编码组织型纤溶酶原激活剂的DNA分子及其重组细胞株的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及编码组织型纤溶酶原激活剂的dna分子，本发明还涉及包含该dna分子的载体以及其重组细胞株。

背景技术：

组织型纤溶酶原激活剂(tissue-typeplaminogenactivator，tpa)由血管内皮细胞合成并分泌的一种糖蛋白，是血液内纤溶系统的生理性激活剂。在血栓形成时，能特异与血栓中的纤维蛋白结合，并与纤溶酶原形成三元复合物，在血栓处激活纤溶酶原，达到局部溶栓的效果。基于这一特性，美国genentech公司开发了重组人tpa并于1987年上市，通用名为阿替普酶(actilyse)。作为一种高效特异的溶血栓药，阿替普酶用于心肌梗死、脑血栓等血栓性疾病的抢救和治疗。阿替普酶采用cho细胞重组表达，具有与天然tpa相同的生物学活性，对血栓中的纤维蛋白有很高的亲和性，而对血液中的纤维蛋白原、凝血因子等没有作用，这就避免了由于激活全身纤溶系统所带来的潜在出血危险。重组表达的阿替普酶与天然tpa序列一致，临床应用不会产生免疫反应等副作用。因此，疗效好、安全性高、溶栓后再凝趋势弱及便于抢救等是该药的最大优点。

但是，阿替普酶在血液中可以被i型纤溶酶原激活剂抑制物快速、特异地结合，从而失去溶栓活性，也可以与肝细胞、血管内皮细胞上的特异性受体结合而被吞噬和从血液中清除。这一缺点使得其在血液中的半衰期非常短，仅3-6分钟，这也导致阿替普酶临床应用剂量大(最大剂量达90mg)、费用昂贵。为了改变这一缺陷，主要从两方面进行改善：一是延长半衰期，主要是通过构建tpa的突变体，增强其活性或者降低与i型纤溶酶原激活剂抑制物及受体的亲和力实现，如德国boehringermannheim公司开发的瑞替普酶、美国genentech公司的tnk酶、美国bristol-myerssquibb公司开发的mpa酶、日本eisai公司开发的孟替普酶等。二是优化tpa的生产工艺，通过改变表达系统、简化纯化步骤等提高生产率。例如，中国发明专利cn1314490公开了在酵母菌中分泌表达人组织纤溶酶原激活剂(htpa)及其活性测定方法。在获得htpacdna的基础上，对该基因5’端加以修饰，使其正确插入ppic9载体的α因子信号肽序列下游，经转化构建阳性工程菌，然而酵母菌表达系统的糖基化形式与哺乳动物细胞存在一定的差异，这些差异将直接影响重组蛋白的活性、稳定性及免疫原性。

中国发明专利cn101085978公开了一种用于动物细胞灌流培养的过滤-沉降双结合灌流系统，通过改造灌流培养系统的方式提高cho细胞密度和产量。中国发明专利cn101096655公开了一种采用cytopore多孔微载体培养法生产重组人组织型纤溶酶原激活剂tnk突变体的方法，将tnk-tpa基因工程cho细胞株加培养基重新悬浮后，使用cytopore多孔微载体培养tnk-tpa基因工程细胞生产tnk-tpa。中国发明专利cn1786161将含天然或改构的人组织型纤溶酶原激活剂的样品过亲和层析柱，通过特异的仿生亲和分离材料提高tpa的纯化收率等。

以上的研究多侧重于培养和纯化工艺方面的改进，而上游工艺特别是表达细胞株的设计和优化却鲜有报道。然而，当前生产重组tpa及其突变体的方法涉及的环节众多，是一项复杂的系统工程，而对细胞株构建的过程，如启动子的选择、目的基因的序列、筛选标记的选择等进行深入研究，将更有效地提高tpa的生产效率、并进一步地降低生产成本和使用成本。

基于此，当前对大规模生产重组tpa的高效率、低成本的方法存在需求。

技术实现要素：

为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种编码tpa的dna分子。本发明提供的编码tpa的dna分子更有利于哺乳动物细胞表达，极大地提高了tpa的分泌表达效率。进一步地，本发明还提供了包含该dna分子的载体以及其重组细胞株。本发明提供的载体中引入了谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase，gs)筛选加压体系，本发明还提供了用于表达重组人tpa的cho细胞株。

一方面，本发明提供了一种编码组织型纤溶酶原激活剂的dna分子，其核苷酸序列如seqidno:1所示。其中，本发明所述的编码tpa的dna分子根据人tpa蛋白序列设计并优化，所述人组织型纤溶酶原激活剂蛋白序列来源于uniprot蛋白质数据库(uniprotreferencesequence:p00750)，其氨基酸序列如seqidno:2所示。该氨基酸序列共编码562个氨基酸，分子量为62.9kda，等电点为8.1。

另一方面，本发明提供了一种包含本发明的dna分子的表达载体；优选地，本发明的表达载体为真核生物表达载体，更优选地选自pdna、pcmv、pef系列载体，进一步优选地为pires表达载体；

优选地，本发明所述的表达载体还包括谷氨酰胺合成酶基因。所述谷氨酰胺合成酶基因用作筛选和加压标记。

再一方面，本发明提供了一种用于表达组织型纤溶酶原激活剂的cho细胞株，所述细胞株包括上述dna分子或上述载体。

再一方面，本发明提供了一种优化所述cho细胞株的方法，所述方法包括引入谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase，gs)筛选加压体系。

本发明还提供了本发明的编码组织型纤溶酶原激活剂的优化dna分子、包含本发明的优化dna分子的表达载体、用于表达组织型纤溶酶原激活剂的cho细胞株在生产重组组织型纤溶酶原激活剂中的用途。

在本发明的一个实施例中，给出了制备本发明的用于表达组织型纤溶酶原激活剂的cho细胞株的方法，所述方法包括以下步骤：

1)按照哺乳动物细胞密码子偏好性设计并合成编码人组织型纤溶酶原激活剂的核苷酸序列，优选地，所述核苷酸序列如seqidno:1所示；

2)将编码人组织型纤溶酶原激活剂的核苷酸序列构建进入pires表达载体，获得pires-tpam重组质粒。

3)将gs基因编码序列构建进入pires-tpam表达载体，获得pires-tpa-gs重组质粒。

4)将pires-tpam和pires-tpam-gs重组质粒转染cho-k1哺乳动物细胞株。

5)使用g418(geneticin，遗传霉素)进行筛选获得稳定细胞株，并用msx(蛋氨酸亚氨基代砜)加压获得高表达的cho/pires-tpam-gs重组细胞株。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：

1)本发明的dna分子经过优化，避免和降低了影响转录和翻译效率的诸多因素，例如密码子偏好性、mrna高级结构、gc含量、提前终止序列等，优化后的序列更有利于哺乳动物细胞表达。

2)本发明的技术方案中，将gs基因克隆进入表达载体，构建了gs加压筛选系统。经过加压后，组织型纤溶酶原激活剂的拷贝数随gs基因在细胞内得到扩增，因而，目的蛋白的表达量较非扩增表达系统显著增加，为大规模生产奠定了基础。

3)本发明提供的表达组织型纤溶酶原激活剂的cho细胞株极大地提高了表达效率，从而降低了生产和使用成本。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为本发明的tpa编码dna序列与天然tpa编码dna序列的序列比对。

图2为本发明中pires-tpam质粒和pires-tpam-gs质粒的构建流程图。

图3为本发明中对cho/pires-tpam-gs细胞株的筛选结果。

图4为测定本发明的细胞株培养液上清的活性的显色反应；

其中，1为未加入细胞培养上清的测活显色的本底反应；

2为cho/pires-tpa稳定细胞株培养上清的测活显色反应；

3为cho/pires-tpam稳定细胞株培养上清的测活显色反应；

4为cho/pires-tpam-gs稳定细胞株培养上清的测活显色反应；

5为cho/pires-tpam-gs稳定细胞株经msx加压后培养上清的测活显色反应。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

实施例1.编码人组织型纤溶酶原激活剂的核苷酸序列的密码子优化

人组织型纤溶酶原激活剂蛋白序列来源于uniprot蛋白质数据库

(uniprotreferencesequence:p00750)，具体序列如下：

seqidno:2

mdamkrglccvlllcgavfvspsqeiharfrrgarsyqvicrdektqmiyqqhqswlrpvlrsnrveycwcnsgraqchsvpvkscseprcfnggtcqqalyfsdfvcqcpegfagkcceidtratcyedqgisyrgtwstaesgaectnwnssalaqkpysgrrpdairlglgnhnycrnpdrdskpwcyvfkagkyssefcstpacsegnsdcyfgngsayrgthsltesgasclpwnsmiligkvytaqnpsaqalglgkhnycrnpdgdakpwchvlknrrltweycdvpscstcglrqysqpqfrikgglfadiashpwqaaifakhrrspgerflcggilisscwilsaahcfqerfpphhltvilgrtyrvvpgeeeqkfevekyivhkefdddtydndiallqlksdssrcaqessvvrtvclppadlqlpdwtecelsgygkhealspfyserlkeahvrlypssrctsqhllnrtvtdnmlcagdtrsggpqanlhdacqgdsggplvclndgrmtlvgiiswglgcgqkdvpgvytkvtnyldwirdnmrp

按照哺乳动物细胞密码子偏好性，同时减少序列中gc含量、避免mrna的二级结构、去除剪切位点和终止信号等因素，获得的优化序列如seqidno:1所示,由南京金斯瑞公司合成并克隆至puc57载体。经优化的序列命名为tpam，含有该序列的puc57重组质粒命名为puc57-tpam。

优化后的tpa编码dna序列与天然tpa编码dna序列(genbank:ay221101.1)的比对如图1所示，两者的相似度为79％。

实施例2.重组质粒pires-tpam的构建

重组质粒pires-tpam的构建流程如图1所示。

以puc57-tpam重组质粒为模板，用引物f1和r1进行pcr扩增；

f1:seqidno:3atatctcgagatggacgccatgaagagggg和引物

r1:seqidno:4atatacgcgttcatggccgcatattgtccc。

反应体系为h2o20μl，2×taqpcrmastermix(天根生化科技有限公司的kt201)25μl，10μm引物f11μl，10μm引物r11μl，puc57-tpam质粒1μl。

扩增条件为：94℃2min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，共35个循环；94℃5min。

扩增产物大小为1699bp，经琼脂糖凝胶回收后溶于30μl无菌水中。将扩增回收的产物进行酶切反应，反应体系为：h2o6μl，10×bufferh2μl，xhoi1μl(takara生物技术有限公司)，mlui1μl(takara生物技术有限公司)，扩增回收的产物10μl，反应条件为：37℃3hr。用同样的体系和条件酶切2μgpires表达载体。

反应结束后回收经酶切的基因片段和表达载体，分别溶于30μl无菌水。将表达载体和基因片段进行连接，反应体系为：h2o4μl，10×ligationbuffer，ligase(newenglandbiolabs公司的m0202v)1μl，酶切回收的基因片段10μl，酶切回收的pires表达载体3μl。室温放置16hrs。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞dh5a，涂布于含有氨苄青霉素25μg/ml的lb平板，37℃倒置培养过夜。挑取单菌落进行dna测序验证，测序结果无误的质粒用于哺乳动物细胞的转染。

实施例3.重组质粒pires-tpam-gs的构建

重组质粒pires-tpam-gs的构建流程如图1所示。

以带有gs基因编码序列的puc57-gs重组质粒为模板，用引物f2:seqidno:5atatggatccatggccacctcagcaagttcccact和引物r2:seqidno:6atatgtcgacttagtttttgtattggaagggctcg进行pcr扩增。反应体系为h2o20μl，2×taqpcrmastermix(天根生化科技有限公司的kt201)25μl，10μm引物f21μl，10μm引物r21μl，puc57-gs质粒1μl。扩增条件为：94℃2min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，共35个循环；94℃5min。扩增产物大小为1142bp，经琼脂糖凝胶回收后溶于30μl无菌水中。将扩增回收的产物进行酶切反应，反应体系为：h2o6μl，10×bufferh2μl，bamhi1μl(takara生物技术有限公司)，sali1μl(takara生物技术有限公司)，扩增回收的产物10μl。反应条件为：37℃3hr。用同样的体系和条件酶切2μgpires-tpa表达载体。反应结束后回收经酶切的基因片段和表达载体，分别溶于30μl无菌水。将表达载体和基因片段进行连接，反应体系为：h2o4μl，10×ligationbuffer，ligase(newenglandbiolabs公司的m0202v)1μl，酶切回收的基因片段10μl，酶切回收的pires-tpam表达载体3μl。室温放置16hrs。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞dh5a，涂布于含有氨苄青霉素25μg/ml的lb平板，37℃倒置培养过夜。挑取单菌落进行dna测序验证，测序结果无误的质粒用于哺乳动物细胞的转染。

实施例4.重组质粒pires-tpam和pires-tpam-gs的提取

将测序正确的pires-tpam和pires-tpam-gs分别接种于100ml含50μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜。按照天根生化科技有限公司的高纯度质粒大提试剂盒(dp116-m)操作说明提取质粒用于哺乳动物细胞的转染。

实施例5.cho-k1细胞的培养、转染

cho-k1细胞复苏之后用cdm4mab培养基(hyclone公司，sh30800)培养，培养条件为37℃，5％co2，120rpm/min。每3天换一次培养液，按1：3比例传代。传3代当其存活率达到95％时，进行转染。

利用默克密理博的novachoice转染试剂盒(72622-3)，按照说明书进行转染。具体地，取pires-tpam和pires-tpam-gs各20μl，分别与2ml的培养基、20μl的转染试剂、10μl的转染稀释液混合，室温孵育30分钟。将混匀的转染试剂分别加入20ml培养的细胞中，混匀后继续培养。转染48h后加入g418至终浓度800μg/ml，每3天换一次培养液，培养两周后获得稳定cho/pires-tpam和cho/pires-tpam-gs细胞株，分别收集细胞培养上清进行活性检测。

实施例6.cho/pires-tpam-gs细胞的加压和筛选

取存活率达到95％的cho/pires-tpam-gs细胞，将培养基更换为无谷氨酰胺的cdm4mab培养基进行培养，培养条件为37℃，5％co2，120rpm/min。每3天换一次培养液，传2代后加入msx至终浓度25μm，每3天换一次培养液，培养两周收集细胞培养上清进行活性检测。

用有限稀释法筛选cho/pires-tpam-gs细胞株。具体的，将浓度为1×10⁶个/ml的cho/pires-tpam-gs的细胞，用cdm4mab培养基稀释至2-4个细胞/200μl，按照200μl/孔的量铺于96孔深孔板，于37℃，5％co2，120rpm/min条件下进行培养，至细胞密度达到0.5×10⁵个/ml时转移至24孔板进行培养，培养3天后取上清分别测定活性。

实施例7.对照cho/pires-tpa细胞株的构建和培养

提取pires-tpa质粒，其中，带有天然tpa编码dna序列(序列同genbank:ay221101.1)。转染宿主细胞cho-k1获得含有未优化表达序列的cho/pires-tpa重组细胞株，收集培养上清进行活性检测。质粒提取方法同实施例4，细胞转染和培养方法同实施例5。

实施例8.组织型纤溶酶原激活剂活性检测

取细胞培养上清50μl、55u/ml纤溶酶原(abacm公司，gr299758)10μl、10mg/ml牛纤维蛋白原(索莱宝生物技术有限公司，622c061)50μl、1u/ml牛凝血酶(索莱宝生物技术有限公司，522a0214)50μl混合，于37℃温育10min。加入5mg/mls-2403发色底物(上海冠东生物科技有限公司)40μl混匀，于37℃温育60min。加入20μl的1.25m醋酸终止剂，测定405nm波长下的吸光度值。取不同浓度的(2-10u)组织型纤溶酶原激活剂标准品(abacm公司，ab92633)，按照上述操作反应，绘制活性-浓度标准曲线，计算细胞上清中组织型纤溶酶原激活剂的活性，结果如表1和图3所示，含有优化基因序列的cho/pires-tpam稳转细胞库的培养上清中tpa的活性是cho/pires-tpa稳转细胞库的4倍。经有限稀释法共筛选了cho/pires-tpam-gs细胞株149株，活性呈正态分布，其中最高一株克隆1c1的表达量达373iu/ml。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

序列表

<110>江苏康禾生物制药有限公司

<120>编码组织型纤溶酶原激活剂的dna分子及其重组细胞株

<130>dic17110009

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1689

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>编码tpa的优化dna分子

<400>1

atggacgccatgaagaggggcctgtgctgcgtgctgctgctgtgcggcgccgtgttcgtg60

agccccagccaggagatccacgccaggttcaggaggggcgccaggagctaccaggtcatc120

tgcagagacgagaagacccagatgatctatcagcagcaccagtcctggctgcgccctgtg180

ctgagaagcaaccgcgtggagtactgctggtgtaattctggcagggcccagtgtcattcc240

gtgcctgtgaagtcttgctccgagccacggtgtttcaacggcggcacatgccagcaggct300

ctgtatttctccgatttcgtgtgccagtgtcctgagggctttgccggcaagtgctgtgag360

atcgataccagggctacatgttacgaggaccagggcatcagctataggggcacctggtct420

acagctgagtccggagctgagtgcaccaactggaactcctccgccctggctcagaagcct480

tactctggcaggcggccagatgctatcaggctgggactgggcaaccacaattattgtaga540

aatcccgatcgcgactctaagccttggtgctacgtgttcaaggccggcaagtattcttcc600

gagttttgctccaccccagcttgtagcgagggcaactctgactgttactttggcaatggc660

agcgcctatagaggcacccattctctgacagagtccggcgctagctgcctgccatggaac720

tctatgatcctgatcggcaaggtgtacacagctcagaatccatccgcccaggctctggga780

ctgggcaagcacaactattgtcgcaatccagatggcgacgctaagccctggtgccatgtg840

ctgaagaacagacgcctgacctgggagtactgcgatgtgcccagctgctctacatgtggc900

ctgaggcagtattctcagcctcagttccggatcaagggcggcctgtttgccgacatcgct960

agccacccatggcaggccgctatcttcgccaagcataggcggtctcccggcgagaggttt1020

ctgtgcggcggcatcctgatcagctcttgttggattctgtccgccgctcactgcttccag1080

gagcggtttccccctcaccatctgaccgtgatcctgggcaggacataccgggtggtgcca1140

ggcgaggaggagcagaagttcgaggtggagaagtacatcgtgcataaggagtttgacgat1200

gacacctatgataacgacatcgccctgctgcagctgaagagcgactccagcagatgtgct1260

caggagtcttccgtggtgcgcaccgtgtgcctgccaccagccgatctgcagctgccagac1320

tggacagagtgtgagctgtccggatacggcaagcacgaggccctgtcccctttctatagc1380

gagaggctgaaggaggctcacgtgagactgtacccaagctctcgctgtaccagccagcat1440

ctgctgaacagaaccgtgacagataatatgctgtgcgctggcgacacacgctccggagga1500

ccacaggctaacctgcatgatgcttgtcagggcgacagcggaggacctctggtgtgcctg1560

aatgatggccggatgaccctggtgggcatcatctcttggggactgggatgcggacagaag1620

gacgtgcctggcgtgtacaccaaggtgacaaactatctggattggatcagggacaatatg1680

cggccatga1689

<210>2

<211>562

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>tpa的氨基酸序列

<400>2

metaspalametlysargglyleucyscysvalleuleuleucysgly

151015

alavalphevalserproserglngluilehisalaargpheargarg

202530

glyalaargsertyrglnvalilecysargaspglulysthrglnmet

354045

iletyrglnglnhisglnsertrpleuargprovalleuargserasn

505560

argvalglutyrcystrpcysasnserglyargalaglncyshisser

65707580

valprovallyssercyssergluproargcyspheasnglyglythr

859095

cysglnglnalaleutyrpheseraspphevalcysglncysproglu

100105110

glyphealaglylyscyscysgluileaspthrargalathrcystyr

115120125

gluaspglnglyilesertyrargglythrtrpserthralagluser

130135140

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145150155160

tyrserglyargargproaspalaileargleuglyleuglyasnhis

165170175

asntyrcysargasnproaspargaspserlysprotrpcystyrval

180185190

phelysalaglylystyrsersergluphecysserthrproalacys

195200205

sergluglyasnseraspcystyrpheglyasnglyseralatyrarg

210215220

glythrhisserleuthrgluserglyalasercysleuprotrpasn

225230235240

sermetileleuileglylysvaltyrthralaglnasnproserala

245250255

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260265270

aspalalysprotrpcyshisvalleulysasnargargleuthrtrp

275280285

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290295300

serglnproglnpheargilelysglyglyleuphealaaspileala

305310315320

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325330335

glygluargpheleucysglyglyileleuilesersercystrpile

340345350

leuseralaalahiscyspheglngluargpheproprohishisleu

355360365

thrvalileleuglyargthrtyrargvalvalproglyglugluglu

370375380

glnlysphegluvalglulystyrilevalhislysglupheaspasp

385390395400

aspthrtyraspasnaspilealaleuleuglnleulysseraspser

405410415

serargcysalaglngluserservalvalargthrvalcysleupro

420425430

proalaaspleuglnleuproasptrpthrglucysgluleusergly

435440445

tyrglylyshisglualaleuserprophetyrsergluargleulys

450455460

glualahisvalargleutyrproserserargcysthrserglnhis

465470475480

leuleuasnargthrvalthraspasnmetleucysalaglyaspthr

485490495

argserglyglyproglnalaasnleuhisaspalacysglnglyasp

500505510

serglyglyproleuvalcysleuasnaspglyargmetthrleuval

515520525

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530535540

valtyrthrlysvalthrasntyrleuasptrpileargaspasnmet

545550555560

argpro

<210>3

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物f1

<400>3

atatctcgagatggacgccatgaagagggg30

<210>4

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物r1

<400>4

atatacgcgttcatggccgcatattgtccc30

<210>5

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物f2

<400>5

atatggatccatggccacctcagcaagttcccact35

<210>6

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物r2

<400>6

atatgtcgacttagtttttgtattggaagggctcg35