min。1000rpm，离心2min，取上清,sds-page电泳，转膜，牛奶封闭后用小鼠单克隆anxa2抗体4℃孵育过夜，tpbs洗三次，加入hrp标记的兔抗鼠的igg，通过ecl反应液显影，检测wh3核酸适体和dna-lib与anxa2的结合情况。

结果显示（参见图2），dnal-lib和链霉亲和素琼脂糖珠不与anxa2蛋白结合，wh3核酸适体能与anxa2蛋白结合。

实施例3

anxa2重组蛋白用结合缓冲液稀释到1μg/ml,取200μl加入到酶标板的孔中。4℃孵育过夜，用dpbs洗四次，每次3min。用1%的bsa37℃封闭2h，dpbs洗三次，每次3min。将5’端生物素修饰的wh3核酸适体和dna-lib95℃变性10min，置于冰上10min；然后分别取20nm加入包被了anxa2蛋白的酶标板孔中，室温孵育2h。dpbs洗三次，每次3min。在酶标板孔中，加入200μl的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素（碧云天，p0013，a0303），室温孵育1h。dpbs洗三次，每次3min。在酶标板孔中，加入100μl显色液（el-abts显色试剂盒，c510031，上海生工），显色15min。酶标仪405nm/650nm双波长检测吸光度。

结果显示（参见图3）：通过wh3核酸适体与anxa2结合的亲和力分析，结果表明wh3核酸适体能与anxa2特异结合。

实施例4

将对数生长期的mm.1s和rpmi-8226细胞2×10⁵个/ml铺至24孔板中。生长过夜后，第二天加入1μg/ml的anxa2蛋白；同时分别加入4μm的dna-lib和wh3核酸适体。继续培养72h，细胞计数，观察anxa2对细胞生长的刺激作用和wh3核酸适体对细胞生长的阻断情况。

结果显示（参见图4）：anxa2蛋白能明显促进mm.1s和rpmi-8226细胞的生长，dna-lib对anxa2蛋白促进mm.1s和rpmi-8226细胞的生长无影响，而wh3核酸适体阻断anxa2蛋白促进mm.1s和rpmi-8226细胞的生长。

实施例5

将hs-5细胞1×10⁵个/ml铺至24孔板中。生长过夜后，第二天加入加入1×10⁶个mm.1s和rpmi-8226细胞；并分别加入4μm的dna-lib和wh3核酸适体，继续培养72h。然后将上层培养的悬浮细胞，吸到96孔板中，用cck-8试剂盒检测细胞活性。

结果显示（参见图5）：anxa2核酸适体能阻断hs-5细胞促进mm.1s和rpmi-8226细胞的增殖。

实施例6

anxa2重组蛋白用结合缓冲液稀释到1μg/ml，取200μl加入到96孔板中。4℃孵育过夜，用dpbs洗四次，每次3min。用1%bsa37℃封闭2h，dpbs洗三次，每次3min。将mm.1s细胞和rpmi-8226细胞用dii（碧云天，c1036）染色20min。取100μl加入已经孵育anxa2蛋白的96孔板的孔中，同时分别加入4μm的dna-lib和wh3核酸适体，与细胞共同孵育2h。用dpbs洗3次，每次2min。通过全波长酶标仪检测荧光（激发光549nm，发射光635nm）。

附图6结果显示，wh3核酸适体抑制mm.1s和rpmi-8226细胞对anxa2蛋白的粘附作用。

<110>中南大学，湖南大学

<120>一种特异结合膜联蛋白a2的核酸适体wh3及用途

<160>3

<210>1

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<212>dna

<400>1

accgaccgtgctggactca19

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<212>dna

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<212>dna

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