一种斜带石斑鱼CCR12的多克隆抗体制备方法及其应用与流程

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种斜带石斑鱼ccr12的多克隆抗体制备方法及其应用。

背景技术：

趋化因子是一类分子量非常小的细胞因子，他们具有相似的单体结构(baggiolini，1998；jinetal.，2005)。根据其结构和4个保守半胱氨酸的排列顺序，可将趋化因子分为：cxc型、cc型、xc型、cx3c型和cx型等5类(murphy，etal.，2000；nomiyamaetal.，2008)。趋化因子行使功能时，需要与其相应的受体结合。xcl1是一种xc型趋化因子，在稳态、病原感染或炎症反应时，由胸腺髓样上皮细胞、或激活的t细胞、nk细胞、以及nkt细胞产生(leietal.，2012)。xcr1是xcl1唯一的受体，由cd8α⁺和cd11b^-cd103⁺dc细胞分泌(alexandreetal.，2013)。xcl1-xcr1轴在维持内稳态、调节性t细胞产生、以及dc细胞介导的细胞毒性反应中都起到重要作用(leietal.，2012)。此外，xcl1-xcr1轴还参与感染和自生免疫疾病。

目前，鼠基因组中只鉴定到xcl1这一种趋化因子xc亚家族成员，但在人基因组中鉴定到xcl1和xcl2两种(devriesetal.，2006；foxetal.，2015)。xcl1是哺乳动物和鸟中普遍存在的趋化因子，但xcl2仅仅在一些物种中存在(nomiyamaetal.，2011)。在鱼中，目前尚未鉴定到xcl1或xcl2同源蛋白，但发现了3种xcr1样趋化因子受体，即xcr1、xcr1l和ccr12(grimholtetal.，2015；nomiyamaetal.，2011)。其中xcr1l和ccr12只在鱼类基因组中发现，但关于其功能研究甚少，且抗xcr1l或ccr12抗体的缺乏也限制了对其阳性细胞的分离及功能的研究。截止目前，尚未有关于鱼类ccr12体外表达的任何报道，更无关于ccr12多克隆抗体的研究。

我们研究发现：刺激隐核虫感染后，石斑鱼ccr12在皮肤、鳃和脾脏中的表达量显著增加，推测ccr12阳性细胞参与石斑鱼抗寄生虫感染过程。为进一步揭示石斑鱼ccr12阳性细胞在寄生虫感染组织中的迁移或增殖情况，鉴定ccr12阳性细胞类型，本研究首次构建了石斑鱼ccr12胞外区表达载体，首次通过原核系统表达纯化了ccr12的n-端区和3个胞外区重组蛋白，并最终首次制备了兔抗ccr12重组蛋白多克隆抗体，该抗体能特异性识别石斑鱼ccr12蛋白，且标记血液中的细胞，为我们今后标记ccr12阳性细胞并开展其抗寄生虫感染研究奠定基础。

技术实现要素：

到目前为止，尚未有人制备过斜带石斑鱼的ccr12多克隆抗体，关于ccr12多克隆抗体的应用更无任何报道，而本发明通过基因工程方法，首次成功表达纯化了斜带石斑鱼ccr12，并首次制备了兔抗ccr12重组蛋白多克隆抗体，同时对其初步应用也进行了一定研究。

本发明的目的在于提供一种斜带石斑鱼ccr12的多克隆抗体制备方法及其应用，具体步骤如下：

(一)石斑鱼ccr12基因克隆及序列分析：

1、石斑鱼脾脏总rna的提取

(1)从液氮中快速取出冻存的脾脏，进行液氮研磨，待研磨充分后，加入3mltrizolreagent，待其快融化时，吸1ml至1.5mlep管中，冰上放置；

(2)每管中加入20％氯仿(即1mltrizolreagent加入0.2ml氯仿)，剧烈震荡15s，冰上静置3min可看到分层现象；

(3)4℃，12000g离心15min，管中液体分为三层，从上到下依次为水层、蛋白质层、有机层，吸取上清至一新的1.5mlep管中；

(4)向管中加入0.5ml异丙醇，轻轻倒转ep管，冰上静置10min；

(5)4℃，12000g离心10min，弃上清(不要连续倒转)；

(6)每管中加入1ml75％乙醇(用depc水配制)，用枪头轻轻吹起沉淀；

(7)4℃，7500g离心5min，去上清；

(8)重复(6)、(7)步骤一次；

(9)用15μlrnase-free水溶解rna；

(10)用2％琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整度，用核酸浓度测定仪测rna的浓度，a260/a280显示其纯度，剩余样品-70℃放置待用。

2、一链cdna的合成

先去除基因组dna污染，再反转录为一链cdna。按照下表1添加各组分，轻轻混匀，短暂离心；

表1去除基因组dna污染配方

(1)pcr仪37℃孵育30min以去除基因组dna污染；

(2)加入1μl50mmedta，65℃孵育10min灭活dnasei；

(3)每微克总rna加入1μloligo(dt)20(10pmol/μl)，65℃孵育5min后立即放于冰上以消除rna的二级结构，提高逆转率的效率；

(4)按下表2配制逆转录反应体系，反应程序为：42℃、30min，99℃、5min，4℃、5min。产物-20℃待用。

表2反转录为cdna配方

3、ccr12序列的扩增

根据石斑鱼转录组信息，将编码ccr12的contig放到ncbi上查找orf区，并进行序列比对，在orf区外侧设计引物(表3)，以上一步骤获得的脾脏cdna为模板pcr扩增目的基因的orf区。

表3基因克隆引物

pcr扩增反应液的配方如下表4所示。pcr反应条件为：98℃，1min，(98℃，10s；55℃，15s；72℃，1min)35个循环，最后72℃终延伸10min。用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物。

表4pcr扩增体系配方

4、目的片段的胶回收

目的片段pcr产物的回收和纯化按照如下步骤：

(1)在紫外灯下照胶，并尽可能快的切下目的条带放置于一新的已称重的1.5mlep管中；

(2)给ep管称重，计算胶体的质量和体积(胶体的体积按照1ml/g计算)；

(3)按照1倍体积的凝胶体积加入bindingbuffer(xp2)并置于60℃水浴锅中孵育直至凝胶全部溶解，期间间隔2-3min轻轻混匀凝胶溶解液；

(4)将试剂盒中的dnaminicolumn与2mlcollectiontube配套放好；

(5)将(3)中的溶解液转移至minicolumn中，室温10000g离心1min；

(6)去除流出液并重复(5)直至所有的凝胶溶解液都经minicolumn底部的滤膜离心过滤；

(7)向minicolumn中加入300μlbindingbuffer(xp2)，室温13000g离心1min，去流出液；

(8)向minicolumn中加入700μlspwwashbuffer，室温13000g离心1min，去流出液；

(9)重复步骤(8)一次；

(10)室温13000g离心2min使空的minicolumn的滤膜尽量脱水；

(11)将minicolumn放置于一新的1.5mlep管中，加入15-30μlelutionbuffer于滤膜中央，室温静置1min后，室温13000g离心1min洗脱dna；

(12)将上述1.5mlep管于-20℃保存。

5、目的片段的克隆与转化

按照表5体系进行加样：

表5平末端载体连接试剂盒使用配方

(1)25℃连接30min；

(2)将连接产物加至50μldh5α感受态(克隆菌)中，冰浴30min；

(3)42℃水浴热激90s，冰浴2min；

(4)加入1ml新鲜lb培养液，37℃，200r/min振荡培养90min；

(5)4000g离心5min，去掉800μl上清，将菌液重新吹打悬起，取100μl菌液涂布到含氨苄的lb固体培养基上，37℃培养过夜；

(6)挑取单克隆于10μllb培养液中作为模板，通过菌落pcr检测插入的片段大小；

(7)将片段大小一致的阳性克隆接种于5ml含氨苄的lb液体培养液中，37℃培养过夜，吸1ml送测序。

6、序列分析

采用smart程序(http：//smart.embl-heidelberg.de/)对序列的信号肽和蛋白的结构域进行预测，用tmhmmserverv.2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/tmh-mm/)对受体的跨膜结构域进行预测，克隆得到的基因和其它物种相对应氨基酸序列的比对用bioedit和clustalomega(http：//www.ebi.ac.uk/tools/msa/clust-alo/)进行，系统进化树用mega5.04(beta2)软件进行。

通过以上方法，我们克隆得到了斜带石斑鱼ccr12的orf序列，全长1074bp，编码357个氨基酸的多肽，理论等电点和分子量分别为8.87和41da。smart序列分析显示：石斑鱼ccr12有1个n-端区、3个胞外区、3个胞内区和1个c-端区构成，结果可以参见图1：其中波浪线分别代表n-和c-端序列，细下划线分别代表跨膜区，粗下划线代表胞外区和胞内区。多序列比对显示：石斑鱼ccr12与daniorerio和oryziaslatipes相似度分别为62％和73％，与d.rerio其他ccr12以及xenopustropicalis的相似度为47％-48％。进化分析显示：石斑鱼ccr12与其他鱼类ccr12归为一支(见图2)，与序列比对结果一致。

(二)石斑鱼ccr12原核表达及纯化：

1、ccr12重组表达载体的构建

(1)目的片段扩增

a.通过smart软件分析，石斑鱼ccr12是一种七次跨膜蛋白，由一个n-端区、3个胞外区、3个胞内区和一个c-端区构成；本研究表达的是石斑鱼ccr12的n-端区和3个胞外区；

b.以ccr12nf/r、ccr12el1f/r、ccr12el2f/r和ccr12el3f/r为引物，以前面合成的cdna为模板，用高保真酶primestar^tmmix分别扩增ccr12的n-端区和3个胞外区；

c.再以ccr12nf/el1r为引物，步骤b扩增的ccr12n-端区和第1个胞外区为模板，通过重组pcr连接n-端区和第1个胞外区；同时，以ccr12el2f/el3r为引物，以步骤b扩增的ccr12的第2和第3个胞外区为模板，通过重组pcr连接第2和第3个胞外区；

d.最后，以ccr12nf/el3r为引物，以步骤c连接成功的两个融合片段为模板，通过重组pcr将ccr12的n-端区和3个胞外区连接到一起，胶回收目的片段。所用的引物详见表6，下划线部分表示酶切位点。

表6ccr12扩增用引物

(2)表达载体的提取

复苏转化有pet32a表达载体的菌株，挑取单克隆扩大培养，进行质粒抽提，具体步骤如下：

a.室温1000g、1min离心收集菌液；

b.向菌体沉淀中加入250μlsolutioni，枪头吹打重悬菌体；

c.加入250μlsolutionii，轻轻颠倒混匀几次直至细菌悬液变澄清；

d.加入350μlsolutioniii，轻轻颠倒混匀几次直至出现白色絮状沉淀；

e.室温1000g离心10min；

f.小心尽可能的吸尽上清于一新的hibinddna结合柱；

g.室温10000g离心1min，去流出液；

h.向柱中加入500μlbufferhb，室温10000g离心1min，去流出液；

i.向柱中加入700μlwashbuffer，室温10000g离心1min，去流出液；

j.重复步骤i)一次；

k.室温13000g离心2min使空的minicolumn的滤膜尽量脱水；

l.将hibinddna结合柱放置于一新的1.5mlep管中，加入15-30μlelutionbuffer于滤膜中央，室温静置1min后，室温13000g离心1min洗脱dna；

m.将上述1.5mlep管于-20℃保存。

(3)双酶切目的片段和表达载体

a.将步骤(1)胶回收的目的片段和步骤(2)提取的表达载体按表7的体系加样；

b.混匀后，瞬时离心，37℃酶切0.5h；

c.胶回收酶切后的目的片段和表达载体；

表7quickcut酶切体系

(4)重组表达载体构建

a.将步骤(3)双酶切后回收的目的片段和表达载体按表8体系加样；

b.16℃连接过夜；

c.将连接产物转化到表达菌bl21的感受态细胞中；

d.通过菌落pcr法鉴定阳性克隆，并进行测序。

表8重组表达载体的连接体系

用所设计的引物通过重组pcr，将趋化因子受体ccr12的n-端区和3个胞外区段拼接起来，经过胶回收、双酶切后，连接到pet32a原核表达载体上。转化bl21后，挑取1个阳性克隆测序，此阳性克隆序列完全正确。结果见图3，其中泳道1为ccr12的orf区的克隆，2、3、4、5分别为ccr12的胞外n-端、el1、el2、el3区段的克隆，泳道6为ccr12的胞外n端和el1重组pcr结果，泳道7为ccr12的el2和el3重组pcr结果，泳道8为泳道6和7产物重组pcr结果。

2、ccr12重组蛋白表达条件的优化和可溶性分析

(1)ccr12重组蛋白的诱导表达

a.将上一步骤测序正确的重组蛋白表达菌株接种到一新的含amplb液体培养液中，37℃、200r/min振荡培养过夜；

b.将培养过夜的菌液按照1∶50比例接种到新鲜的lb培养液中，37℃、200r/min振荡培养至od600为0.6-0.8；

c.添加iptg至终浓度为1mm，30℃、200r/min振荡培养6h；

d.取1ml菌液，室温4000r/min离心5min去掉上清后；

e.以100μl双蒸水重悬，按照1∶4比例与5×sds-pageloadingbuffer混匀，水浴煮沸5min；

f.将上述样品进行sds-page凝胶电泳，检测ccr12重组蛋白是否表达，以pet32a的表达菌株的诱导组作为对照；

(2)重组蛋白表达条件的优化

a.iptg的浓度：分别用终浓度0.1mm、0.3mm、0.5mm、0.7mm和0.9mm的iptg诱导表达菌6h，收集菌体，处理后上样跑电泳；

b.诱导的时间：在最佳诱导浓度条件下，于诱导后的第0h、2h、4h和6h收集菌体，处理后上样跑电泳。

将阳性克隆在37℃扩大培养至菌液的od600达到0.6-0.8时，加入0mm、0.1mm、0.3mm、0.5mm、0.7mm和0.9mm的iptg在30℃诱导表达6h收集菌体，sds-page电泳分析表明，重组蛋白ccr12的最优诱导浓度为0.5mm。在此基础上对诱导的时间进行优化。从图4中可以看出，在诱导4h时，重组蛋白ccr12的表达量已经达到最大。因此，大量诱导表达的条件为30℃、0.5mm、4h。

在图4中，c为重组蛋白的表达量与iptg诱导浓度的关系，c则为在最优的iptg诱导浓度下，蛋白的表达量随时间变化的关系。m泳道表示蛋白marker，c中1-6泳道表示在30℃，iptg的使用量分别为0mm、0.1mm、0.3mm、0.5mm、0.7mm和0.9mm诱导表达6h，重组蛋白的表达情况。c中1-4泳道分别表示在最优iptg诱导浓度下，诱导时间为0h、2h、4h和6h时重组蛋白的表达情况，目的蛋白条带用黑色箭头标出。

(3)重组蛋白可溶性分析

a.用步骤(2)优化的条件，诱导重组蛋白表达，离心收集菌体；

b.按原始菌液50∶1比例加入pbs重悬后4℃、10000g离心3min，去上清；

c.加入等量的lysisbuffer重悬菌体，超声破碎(超声破碎条件为200w，超声5s，间隔8s，超声15min，3个循环)；

d.超声结束后，4℃、8000g离心15min，分别收集上清和沉淀；

e.经处理后，sds-page检测重组蛋白的可溶性。

最终sds-page分析表明，ccr12以可溶性形式存在于上清中，参见图5，其中m泳道表示蛋白marker。1、2、3泳道分别表示全菌液、上清和沉淀。

3、ccr12重组蛋白的纯化

(1)将含重组表达载体的bl21菌扩大培养至1000ml，37℃、200r/min振荡培养至od600为0.6-0.8，添加iptg至步骤2优化的最优终浓度，30℃、200r/min培养适当时间；

(2)4℃、1000g离心1min收集全部菌体；

(3)50ml0.01mmpbs重悬菌体，4℃、1000g离心10min去上清；

(4)50mllysisbuffer重悬菌体，超声破碎，4℃、1000g离心10min收集上清；

(5)通过washbuffer和含不同浓度咪唑的elutionbuffer依次对镍柱进行洗涤并收集流出液，用sds-page检测洗脱效果；

(6)纯化的蛋白液在pbs中透析过夜后，用超滤离心管进行浓缩，浓缩液-80℃保存。

最终重组蛋白经镍柱纯化后，得到较纯的单一目的条带，参见图5，其中m泳道表示蛋白marker，泳道4为经亲和层析处理得到的纯化样品，目的蛋白条带用黑色箭头标出。

(三)斜带石斑鱼ccr12的多克隆抗体制备及其应用：

1、ccr12多克隆抗体制备：

(1)将从广东省实验动物中心购买的两只新西兰雄兔在无菌动物房适应饲养2周；

(2)取约2mg重组蛋白，加入pbs至2ml，加入2ml弗氏完全佐剂，反复推拉共轭注射器使重组蛋白乳化；

(3)用无菌注射器吸取已与弗氏完全佐剂乳化的重组蛋白，对新西兰雄兔分多个位点进行皮下注射(注射位点需先用75％酒精棉消毒)，注射剂量为1ml/只；

(4)两周后，进行加强免疫，以初始免疫一半重组蛋白量与等量的弗氏不完全佐剂乳化混匀后，对新西兰雄兔进行皮下注射，共加强免疫3次，每次间隔时间均为2周；

(5)最后一次加强免疫7天后，对免疫新西兰雄兔进行颈动脉采血，室温静置2h，4℃过夜，4℃、4000r/min离心30min后小心吸取上层血清，56℃处理30min以灭活补体，用proteina柱子进行纯化，分装后-20℃保存(首免之前采血作为阴性对照)。

2、elisa测定多抗效价：

(1)用包被液稀释纯化的蛋白抗原至20μg/ml，在96孔酶标板中每孔加入100μl，4℃过夜包被；

(2)拍干孔中的液体，加入200μl洗涤液，振荡洗涤3次，每次3min，弃去，拍干；

(3)每孔中加入200μl封闭液，室温封闭1h；

(4)弃去孔中封闭液，拍干，加入200μl洗涤液，振荡洗涤3次，每次3min，弃去，拍干；

(5)将多克隆抗体与pbs按照1∶10比例进行连续的梯度稀释，每孔中加入100μl，设置3个平行，以pbs作为阴性对照组，37℃孵育2h；

(6)弃去孔中一抗，拍干，加入200μl洗涤液，振荡洗涤3次，每次3min，弃去，拍干；

(7)每孔加入100μl稀释的二抗，避光，37℃孵育2h；

(8)弃去孔中二抗，拍干，加入200μl洗涤液，振荡洗涤3次，每次3min，弃去，拍干；

(9)配制新鲜底物液，每孔中加入100μl，避光，37℃孵育20min；

(10)每孔中加入50μl终止液，用酶标仪检测450nm波长时各孔的吸光度值，标准为p/n≥2.1或p≥n+3d。

最终经elisa检测，多克隆抗体的效价为1∶100000，此效价较高，可以满足后续免疫组化实验的需求。

3、westernblotting检测多抗的特异性：

a：为了检测制备的多克隆抗体是否能够识别天然蛋白，分别提取斜带石斑鱼头肾的总蛋白和膜蛋白进行westernblotting实验。石斑鱼用丁香酚进行麻醉后，取其头肾组织快速置于一新的1.5mlep管中，置于液氮中保存，用于进行后续的总蛋白和膜蛋白提取，具体步骤如下。

(1)组织总蛋白的提取：

a)液氮环境下充分研磨组织直至成为匀浆状；

b)向研磨充分的组织中加入组织裂解液，冰浴30min(裂解液实验前加入pmsf至终浓度为1mm)；

c)超声破碎仪对裂解样品进行超声破碎(程序为超声破碎5是，间隔10s，2次)；

d)4℃，14000r/min离心15min后小心吸取上清，-80℃保存。

(2)组织膜蛋白的提取

a)往样品中加入10mmtris-hcl至覆盖样品；

b)加入等体积预冷的tritonx-114抽提缓冲液(缓冲液用前需混匀)，加入pmsf蛋白酶抑制剂至其终浓度为1mm；

c)用漩涡震荡仪震荡样品1min，冰浴5min，如此反复10次；

d)4℃，12000r/min离心15min后小心吸取上清；

e)向上清中加入等体积的蔗糖缓冲液，30℃水浴5min至出现云雾状浑浊；

f)12000r/min室温离心3min混合液将分层，冰上保存油层；

g)油层中加入9倍体积的预冷丙酮，冰上孵育1h，-20℃过夜；

h)去除丙酮，tris-hcl溶解沉淀蛋白，-80℃保存。

b：多抗的特异性检测：

(1)抗原蛋白sds-page电泳后，将凝胶按照点样泳道切割成适当大小浸泡在转膜缓冲液中；

(2)将pvdf膜裁剪成与凝胶相匹配的大小，浸泡在转膜缓冲液中；

(3)按照黑板(负极)、泡沫垫、滤纸、凝胶、pvdf膜、滤纸、泡沫垫、白板(正极)的顺序固定凝胶和pvdf膜(注意排除气泡)；

(4)将装置放入转印槽中，加入转膜缓冲液，100v转膜23min；

(5)转膜结束后，取下pvdf膜，加入10％脱脂奶粉室温封闭1h；

(6)加入适当一抗(即制备的ccr12多克隆抗体)，4℃孵育过夜；

(7)弃去一抗，用pbst洗涤3次，每次5min；

(8)加入用10％脱脂奶粉稀释的二抗室温孵育1h；

(9)弃去二抗，用pbst洗涤3次，每次5min；

(10)用化学发光法进行显示拍照。

通过westernblotting检测ccr12多克隆抗体的特异性，结果如图6所示，该多克隆抗体能特异性的识别重组蛋白，也能识别天然蛋白(约为41kda)。其中，泳道m表示marker，泳道1、2、3分别表示趋化因子受体ccr12的重组蛋白纯化样品、头肾组织全蛋白、头肾膜蛋白的sds-page结果，泳道a、b、c则分别为泳道1、2、3的样品用制得的多抗进行westernblotting的结果，箭头分别标记多克隆抗体识别的天然蛋白和重组蛋白。

4、多抗的初步应用(斜带石斑鱼外周血细胞免疫组化)：

(1)用适当剂量的丁香酚(50mg/ml)将斜带石斑鱼麻醉，用肝素钠处理过的注射器从尾静脉采血；

(2)取一干净的载玻片，滴加一滴抗凝血；

(3)用另一干净玻片，一端接触玻片上的血滴，两玻片成45°角，轻轻移动，使血滴成一直线，由玻片的一端移向另一端，成为均匀的薄层；

(4)血涂片在空气中干燥后，立即用4％多聚甲醛室温固定15min；

(5)用pbs洗3次，每次3min；

(6)用0.5％tritonx-100破膜处理20min；

(7)用pbs洗3次，每次3min；

(8)用3％h2o2室温封闭15min；

(9)用pbs洗3次，每次3min；

(10)将玻片进入柠檬酸缓冲液中，在微波炉中进行抗原修复15min，室温冷却；

(11)用pbs洗3次，每次3min；

(12)用正常山羊血清室温封闭30min；

(13)甩干玻片上的山羊血清，滴加一抗(即制备的ccr12多克隆抗体)，置于湿盒中，4℃孵育过夜；

(14)取出湿盒，37℃复温40min；

(15)用pbs洗3次，每次3min；

(16)滴加二抗，37℃孵育40min；

(17)用pbs洗3次，每次3min；

(18)dab显色1min，蒸馏水冲洗5min；

(19)苏木素37℃复染15min，自来水冲洗5min；

(20)1％盐酸酸化5s，自来水冲洗5min；

(21)75％、80％、90％、95％、95％、100％、100％乙醇依次脱水3min；

(22)1/2100％乙醇+1/2100％二甲苯处理3min；

(23)二甲苯i、ii透明5min；

(24)中性树脂封片，37℃过夜后，在显微镜下拍照观察。

制备的趋化因子受体ccr12多克隆抗体通过免疫组化可标记血涂片的阳性细胞，结果如图7所示，ccr12阳性细胞直径约为9μm，具有不同的核型，包括肾形和圆形。其中a、b分别显示的是ccr12阳性细胞的不同核型，a为肾形，b为圆形。

附图说明

图1为石斑鱼ccr12核苷酸和蛋白序列。

图2为石斑鱼ccr12进化树分析图。

图3为ccr12重组表达载体的构建结果图。

图4为ccr12重组蛋白表达条件的优化示意图。

图5为ccr12重组蛋白的可溶性分析和纯化结果图。

图6为ccr12多克隆抗体的特异性检测结果。

图7为血涂片ccr12阳性细胞免疫组化结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

一种斜带石斑鱼ccr12的多克隆抗体制备方法及其应用，具体步骤如下：

(一)石斑鱼ccr12基因克隆及序列分析：

1、石斑鱼脾脏总rna的提取

(1)从液氮中快速取出冻存的脾脏，进行液氮研磨，待研磨充分后，加入3mltrizolreagent，待其快融化时，吸1ml至1.5mlep管中，冰上放置；

(2)每管中加入20％氯仿(即1mltrizolreagent加入0.2ml氯仿)，剧烈震荡15s，冰上静置3min可看到分层现象；

(3)4℃，12000g离心15min，管中液体分为三层，从上到下依次为水层、蛋白质层、有机层，吸取上清至一新的1.5mlep管中；

(4)向管中加入0.5ml异丙醇，轻轻倒转ep管，冰上静置10min；

(5)4℃，12000g离心10min，弃上清(不要连续倒转)；

(6)每管中加入1ml75％乙醇(用depc水配制)，用枪头轻轻吹起沉淀；

(7)4℃，7500g离心5min，去上清；

(8)重复(6)、(7)步骤一次；

(9)用15μlrnase-free水溶解rna；

(10)用2％琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整度，用核酸浓度测定仪测rna的浓度，a260/a280显示其纯度，剩余样品-70℃放置待用。

2、一链cdna的合成

先去除基因组dna污染，再反转录为一链cdna。按照下表1添加各组分，轻轻混匀，短暂离心；

表1去除基因组dna污染配方

(1)pcr仪37℃孵育30min以去除基因组dna污染；

(2)加入1μl50mmedta，65℃孵育10min灭活dnasei；

(3)每微克总rna加入1μloligo(dt)20(10pmol/μl)，65℃孵育5min后立即放于冰上以消除rna的二级结构，提高逆转率的效率；

(4)按下表2配制逆转录反应体系，反应程序为：42℃、30min，99℃、5min，4℃、5min。产物-20℃待用。

表2反转录为cdna配方

3、ccr12序列的扩增

根据石斑鱼转录组信息，将各contig放到ncbi上查找orf区，并进行序列比对，在orf区外侧设计引物(表3)，以上一步骤获得的组织cdna为模板pcr扩增目的基因的orf区。

表3基因克隆引物

pcr扩增反应液的配方如下表4所示。pcr反应条件为：98℃，1min，(98℃，10s；55℃，15s；72℃，1min)35个循环，最后72℃终延伸10min。用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物。

表4pcr扩增体系配方

4、目的片段的胶回收

目的片段pcr产物的回收和纯化按照如下步骤：

(1)在紫外灯下照胶，并尽可能快的切下目的条带放置于一新的已称重的1.5mlep管中；

(2)给ep管称重，计算胶体的质量和体积(胶体的体积按照1ml/g计算)；

(3)按照1倍体积的凝胶体积加入bindingbuffer(xp2)并置于60℃水浴锅中孵育直至凝胶全部溶解，期间间隔2-3min轻轻混匀凝胶溶解液；

(4)将试剂盒中的dnaminicolumn与2mlcollectiontube配套放好；

(5)将(3)中的溶解液转移至minicolumn中，室温10000g离心1min；

(6)去除流出液并重复(5)直至所有的凝胶溶解液都经minicolumn底部的滤膜离心过滤；

(7)向minicolumn中加入300μlbindingbuffer(xp2)，室温13000g离心1min，去流出液；

(8)向minicolumn中加入700μlspwwashbuffer，室温13000g离心1min，去流出液；

(9)重复步骤(8)一次；

(10)室温13000g离心2min使空的minicolumn的滤膜尽量脱水；

(11)将minicolumn放置于一新的1.5mlep管中，加入15-30μlelutionbuffer于滤膜中央，室温静置1min后，室温13000g离心1min洗脱dna；

(12)将上述1.5mlep管于-20℃保存。

5、目的片段的克隆与转化

按照表5进行操作：

表5平末端载体连接试剂盒使用配方

(1)25℃连接30min；

(2)将连接产物加至50μldh5α感受态(克隆菌)中，冰浴30min；

(3)42℃水浴热激90s，冰浴2min；

(4)加入1ml新鲜lb培养液，37℃，200r/min振荡培养90min；

(5)4000g离心5min，去掉800μl上清，将菌液重新吹打悬起，取100μl菌液涂布到含氨苄的lb固体培养基上，37℃培养过夜；

(6)挑取单克隆于10μllb培养液中作为模板，通过菌落pcr检测插入的片段大小；

(7)将片段大小一致的阳性克隆接种于5ml含氨苄的lb液体培养液中，37℃培养过夜，吸1ml送测序。

6、序列分析

采用smart程序(http：//smart.embl-heidelberg.de/)对序列的信号肽和蛋白的结构域进行预测，用tmhmmserverv.2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/tmh-mm/)对受体的跨膜结构域进行预测，克隆得到的各基因和其它物种相对应氨基酸序列的比对用bioedit和clustalomega(http：//www.ebi.ac.uk/tools/msa/clust-alo/)进行，系统进化树用mega5.04(beta2)软件进行。

通过以上方法，我们克隆得到了斜带石斑鱼ccr12的orf序列，全长1074bp，编码357个氨基酸的多肽，理论等电点和分子量分别为8.87和41da。smart序列分析显示：石斑鱼ccr12有1个n-端区、3个胞外区、3个胞内区和1个c-端区构成，结果可以参见图1：其中波浪线分别代表n-和c-端序列，细下划线分别代表跨膜区，粗下划线代表胞外区和胞内区。多序列比对显示：石斑鱼ccr12与daniorerio和oryziaslatipes相似度分别为62％和73％，与d.rerio其他ccr12以及xenopustropicalis的相似度为47％-48％。进化分析显示：石斑鱼ccr12与其他鱼类ccr12归为一支(见图2)，与序列比对结果一致。

(二)石斑鱼ccr12原核表达及纯化：

1、ccr12重组表达载体的构建

(1)目的片段扩增

a.通过smart软件分析，石斑鱼ccr12是一种七次跨膜蛋白，由一个n-端区、3个胞外区、3个胞内区和一个c-端区构成；本研究表达的是石斑鱼ccr12的n-端区和3个胞外区；

b.以ccr12nf/r、ccr12el1f/r、ccr12el2f/r和ccr12el3f/r为引物，以前面合成的cdna为模板，用高保真酶primestar^tmmix分别扩增ccr12的n-端区和3个胞外区；

c.再以ccr12nf/el1r为引物，步骤b扩增的ccr12n-端区和第1个胞外区为模板，通过重组pcr连接n-端区和第1个胞外区；同时，以ccr12el2f/el3r为引物，以步骤b扩增的ccr12的第2和第3个胞外区为模板，通过重组pcr连接第2和第3个胞外区；

d.最后，以ccr12nf/el3r为引物，以步骤c连接成功的两个融合片段为模板，通过重组pcr将ccr12的n-端区和3个胞外区连接到一起，胶回收目的片段。所用的引物详见表6，下划线部分表示酶切位点。

表6ccr12扩增用引物

(2)表达载体的提取

复苏转化有pet32a表达载体的菌株，挑取单克隆扩大培养，进行质粒抽提，具体步骤如下：

m.室温1000g、1min离心收集菌液；

n.向菌体沉淀中加入250μlsolutioni，枪头吹打重悬菌体；

o.加入250μlsolutionii，轻轻颠倒混匀几次直至细菌悬液变澄清；

p.加入350μlsolutioniii，轻轻颠倒混匀几次直至出现白色絮状沉淀；

q.室温1000g离心10min；

r.小心尽可能的吸尽上清于一新的hibinddna结合柱；

s.室温10000g离心1min，去流出液；

t.向柱中加入500μlbufferhb，室温10000g离心1min，去流出液；

u.向柱中加入700μlwashbuffer，室温10000g离心1min，去流出液；

v.重复步骤i)一次；

w.室温13000g离心2min使空的minicolumn的滤膜尽量脱水；

x.将hibinddna结合柱放置于一新的1.5mlep管中，加入15-30μlelutionbuffer于滤膜中央，室温静置1min后，室温13000g离心1min洗脱dna；

m.将上述1.5mlep管于-20℃保存。

(3)双酶切目的片段和表达载体

a.将步骤(1)胶回收的目的片段和步骤(2)提取的表达载体按表7的体系加样；

b.混匀后，瞬时离心，37℃酶切0.5h；

c.胶回收酶切后的目的片段和表达载体；

表7quickcut酶切体系

(4)重组表达载体构建

a.将步骤(3)双酶切后回收的目的片段和表达载体按表8体系加样；

b.16℃连接过夜；

c.将连接产物转化到表达菌bl21的感受态细胞中；

d.通过菌落pcr法鉴定阳性克隆，并进行测序。

表8重组表达载体的连接体系

用所设计的引物通过重组pcr，将趋化因子受体ccr12的n-端区和3个胞外区段拼接起来，经过胶回收、双酶切后，连接到pet32a原核表达载体上。转化bl21后，挑取1个阳性克隆测序，此阳性克隆序列完全正确。结果见图3，其中泳道1为ccr12的orf区的克隆，2、3、4、5分别为ccr12的胞外n-端、el1、el2、el3区段的克隆，泳道6为ccr12的胞外n端和el1重组pcr结果，泳道7为ccr12的el2和el3重组pcr结果，泳道8为泳道6和7产物重组pcr结果。

2、ccr12重组蛋白表达条件的优化和可溶性分析

(1)ccr12重组蛋白的诱导表达

a.将上一步骤测序正确的重组蛋白表达菌株接种到一新的含amplb液体培养液中，37℃、200r/min振荡培养过夜；

b.将培养过夜的菌液按照1∶50比例接种到新鲜的lb培养液中，37℃、200r/min振荡培养至od600为0.6-0.8；

c.添加iptg至终浓度为1mm，30℃、200r/min振荡培养6h；

d.取1ml菌液，室温4000r/min离心5min去掉上清后；

e.以100μl双蒸水重悬，按照1∶4比例与5×sds-pageloadingbuffer混匀，水浴煮沸5min；

f.将上述样品进行sds-page凝胶电泳，检测ccr12重组蛋白是否表达，以pet32a的表达菌株的诱导组作为对照；

(2)重组蛋白表达条件的优化

a.iptg的浓度：分别用终浓度0.1mm、0.3mm、0.5mm、0.7mm和0.9mm的iptg诱导表达菌6h，收集菌体，处理后上样跑电泳；

b.诱导的时间：在最佳诱导浓度条件下，于诱导后的第0h、2h、4h和6h收集菌体，处理后上样跑电泳。

将阳性克隆在37℃扩大培养至菌液的od600达到0.6-0.8时，加入0mm、0.1mm、0.3mm、0.5mm、0.7mm和0.9mm的iptg在30℃诱导表达6h收集菌体，sds-page电泳分析表明，重组蛋白ccr12的最优诱导浓度为0.5mm。在此基础上对诱导的时间进行优化。从图4中可以看出，在诱导4h时，重组蛋白ccr12的表达量已经达到最大。因此，大量诱导表达的条件为30℃、0.5mm、4h。

在图4中，c为重组蛋白的表达量与iptg诱导浓度的关系，c则为在最优的iptg诱导浓度下，蛋白的表达量随时间变化的关系。m泳道表示蛋白marker，c中1-6泳道表示在30℃，iptg的使用量分别为0mm、0.1mm、0.3mm、0.5mm、0.7mm和0.9mm诱导表达6h，重组蛋白的表达情况。c中1-4泳道分别表示在最优iptg诱导浓度下，诱导时间为0h、2h、4h和6h时重组蛋白的表达情况，目的蛋白条带用黑色箭头标出。

(3)重组蛋白可溶性分析

a.用步骤(2)优化的条件，诱导重组蛋白表达，离心收集菌体；

b.按原始菌液50∶1比例加入pbs重悬后4℃、10000g离心3min，去上清；

c.加入等量的lysisbuffer重悬菌体，超声破碎(超声破碎条件为200w，超声5s，间隔8s，超声15min，3个循环)；

d.超声结束后，4℃、8000g离心15min，分别收集上清和沉淀；

e.经处理后，sds-page检测重组蛋白的可溶性。

最终sds-page分析表明，ccr12以可溶性形式存在于上清中，参见图5，其中m泳道表示蛋白marker。1、2、3泳道分别表示全菌液、上清和沉淀。

3、ccr12重组蛋白的纯化

(1)将含重组表达载体的bl21菌扩大培养至1000ml，37℃、200r/min振荡培养至od600为0.6-0.8，添加iptg至步骤2优化的最优终浓度，30℃、200r/min培养适当时间；

(2)4℃、1000g离心1min收集全部菌体；

(3)50ml0.01mmpbs重悬菌体，4℃、1000g离心10min去上清；

(4)50mllysisbuffer重悬菌体，超声破碎，4℃、1000g离心10min收集上清；

(5)通过washbuffer和含不同浓度咪唑的elutionbuffer依次对镍柱进行洗涤并收集流出液，用sds-page检测洗脱效果；

(6)纯化的蛋白液在pbs中透析过夜后，用超滤离心管进行浓缩，浓缩液-80℃保存。

最终重组蛋白经镍柱纯化后，得到较纯的单一目的条带，参见图5，其中m泳道表示蛋白marker，泳道4为经亲和层析处理得到的纯化样品，目的蛋白条带用黑色箭头标出。

(三)斜带石斑鱼ccr12的多克隆抗体制备及其应用：

1、ccr12多克隆抗体制备：

(1)将从广东省实验动物中心购买的两只新西兰雄兔在无菌动物房适应饲养2周；

(2)取约2mg重组蛋白，加入pbs至2ml，加入2ml弗氏完全佐剂，反复推拉共轭注射器使重组蛋白乳化；

(3)用无菌注射器吸取已与弗氏完全佐剂乳化的重组蛋白，对新西兰雄兔分多个位点进行皮下注射(注射位点需先用75％酒精棉消毒)，注射剂量为1ml/只；

(4)两周后，进行加强免疫，以初始免疫一半重组蛋白量与等量的弗氏不完全佐剂乳化混匀后，对新西兰雄兔进行皮下注射，共加强免疫3次，每次间隔时间均为2周；

(5)最后一次加强免疫7天后，对免疫新西兰雄兔进行颈动脉采血，室温静置2h，4℃过夜，4℃、4000r/min离心30min后小心吸取上层血清，56℃处理30min以灭活补体，用proteina柱子进行纯化，分装后-20℃保存(首免之前采血作为阴性对照)。

2、elisa测定多抗效价：

(1)用包被液稀释纯化的蛋白抗原至20μg/ml，在96孔酶标板中每孔加入100μl，4℃过夜包被；

(2)拍干孔中的液体，加入200μl洗涤液，振荡洗涤3次，每次3min，弃去，拍干；

(3)每孔中加入200μl封闭液，室温封闭1h；

(4)弃去孔中封闭液，拍干，加入200μl洗涤液，振荡洗涤3次，每次3min，弃去，拍干；

(5)将多克隆抗体与pbs按照1∶10比例进行连续的梯度稀释，每孔中加入100μl，设置3个平行，以pbs作为阴性对照组，37℃孵育2h；

(6)弃去孔中一抗，拍干，加入200μl洗涤液，振荡洗涤3次，每次3min，弃去，拍干；

(7)每孔加入100μl稀释的二抗，避光，37℃孵育2h；

(8)弃去孔中二抗，拍干，加入200μl洗涤液，振荡洗涤3次，每次3min，弃去，拍干；

(9)配制新鲜底物液，每孔中加入100μl，避光，37℃孵育20min；

(10)每孔中加入50μl终止液，用酶标仪检测450nm波长时各孔的吸光度值，标准为p/n≥2.1或p≥n+3d。

最终经elisa检测，多克隆抗体的效价为1∶128000，此效价较高，可以满足后续免疫组化实验的需求。

3、westernblotting检测多抗的特异性：

a：为了检测制备的多克隆抗体是否能够识别天然蛋白，分别提取斜带石斑鱼头肾的总蛋白和膜蛋白进行westernblotting实验。石斑鱼用丁香酚进行麻醉后，取其头肾组织快速置于一新的1.5mlep管中，置于液氮中保存，用于进行后续的总蛋白和膜蛋白提取，具体步骤如下。

(3)组织总蛋白的提取：

e)液氮环境下充分研磨组织直至成为匀浆状；

f)向研磨充分的组织中加入组织裂解液，冰浴30min(裂解液实验前加入pmsf至终浓度为1mm)；

g)超声破碎仪对裂解样品进行超声破碎(程序为超声破碎5是，间隔10s，2次)；

h)4℃，14000r/min离心15min后小心吸取上清，-80℃保存。

(4)组织膜蛋白的提取

i)往样品中加入10mmtris-hcl至覆盖样品；

j)加入等体积预冷的tritonx-114抽提缓冲液(缓冲液用前需混匀)，加入pmsf蛋白酶抑制剂至其终浓度为1mm；

k)用漩涡震荡仪震荡样品1min，冰浴5min，如此反复10次；

l)4℃，12000r/min离心15min后小心吸取上清；

m)向上清中加入等体积的蔗糖缓冲液，30℃水浴5min至出现云雾状浑浊；

n)12000r/min室温离心3min混合液将分层，冰上保存油层；

o)油层中加入9倍体积的预冷丙酮，冰上孵育1h，-20℃过夜；

p)去除丙酮，tris-hcl溶解沉淀蛋白，-80℃保存。

b：多抗的特异性检测：

(11)抗原蛋白sds-page电泳后，将凝胶按照点样泳道切割成适当大小浸泡在转膜缓冲液中；

(12)将pvdf膜裁剪成与凝胶相匹配的大小，浸泡在转膜缓冲液中；

(13)按照黑板(负极)、泡沫垫、滤纸、凝胶、pvdf膜、滤纸、泡沫垫、白板(正极)的顺序固定凝胶和pvdf膜(注意排除气泡)；

(14)将装置放入转印槽中，加入转膜缓冲液，100v转膜23min；

(15)转膜结束后，取下pvdf膜，加入10％脱脂奶粉室温封闭1h；

(16)加入适当一抗(即制备的ccr12多克隆抗体)，4℃孵育过夜；

(17)弃去一抗，用pbst洗涤3次，每次5min；

(18)加入用10％脱脂奶粉稀释的二抗室温孵育1h；

(19)弃去二抗，用pbst洗涤3次，每次5min；

(20)用化学发光法进行显示拍照。

通过westernblotting检测ccr12多克隆抗体的特异性，结果如图6所示，该多克隆抗体能特异性的识别重组蛋白，也能识别天然蛋白(约为41kda)。其中，泳道m表示marker，泳道1、2、3分别表示趋化因子受体ccr12的重组蛋白纯化样品、头肾组织全蛋白、头肾膜蛋白的sds-page结果，泳道a、b、c则分别为泳道1、2、3的样品用制得的多抗进行westernblotting的结果，箭头分别标记多克隆抗体识别的天然蛋白和重组蛋白。

4、多抗的初步应用(斜带石斑鱼外周血细胞免疫组化)：

(25)用适当剂量的丁香酚(50mg/ml)将斜带石斑鱼麻醉，用肝素钠处理过的注射器从尾静脉采血；

(26)取一干净的载玻片，滴加一滴抗凝血；

(27)用另一干净玻片，一端接触玻片上的血滴，两玻片成45°角，轻轻移动，使血滴成一直线，由玻片的一端移向另一端，成为均匀的薄层；

(28)血涂片在空气中干燥后，立即用4％多聚甲醛室温固定15min；

(29)用pbs洗3次，每次3min；

(30)用0.5％tritonx-100破膜处理20min；

(31)用pbs洗3次，每次3min；

(32)用3％h2o2室温封闭15min；

(33)用pbs洗3次，每次3min；

(34)将玻片进入柠檬酸缓冲液中，在微波炉中进行抗原修复15min，室温冷却；

(35)用pbs洗3次，每次3min；

(36)用正常山羊血清室温封闭30min；

(37)甩干玻片上的山羊血清，滴加一抗(即制备的ccr12多克隆抗体)，置于湿盒中，4℃孵育过夜；

(38)取出湿盒，37℃复温40min；

(39)用pbs洗3次，每次3min；

(40)滴加二抗，37℃孵育40min；

(41)用pbs洗3次，每次3min；

(42)dab显色1min，蒸馏水冲洗5min；

(43)苏木素37℃复染15min，自来水冲洗5min；

(44)1％盐酸酸化5s，自来水冲洗5min；

(45)75％、80％、90％、95％、95％、100％、100％乙醇依次脱水3min；

(46)1/2100％乙醇+1/2100％二甲苯处理3min；

(47)二甲苯i、ii透明5min；

(48)中性树脂封片，37℃过夜后，在显微镜下拍照观察。

制备的趋化因子受体ccr12多克隆抗体通过免疫组化可标记血涂片的阳性细胞，结果如图7所示，ccr12阳性细胞直径约为9μm，具有不同的核型，包括肾形和圆形。其中a、b分别显示的是ccr12阳性细胞的不同核型，a为肾形，b为圆形。