本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及通过植物组织培养的方法，获得茶树叶片的愈伤组织后，对愈伤组织进行单细胞分离获得茶叶悬浮单细胞的方法。
背景技术：
茶树，拉丁文名：camelliasinensis(l.)o.ktze，山茶科、山茶属灌木或小乔木，嫩枝无毛。叶革质，长圆形或椭圆形。茶树的叶子可制茶(有别于油茶树)，种子可以榨油，茶树材质细密，其木可用于雕刻。
我国是茶叶传统出口大国，据相关数据显示，当前全球各个产茶国家中，我国的茶叶年产量居于第一位，出口总量居于第二位，仅仅低于肯尼亚。茶叶中含有对人体有益的茶多酚、氨基酸、咖啡碱等物质，具有提神醒脑、解毒利尿、“三抗三降”等功效，是世界三大无酒精饮料之一。茶树其高度的自交不亲和性、自交衰退、结实率低等限制了遗传改良工作的进行；另外细胞学平台的缺乏也阻碍了茶叶中主要内含健康功能成分的代谢机理的研究。利用茶树组织培养技术及单细胞培养技术，可以加快茶树育种、缩短育种周期，并可利用组织培养进行茶树次生代谢产物可以开展细胞学和遗传转化研究，包括：次生代谢产物的生产、代谢物细胞定位及代谢机理研究、并为外源化合物胁迫条件下茶树细胞代谢物变化及机制研究提供了很好的技术平台。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种通过植物组织培养技术，建立一个快速生长的茶叶细胞悬浮培养体系并且分离出茶叶单细胞，维持其可持续开发和利用，也为茶叶细胞学和次级代谢机理的研究与遗传转化研究奠定基础。
本发明是通过以下技术方案实现的：
茶叶悬浮单细胞的分离培养方法，其特征在于，通过外植体组织培养，获得愈伤组织，然后对愈伤组织进行悬浮培养后经分离获得茶叶悬浮单细胞。
进一步，所述外植体为茶树新稍上部幼嫩叶片。
进一步，对外植体进行进行愈伤组织培养的培养基为：ms+2.0mg/l2,4-d+0.5mg/lkt+蔗糖30g/l，+琼脂6.5-7.0g/l，ph5.8。
进一步，悬浮培养的培养基为b5+1.0mg/l2,4-d+0.1mg/lkt+蔗糖20g/l。
进一步，悬浮培养的培养基为b5+1.0mg/l2,4-d+0.1mg/lkt+蔗糖20g/l。
进一步，愈伤组织经25℃恒温摇床中，避光悬浮培养5-10天后，将悬浮细胞转入新配制的悬浮培养基中再继代培养培养21-28天；制备悬浮初代细胞时添加果胶酶，再经2-3次悬浮继代培养后，得到茶叶悬浮单细胞。
进一步，所述果胶酶需经过0.22um无菌滤膜处理，所述果胶酶添加量为悬浮培养基体积的3％-5％。
进一步，所述愈伤组织培养后还包括继代培养，所述继代培养基为ms+1.0mg/l2,4-d+0.1mg/lkt+蔗糖30g/l+琼脂6.5-7.0g/l，ph5.8。
进一步，所述外植体包括预处理，具体是指将采摘后幼嫩叶片流水冲洗1h，质量分数50％多菌灵溶液冲洗浸泡4h，2.0g/l的pvpp溶液浸泡1h，清水清洗3-4遍，然后将漂洗干净的叶片用质量分数75％乙醇消毒10秒，无菌水冲洗1次，质量分数0.1％升汞消毒10分钟，无菌水冲洗3次后用无菌吸水纸吸干叶表水。
与已有技术相比，本发明优点体现在：
首先，本发明通过植物组织培养技术，将生长旺盛的茶树外植体诱导出愈伤组织后，对其愈伤组织接种于特定激素和培养基的组合进行扩大再培养、在特定激素和培养基的悬浮体系中通过不断继代和振荡，将团簇愈伤组织不断分离，最终获得单细胞；同时，对初代悬浮培养的愈伤组织进行不断的扩大再培养，即可获得大量、充足的悬浮茶树单细胞；并且在悬浮培养过程中添加适量果胶酶，促进细胞的分离；其次，对不同季节采摘的外植体诱导愈伤组织的激素略有不同，以及悬浮培养严格控制每瓶的装液量(150ml锥形瓶装液40ml)，使悬浮细胞保持最适生长活力。其技术难点在于①秋冬季茶树愈伤诱导率较春夏季较低，因此采用不同激素诱导；②根据愈伤的生长变化情况及时更换新鲜培养基以及激素配比的调整；本发明方法与现有技术不同的两点在于，对于不同季节采摘的外植体采用不同激素配比；悬浮培养过程中添加果胶酶促进细胞分离；在适宜环境下，对初次悬浮愈伤的不断培养和继代，即可不断获得茶树单细胞。
附图说明
图1是不同激素组合的愈伤组织诱导培养基的诱导结果。图中(a)、(b)、(c)分别对应表3中组别1、2、3不同激素组合的愈伤组织。
图2.为不同kt激素浓度下组织继代培养的结果。图中，(a)、(b)、(c)分别为0.05mg/l、0.1mg/l、0.5mg/lkt浓度下愈伤组织继代培养结果。
图3为愈伤组织生长状况随继代次数的增加而变化结果。图中(a)、(b)、(c)、(d)分别为继代培养2-5次的结果。
图4.为液体悬浮细胞培养过程，图中a.为固体愈伤经过无菌刀片切碎后；b.为经过5-10天，上清悬浮添加新配置b5培养基；c.为经过一次继代后悬浮细胞生长状况；d.为经过2-3次继代后悬浮细胞生长到旺盛时期。
图5.为茶叶悬浮细胞经过2-3次继代分离后，400倍显微镜下状况。
图6为秋冬季采摘外植体在添加2.0mg/l2,4-d+0.5mg/lkt+0.5mg/l6-ba初代诱导培养基培养后，再经继代培养基培养基培养28d后生长状况，图6中，(a)为初代诱导结果，(b)为继代一次结果。
具体实施方式
下面结合实例对本发明作进一步详述。实施例中所述的培养方法均在干净的工作台进行，ms和b5培养基为自行配置的母液(配方表参见表1，表2)，冷藏保存，实施例中所述的室温为20～25℃。
表1.ms培养基母液配置表
表2.b5液体培养基母液配置及取用量(单位：mg/l)
实施例
(1)固体愈伤组织诱导培养基和固体愈伤组织继代培养基的配制：
以配置1l培养基为例，将先配置好的ms培养基母液按照比例称取，放于5l烧杯中，按2.0mg/l的比例添加2,4-d，0.5mg/l的比例添加kt，30g/l的比例添加蔗糖，7g/l的比例添加琼脂，加入至煮沸纯水中搅拌均匀后，倒入5l烧杯中至刻度1l，并搅拌均匀后，用1mol/l氢氧化钠调整ph至5.8，然后分装在组培瓶中，121℃高压灭菌15min后，充分冷却凝固，备用，得到固体愈伤组织诱导培养基。
以配置1l培养基为例，将先配置好的ms培养基母液按照比例称取，放于5l烧杯中，按1.0mg/l的比例添加2,4-d，0.1mg/l的比例添加kt，30g/l的比例添加蔗糖，7g/l的比例添加琼脂，加入至煮沸纯水中搅拌均匀后，倒入5l烧杯中至刻度1l，并搅拌均匀后，用1mol/l氢氧化钠调整ph至5.8，然后分装在组培瓶中，121℃高压灭菌15min后，充分冷却凝固，备用，得到固体愈伤组织继代培养基。
(2)液体悬浮培养基的配制
以配置1l培养基为例，将先配置好的b5培养基母液按照比例称取，至5l烧杯中，按1.0mg/l的量添加2,4-d，0.1mg/l的量添加kt，20g/l的量添加蔗糖，然后加入纯水至1l体积，分装与150ml锥形瓶40ml，封口，121℃高压灭菌15min后，冷却备用，得到液体培养基。
(2)茶叶悬浮单细胞的分离培养方法
以茶树品种“龙井43”为例，春季龙井43新稍上部幼嫩叶片，采摘后流水冲洗1h，配制质量分数50％多菌灵溶液冲洗浸泡4h，2.0g/l的pvpp溶液浸泡1h，清水清洗3-4遍，将漂洗干净的叶片作为外植体，在无菌接种室工作台上用质量分数75％乙醇消毒10秒，无菌水冲洗1次，质量分数0.1％升汞消毒10分钟，无菌水冲洗3次后用无菌吸水纸吸干叶表水。
在超净工作台上将消毒处理后的叶片用无菌剪刀沿中间叶脉剪开，再细分成0.3×0.3cm左右的小块外植体，接种在固体诱导培养基上面，每瓶接种8-10块外植体，避光培养，温度25±2℃，培养20-50天，得到叶片愈伤组织。
表3为不同激素组合的愈伤组织诱导培养基的诱导结果
由表3可知，组别2为最适选择，最终确定为激素组合2即2.0mg/l2,4-d+0.5mg/lkt为最佳诱导组合。
在无菌环境下，将初代培养出的愈伤组织用无菌镊子转移至固体继代培养基上，同时剔除未出愈外植体，继续培养21-28天。
茶叶细胞悬浮培养是由原来继代培养的固体培养基更换为液体培养基，植物生长调节剂和ph对愈伤组织细胞的生长于继代培养时的影响基本一致，因此植物生长调节剂仍然采用2,4-d+kt的组合，ph为5.8。
在继代培养中，继代培养基中kt激素选择3个浓度水平，分别为0.05mg/l，0.1mg/l和0.5mg/l(2，4-d浓度选择0.5mg/l，ms为基本培养基)，具体培养结果如图1、表4所示，0.05mg/lkt浓度下愈伤组织颜色泛白，生长速度慢，质地较紧实；kt浓度为0.1mg/l的愈伤呈嫩黄色，生长旺盛且质地疏松；kt浓度为0.5mg/l的愈伤出芽现象严重，质地紧实；最终确定为kt为0.1mg/l愈伤生长最佳。
表4不同kt浓度下继代愈伤组织生长情况
在确定kt最佳浓度时，2,4-d激素选择10个浓度水平，进行继续培养，具体培养结果如表5所示。
由表5可知，在确定了kt最适浓度后，当2,4-d为1.0mg/l时，愈伤组织生长率达到最大值为46.94％，最终确定为1.0mg/l为最佳浓度。
表5不同2,4-d激素浓度下继代愈伤组织生长情况
液体培养时不同的基本培养基对愈伤组织、细胞的生长状况也会产生影响，因此分别以ms、b5为基本培养基，添加2,4-d1.0mg/l+kt0.1mg/l的植物生长调节剂组合，14d后称重的方法确定两种基本培养基对细胞生长量的影响(表6)由此可知，b5培养基更适合愈伤组织液体培养，且褐化率低。
表6不同培养基种类对愈伤生长的影响
经过继代培养之后，在无菌环境下，将继代培养基中大块愈伤组织用无菌剪刀剪切成小块后，继续转移至新配置继代培养基中培养，同时剔除生长状况较差的愈伤组织，继续继代2-3次。
表7为固体继代次数的生长情况
如图3、表7所示，当继代次数为2-4次时，除生长量不同，愈伤均生长旺盛，质地疏松；而当继代次数为5次时，愈伤组织开始发生褐变，因此选择继代次数2-3次最佳。
在无菌环境下，将经过2-3次继代培养的愈伤组织，用无菌刀片进行切割处理，使其成细小颗粒后，称取2g放入液体培养基中，置于25℃恒温摇床中，转速120r/min，避光培养，如图4中a所示。
培养5-10天后，在无菌环境下，将液体悬浮上清分成20ml与新配制装液量20ml液体培养基中，未分散的愈伤组织块再倒入新配制液体培养基40ml继续培养21-28天，如图4中b所示。
然后向培养基中添加3％-5％装液量(体积)的果胶酶，再经2-3次悬浮继代培养后，即可得到生长良好的茶叶悬浮单细胞，如图4中c，d、图5所示。
对于从秋冬季采摘的外植体叶片进行诱导时，对其初代诱导培养基激素进行调整，在原有的激素配比上添加0.5mg/l6-ba，使最终初代诱导培养基激素浓度为2.0mg/l2,4-d+0.5mg/lkt+0.5mg/l6-ba，继代培养条件与前文相同。图6为冬季叶片愈伤组织初代培养激素调整前后生长状况对比，激素调整后相对于激素调整前愈伤组织生长量平均增加20％左右(表8为激素调整前后愈伤诱导及生长率对比结果，每瓶接种叶片10片，重复3组平行)
表8激素调整前后对比结果
激素组合1:2.0mg/l2,4-d+0.5mg/lkt
激素组合2：2.0mg/l2,4-d+0.5mg/lkt+0.5mg/l6-ba。