原发性高甘油三酯血症易感基因ANGPTL8的变异位点及其检测方法和用途与流程

本发明涉及分子生物学和医学领域，尤其涉及一种原发性高甘油三酯血症易感基因angptl8基因rs577224723位点的基因变异，本发明还涉及该变异位点的检测方法及检测试剂盒。

背景技术：

高脂血症(hyperlipoidemia)又称血脂异常，是以血浆中甘油三脂(tg)和/或总胆固醇(tc)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)水平增高和高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)水平降低为特征的一种代谢紊乱性疾病，是动脉粥样硬化、高血压、冠心病、缺血性脑卒中、胰岛素抵抗、脂肪肝等多种疾病的独立危险因素。2016年发布的中国成人血脂异常防治指南指出，近30年来，随着人民生活水平提高、饮食习惯改变，居民的血脂水平逐步升高，血脂异常患病率明显增加，而且还有逐渐上升的趋势。调查显示，中国成人血脂异常总体患病率高达40.40％，儿童和青少年高脂血症患病率也有明显升高，预示着未来我国成人血脂异常及相关疾病负担将继续加重。

高甘油三酯血症(hypertriglyceridemia，htg)是一种复合的代谢综合征，作为血脂异常的一种，与多种疾病具有相关性。前瞻性流行病学和tg相关的通路研究报道tg浓度与冠心病显著相关。高甘油三酯血症可分为原发性高甘油三酯血症和继发性高甘油三酯血症两种类型。原发性高甘油三酯血症多与遗传有关，是由于单基因或多基因缺陷或突变，使参与脂蛋白转运或代谢的受体、酶或载脂蛋白异常所致，具有家族聚集性，也有少数是由于环境因素或不良生活方式(饮食、营养、药物)等造成的。最近的全基因组关联分析(gwas)已经确定了多种与tg浓度相关的基因。然而，在这些基因中遗传的因素仅仅能够解释不到10％的tg在人群中的变化，这也说明了可能存在其他的未知因素影响tg的变化。

继发性高甘油三酯血症是指由于其他疾病所引起的血脂异常，可引起血脂异常的疾病主要有肥胖、高血压、糖尿病、肾病综合征、甲状腺功能减退症、肾功能衰竭、肝脏疾病、系统性红斑狼疮、糖原累积症、骨髓瘤、脂肪萎缩症、急性卟啉病、多囊卵巢综合征等，此外，某些药物如利尿剂、非选择性β-受体阻滞剂、糖皮质激素等也可引起继发性高甘油三酯血症。

血管生成素样蛋白8(angiopoietin-likeprotein8，angptl8)是近年来发现的angptls家族成员，是一种与脂类代谢相关的分泌性蛋白因子，与angptls家族的angptl3、angptl4蛋白的n端具有同源性。研究表明，angptl8蛋白可通过影响脂蛋白脂酶(lpl)和甘油三酯酯酶(atgl)来影响tg代谢，其功能异常将导致人体脂代谢紊乱，并引起高甘油三酯血症。研究证实，编码该蛋白的angptl8基因位于染色体19p13.2上，与ldl-r相邻，并嵌入dock6中。

国外进行的多项研究表明，angptl8基因变异可导致血浆tg水平降低，hdl-c水平改变，ldl-c水平降低。2010年一项对之前46项总人数大于10万人的欧洲人群脂质相关的gwas(全基因组关联分析)研究的mate分析结果表明，rs737337位于angptl8翻译起始位点上游，其变异与hdl-c水平变化相关；2012年的一项在非裔美洲人和西班牙人群gwas研究表明，angptl8低频突变rs2278426,c.194c>t，血浆hdl-c和ldl-c水平降低；2013年一项墨西哥人群(n＝4361)gwas研究表明，angptl8突变rs2278426,c.194c>t，血浆hdl-c和ldl-c水平降低；2014年一项56538例的欧洲和非洲人群(欧洲42208例和非洲14330例)gwas研究表明，angptl8突变rs145464906，c.361c>t，血浆tg水平降低，hdl-c水平升高。但是，上述研究的对象均为欧洲、美洲和非洲人群，截至目前，针对亚洲尤其是针对中国人群的angptl8基因变异位点相关研究仍非常缺乏，鉴于不同人种间相同基因中发生单一核苷酸变异的位点往往具有一定差异，因此，很有必要对中国人群的angptl8基因变异位点进行深入研究，力争寻找到相关位点并建立相应的检测方法，并推广应用于国人原发性高甘油三酯血症易感人群的筛查、预防和早期诊断和治疗。

技术实现要素：

本发明公开了一个针对中国人群的原发性高甘油三酯血症易感基因angptl8的变异位点，所述位点为位于angptl8基因5’端非编码区中chromosome19-nc_000019.9区域11350305位点，其脱氧核糖核酸(dna)序列编号为rs577224723，所述位点的位置在seqidno:1所示的序列中。

angptl8基因详细序列可参见登录号：ng-031953.1，该基因5’端非编码区rs577224723位点的核苷酸序列可参见网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。

本发明人对angptl8基因的5’端非编码区域进行了测序。

本发明旨在提供一种检测上述原发性高甘油三酯血症易感基因angptl8变异位点的方法。

本发明还提供了一种通过对易感基因的检测来预测原发性高甘油三酯血症发病风险的方法，即检测angptl8基因5’端非编码区rs577224723位点的基因型。该基因5’端非编码区rs577224723位点发生c/a变异的基因型个体其原发性高甘油三酯血症的发病风险远高于普通人群。

上述方法的具体步骤包括：(a)抽提样品的基因组dna，扩增获得angptl8基因5’端非编码区；(b)通过特异性引物扩增获得该基因包含5’端非编码区rs577224723位点的区域，所述特异性引物序列如seqidno:2-3所示，扩增产物为seqidno:4；(c)检测步骤；(d)产物中基因变异位点rs577224723位点的基因型分析。

上述方法中涉及的抽提基因组dna、测序、扩增等技术均可采用本领域的常规操作方法。

本发明还涉及了angptl8基因rs577224723位点基因变异检测在预测原发性高甘油三酯血症试剂盒和原发性高甘油三酯血症诊断及治疗药物中的应用。

本发明提供了一种检测原发性高甘油三酯血症易感基因变异位点的试剂盒，其中包含扩增angptl8基因rs577224723位点区域的特异性引物。

在本发明的一个实施例中，扩增angptl8基因rs577224723位点区域的特异性引物序列如seqidno:2-3所示。

本发明通过深入研究，首次证明了angptl8基因变异位点rs577224723与高甘油三酯血症的发生密切相关，并且发现了该变异位点新的预测功能：angptl8基因rs577224723位点c/a基因型的改变将导致高甘油三酯血症发病风险增加。其中相关性研究结果显示，该基因的rs577224723位点在病例组中基因型主要变异为a，而在正常对照组中该基因型无变异，主要表现为c，该位点变异通过改变转录因子的结合位点发挥生理作用。

本发明提供了一种高甘油三酯血症易感性判断方法，包括以下步骤：检测受试个体的angptl8基因5’非编码区rs577224723位点的基因型，根据该基因型变异与否判断该个体患高甘油三酯血症风险是否高于普通人群。

本发明提供了一种检测样品是否存在angptl8基因rs577224723位点变异的方法，包括以下步骤：(a)用angptl8基因5’端非编码区特异性引物扩增样品的基因组dna，得到扩增产物；(b)检测扩增产物中rs577224723位点的基因型。

上述angptl8基因5’端非编码区rs577224723位点的基因型可用本领域常规技术如southern印迹法、dna序列分析、pcr和原位杂交法等检测突变。

综上所述，本发明发现并公开了一个与中国人群原发性高甘油三酯血症易感性相关的angptl8基因新的变异位点，并提供了一种检测原发性高甘油三酯血症易感基因angptl8基因5’端非编码区rs577224723位点变异的方法，包括检测该位点的基因型。此外，本发明还公开了angptl8基因rs577224723位点基因变异检测在预测原发性高甘油三酯血症试剂盒和原发性高甘油三酯血症诊断及治疗药物中的用途，并提供了相应的检测试剂盒，该试剂盒中包含扩增angptl8基因5’端非编码区和扩增rs577224723位点区域的特异性引物。本发明在一定程度上补充了国人原发性高甘油三酯血症易感基因信息的缺乏，有利于原发性高甘油三酯血症的早期筛查和诊断。同时，本发明变异位点基因型检测方法及试剂盒操作简便、快速高效、廉价经济、易于推广，从而为原发性高甘油三酯血症患病风险的预测提供了简捷的新途径，有助于高甘油三酯血症及相关心脑血管疾病的预防和治疗。

附图说明

图1是利用本发明引物通过pcr扩增后所得产物测序结果截图。显示了rs577224723的一种变异基因型的测序结果，rs577224723位点位于angptl8基因5’端非编码区中(chromosome19-nc_000019.9区域的11350305位点)。其中a图为正常对照组正向测序图，b图为原发性高甘油三酯血症患者组正向测序图。从图中可以看出，正常对照组的c碱基在原发性高甘油三酯组中变异为a碱基。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.sambrook等著，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照实验器材制造厂商所建议的条件。

实施例1原发性高甘油三酯血症相关基因筛查

研究对象：严格按照极端原发性高甘油三酯血症的入组和排除标准入选病例和对照组各100例；收集相应的临床资料信息(基本信息，生化指标，病史)及静脉血4ml；dta抗凝管收取，暂时4℃保存。分离白细胞：将盛有血液的抗凝管放入离心管中，3000r/min离心10min，可见血液分为三层：下层为红细胞，中间层为白细胞，上层为血浆，分离外周血白细胞，1.5mlep管中存放，然后置于-80℃保存。

一、提取外周血dna、测定浓度和纯度

使用qiaampdnaminikit(购自qiagen,hilden,germany)，提取外周血基因组dna。

实验试剂：

无水乙醇(分析纯)西陇化工股份有限公司

qiaampdnaminikitqiagen,hilden,germany

实验仪器：

提取方法：

取全血200μl，按照qiaampdnaminikit基因组抽提试剂盒说明书，提取基因组dna，实验步骤如下：

1、用移液枪吸20μl蛋白酶放在1.5mlep管中，加入200μl血样；

2、加入200μlbufferal至样品，震荡15s；

3、56℃金属浴加热10min；

4、加入200μl乙醇(96-100％)，震荡混匀15s；

5、混合物加入吸附柱管中，8000rpm离心1min，把柱子放到新管子中，弃滤液；

6、加入500μlbufferaw1于吸附柱中，8000rpm离心1min，把柱子放到新管子中，弃滤液；

7、加入500μlbufferaw2，8000rpm离心1min，把柱子放到新管子中，弃滤液；

8、在离心管中加入500μl无水乙醇，8000rpm离心1min，弃滤液；

9、12000rpm空转3min；

10、把吸附柱放在干净的离心管中，开盖室温静置5min，加入50μlbufferae，扣盖室温中静置5min，12000rpm离心1min。

dna浓度及纯度测定：

按照nanodrop2000仪器使用说明书检测基因组dna浓度及纯度。

实验步骤如下：

1、打开测定软件；

2、加1.5μl蒸馏水至测量孔，放下检测臂，然后抬起来用滤纸将测量孔和检测臂的水擦干；

3、用移液枪吸取1.5μlbufferae至测量孔，放下检测臂，点击blank做空白对照；

4、抬起检测臂，用滤纸将测量孔和检测臂的水擦干，吸取1.5μl样本至测量孔，放下检测臂，点击measure测量，记录od260、od280值。dna样本的浓度(μg/ml)＝od260*50；纯度值od260/od280＞2.0，表明有rna污染；纯度值od260/od280＜1.6，表明有蛋白质、有机溶剂等污染。

二、运用sanger测序法对angptl8基因上的变异位点rs577224723进行检测主要试剂和仪器：

实验步骤如下：

1、运用pcr扩增含目的位点的基因片段

引物序列：

正向引物：5’－ggatggttggttaccctagacac－3’

反向引物：5’－gacattcgcctgatgcaactatc－3’

2、pcr反应体系

3、pcr反应条件如下：

95℃10min预变性；

95℃30s变性—60℃30s退火—72℃30s延伸，共35个循环；

72℃10min延伸；4℃保存。

4、琼脂糖凝胶电泳

取琼脂糖1.8g，倒入三角烧杯，加入1xtbe缓冲液，定容至60ml，微波炉加热溶解；2min后取出烧杯，加入eb溶液2μl，混匀，倒入固定有塑料齿梳的凝胶槽；30min后取出梳子和隔板，将成型的胶放入水平电泳槽中；吸取5μl酶切产物至薄膜手套表面，加入1μl6x上样缓冲液，移液枪吹打混匀，将上述混合物加入到凝胶点样孔中，最后加入5μldl500作为marker。打开开关，设置电压120v，电泳30min后，将凝胶置入凝胶成像仪。

5、运用e.z.n.a.gelextractionkit试剂盒从琼脂糖凝胶中回收目标dna片段实验步骤如下：

1)切取目标片段的凝胶，称重，加入等倍量bindingbuffer(如凝胶0.2g，则体积为0.2ml)，于65℃温浴10min，使凝胶完全融化；

2)转移上述混合液至hibinddna柱子上，10000rpm离心1min，弃去滤液；

3)加入bindingbuffer300μl，10000rpm离心1min，弃去滤液；

4)加入spwwashbuffer700μl，10000rpm离心1min，弃去滤液；

5)重复步骤4)一次；

6)13000rpm离心2min甩干残留的液体；

7)加入50μl灭菌水在柱膜上洗脱dna，室温放置5min，10000rpm离心1min，收集滤液即为目标dna片段。

然后以回收的目标dna片段为模板，建立测序pcr反应，反应体系如下：

测序pcr反应条件如下；

96℃10min预变性；

96℃10s变性—50℃5s退火—60℃4min延伸，共25个循环；

60℃7min延伸；4℃保存。

对pcr产物进行上机前纯化，步骤如下；

1)ep管中加入2μl125mmedta，2μl3mnaac和50μl无水乙醇，混匀，室温放置15min，3000rpm离心30min，倒置ep管，甩去上清液；

2)加入70μl70％乙醇，3000rpm离心30min，倒置ep管，甩去上清液；

3)重复步骤2)一次；

4)室温挥发掉乙醇，加入10μlhidi溶解dna，95℃变性4min，迅速置冰上冷却4min后，转移至96孔板中；

5)在3130基因分析仪中进行毛细电泳分析(结果如附图1所示)。

三、统计分析：计算基因位点的突变率，进行关联分析。

四、结果分析：在极端高脂组中发现有3例携带罕见突变angptl8基因：rs577224723；而血脂正常人群中不携带该变异基因。

在本发明中提及的所有文献都在本申请中引用做参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。

sequencelisting

<110>首都医科大学附属北京安贞医院，北京市心肺血管疾病研究所

<120>原发性高甘油三酯血症易感基因angptl8的变异位点及其检测方法和用途

<130>2017

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>2325

<212>dna

<213>人体

<400>1

ataccttagaccctcagtcatgccagtgcctgctctgtgcctgctctgggccctggcaat60

ggtgacccggcctgcctcagcggcccccatgggcggcccagaactggcacagcatgagga120

gctgaccctgctcttccatgggaccctgcagctgggccaggccctcaacggtgtgtacag180

gaccacggagggacggctgacaaaggccaggaacagcctgggtctctatggccgcacaat240

agaactcctggggcaggaggtcagccggggccgggatgcagcccaggaacttcgggcaag300

cctgttggagactcaggtgggcaccgtagctgcgacactgtggggtggccaggagtccaa360

agaggagttcgtgtctagggtaaccaaccatcctggtttgcccaggactgaagggattcc420

tgggatacaagattttcagcgataaactcaggcaagtccttaggtacacaaagatgagtt480

ggacatcctactagtgacccactgtttattaagcagatggaggaggatattctgcagctg540

caggcagaggccacagctgaggtgctgggggaggtggcccaggcacagaaggtgctacgg600

gacagcgtgcagcggctagaagtccagctgaggagcgcctggctgggccctgcctaccga660

gaatttgaggtcttaaaggtaaggagctcccccaaccctagtgggctgagaccctgattt720

ccggccagaactcgcttctgcaccttgagtcccaaagacctcccagatcagcctcccagc780

tctgtggcctctaccctgcatgtccccagacaaaactcaagtccttttgtgtgcctcagt840

ttcccttttgtgtgcctcagttgcaaataagggcaacacctgatatctcacagtagggcc900

aggtactcaatgcaggtaaaatattcagcatggggcgggcacacagttggtgctcaataa960

attctttttttttttttttttgagacagagtctcactgttgcccaggctggagtgcagtg1020

gtgtgatcttggctcactgcaacctccacctcctaggttcaagtgattctcctgcctcag1080

cctcctgagtagctggaattacaggtgcaccagctaatttttgtattttttagtagagat1140

gggatttcaccatgttggccaggctggtctcgaactcctgacctcaagggatctgcctgc1200

ctcggtttcccaaagtgctgggattacaggtgtgagccactacacctggccaataaattc1260

ttactactagagaaactggtaacattttgtgagcacccagtaagtacccagcactgttct1320

atgccctttaataatccatatgatggccgggcatggtggctcatgcctgtaatcccagca1380

ctttgggtagctaaggtgggtggaacacttaaggtcaggagttcgagaccaccctggcca1440

acatggtgaaaccccgtctctactaaaaatacaaaaaattagctgggcgtggtggcacat1500

gcctgtagtcccagctactcaggaggcttaggtaggagaatcgcttgaacctgggaggtg1560

gaggttgcagtgagctgagatcgtgtcattgcactcagcctgggtgacagagagagactc1620

aaaaaaaaaaaaaaatccataggatgttcatcacctccccatgaagtgagtcctatttta1680

tccccattttacagatggggaaactgaggccaaagagcattgttgacttgctgggtcaca1740

cagatacaatgaggggctggggcagagggtcaggggatgggaggtgaggtggctgtcggc1800

tgaggtttccattctgacccccacaggctcacgctgacaagcagagccacatcctatggg1860

ccctcacaggccacgtgcagcggcagaggcgggagatggtggcacagcagcatcggctgc1920

gacagatccaggagaggtgagcctggcaggggtttggcaggcagggcagttggatggggg1980

gcgcacagggcagctggaaaggggccccctcacctgggctgagccacatctccctcccca2040

gactccacacagcggcgctcccagcctgaatctgcctggatggaactgaggaccaatcat2100

gctgcaaggaacacttccacgccccgtgaggcccctgtgcagggaggagctgcctgttca2160

ctgggatcagccagggcgccgggccccacttctgagcacagagcagagacagacgcaggc2220

ggggacaaaggcagaggatgtagccccattggggaggggtggaggaaggacatgtaccct2280

ttcatgcctacacacccctcattaaagcagagtcgtggcatctca2325

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ggatggttggttaccctagacac23

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gacattcgcctgatgcaactatc23

<210>4

<211>512

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

cgggcttagaagttagggtaatgaatgagagaccacagtgtcgcagctacggtgcccacc60

tgagtctccaacaggcttgcccgaagttcctgggctgcatcccggccccggctgacctcc120

tgccccaggagttctattgtgcggccatagagacccaggctgttcctggcctttgtcagc180

cgtccctccgtggtcctgtacacaccgttgagggcctggcccagctgcagggtcccatgg240

aagagcagggtcagctcctcatgctgtgccagttctgggccgcccatgggggccgctgag300

gcaggccgggtcaccattgccagggcccagagcaggcacagagcaggcactggcatgact360

gaggttctaaggtatagccacagcactgtcactgaagccttttatgcctcatacccccac420

tgatccccagtcaatcgttaactggccgacctggtgccccgcattgcacaagggcctggc480

agtggtgcgatagttgcatagcggaaatgtca512