一种调控种子大小的拟南芥MPK基因及增加种子大小的方法与流程

本发明涉及生物基因工程技术领域，尤其涉及一种调控种子大小的拟南芥mpk基因及增加种子大小的方法。

背景技术：

农作物的产量受各种客观因素的影响。其中种子的大小是影响产量的一个重要组成部分。种子的大小主要受母体组织(珠被)及合子组织(胚乳、胚胎)的遗传调控及外界环境的影响。因此了解种子发育的机理、提高作物的产量，是现代育种的目标之一。随着对调控种子发育的分子生物学研究的深入，挖掘直接调控种子大小的基因，并应用于遗传改良培育高产新品种意义重大。

拟南芥中丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,mapk/mpk)家族通过三级级联途径，将细胞感知的外界信号进一步扩大并传递给下游靶标，实现对外界逆境或生长发育信号的响应。已知在拟南芥中含有20个mpk，10个mkk及80个mapkkk。mpk的20个成员又可以被分为a,b,c,d四组，其中报道最多的是a组的mpk3、mpk6与b组的mpk4等，主要参与调控冷害、盐害、生物逆境耐受性以及气孔发育、花粉管导向、生长素极性运输等。迄今为止，国内外已经报道的参与控制种子大小的mapk级联途径的基因只有水稻的osmkk4-osmpk6。有关mapk家族的c组及d组的成员有何功能以及是否调控种子大小尚未见任何报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明实施例提供了一种调控种子大小的拟南芥mpk基因及增加种子大小的方法。本发明表明，如果提高mpk20基因在植物体内的表达水平，可显著地增加种子的长度与宽度，进而增加千粒重，具有广阔的应用前景。

为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：

一方面，本发明实施例提供了一种调控种子大小的拟南芥mpk基因，所述mpk基因为mpk20基因，所述mpk20基因的核苷酸序列表为seq.id.no.1。

作为优选，所述mpk20基因的扩增引物为：

正向引物：5’-gaagatctgcagcaagataatcgcaaaaaggtg-3’，

反向引物：5’-cgggatccctagtacatctttgacataccgtaccg-3’。

另一方面，本发明实施例提供了上述mpk20基因的编码蛋白。

又一方面，本发明实施例提供了上述mpk20基因的表达载体与转基因植株。

再一方面，本发明实施例提供了一种增加种子大小的方法，所述方法包括：将上述mpk20基因通过植物表达载体pcsgfpbt及农杆菌介导的花蕾浸蘸法导入拟南芥，得到具有增大种子体积的拟南芥。

本发明人在进行拟南芥mpk的t-dna插入突变体的表型分析筛选过程中发现了拟南芥mapk基因家族的d组的一个成员mpk20的敲除株系的种子显著减小。atmpk20在种子发育过程中的合点端胚乳、珠被及成熟的胚中高度表达，而这些组织均是决定种子大小的关键组织。因此，本发明人推断该基因在种子发育调控中起着重要的作用。基于此，本发明人进行了本发明的研究。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明人基于上述研究，克隆了mpk20基因，并通过农杆菌介导的转化方法将该基因的过表达载体遗传转入拟南芥，经过对t3代纯合株系进行表型分析，发现了含有本发明的mpk20基因的转基因拟南芥植株产生的种子大小显著增加，为将来的育种提供可靠的理论基础与可供选择的基因资源。

附图说明

图1是本发明实施例1提供的mpk20在种子发育不同时期的表达分布图(结果来自efpbrowser公共数据库)；

图2是本发明实施例1提供的拟南芥mpk20基因的结构以及mpk20基因的pcr筛选纯合株系的电泳结果图，a图为t-dna插入在最后一个外显子上，白色与黑色长方形分别代表内含子与外显子；b图为pcr电泳图，wt为野生型拟南芥，m是1kbdna分子量标准，数字代表不同的株系)；

图3是本发明实施例1提供的mpk20基因在拟南芥的不同组织与器官内的表达水平图；(数值来自三次生物学重复的qrt-pcr分析结果，误差线表示标准误(se))；

图4是本发明实施例1提供的mpk20的过表达转基因株系中的转录本水平的定量pcr检测图；(数值来自一次生物学重复、两个技术重复的，不同的编号代表多个不同的独立的转基因株系)；

图5是本发明实施例1提供的mpk20的不同基因型的种子大小比较图；(wt表示野生型，mpk20代表t-dna插入突变体；mpk-oe#13与mpk20-oe#20代表两个独立的高表达株系，标尺表示150μm)；

图6是本发明实施例1提供的比较mpk20的不同基因型的种子的长度和宽度比较的统计分析图；(图中a表示长度分析，b为宽度分析，不同字母代表anova分析后差异显著(p<0.05))。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下以较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。

实施例1

在前期工作中，我们发现拟南芥的atmpk20基因特异性地在发育的种子中表达(图1)，暗示该基因可能调控种子的发育与大小。

为此，先对atmpk20基因进行cdna克隆和测序：以拟南芥幼苗cdna文库为模板扩增mpk20的全长cdna，引物序列为：

atmpk20-bglii-f2:5’-gaagatctgcagcaagataatcgcaaaaaggtg-3’，

atmpk20-bamhi-r:5’-cgggatccctagtacatctttgacataccgtaccg-3’；

pcr反应体系(50μl):

添加无菌的蒸馏水至50μl

pcr反应程序：94℃预变性3分钟，94℃x30秒,50℃x1分钟,72℃x1分钟50秒，35个循环；最后72℃x7分钟。

pcr扩增产物的长度为1821bp。

对扩增产物采用bioer公司的琼脂糖胶回收试剂盒，步骤按说明书进行，pcr产物与pcsgfpbt载体均经过bglii-bamhi双酶切后，进行连接，连接体系为：

于20℃水浴连接2小时，采用42℃热激法将连接产物转化大肠杆菌感受态dh5α；挑取单菌落，进行菌落pcr筛选阳性克隆。由于pcsgfpbt载体的序列在ncbi有公布(登录号dq370426)，可以据此设计一条载体特异的正向引物5’-cgaatctcaagcaatcaagc-3’，反向引物(atmpk20-bamhi-r)同上。

pcr反应体系(20μl):

添加无菌的蒸馏水至20μl

pcr反应程序：94℃预变性3分钟，94℃x30秒,50℃x1分钟,72℃x1分钟50秒，35个循环；最后72℃x5分钟。

1％琼脂糖电泳检测，根据1kbdnamarker(fermentas)判断在扩增条带特异且长度为2kb左右的应该是阳性克隆，挑选阳性菌落进行摇菌及质粒提取，送至生物公司双向测序验证。

atmpk20的核苷酸序列表为seq.id.no.1。

然后，进行了该基因的突变体的鉴定：

从美国拟南芥生物资源中心(abrc)购得拟南芥atmpk20基因的t-dna插入突变体salk_146654种子，经次氯酸钠消毒2分钟、无菌水漂洗5次后，播种在含有1％蔗糖的1/2xms培养基上，4℃层积处理3天后放置于温室萌发一周，然后移栽在盛有营养土的盆钵里。生长三周后，取指甲盖大的一片真叶，用常规的2％ctab法提取基因组dna，溶解于20ul的1xte缓冲液(ph8)中。利用taq聚合酶、两对引物组合(lbb1.3+salk_146654_rp、salk_146654_lp+salk_146654_rp)，分别以野生型(col-0)与多个突变体的1μl的基因组dna作为模板，进行20μl体系的常规pcr扩增，然后，对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。根据1kbdnamarker(fermentas),筛选出纯合的突变体株系(图2b)。同时，对lbb1.3+salk_146654_rp产物克隆到pjet1.2载体(使用fermentas公司clonejetpcrcloningkit进行克隆)，进行了测序，与atmpk20基因的基因组dna序列进行比对后发现，salk_146654突变体插入在最后一个外显子(图2a)。

所用引物序列如下：

salk_146654_lp：5’-gaacagcaatctctcattgtgc-3’

salk_146654_rp:5’-agcaatgtgtccaaactgacc-3’

lbb1.3：5’-attttgccgatttcggaac-3’

atmpk20基因的组织器官特异性检测：

播种拟南芥野生型col-0于营养土，在温室中生长一周后取幼苗、生长5周后收集莲座叶、茎生叶、开放的花朵、荚果、茎干以及根系，准备三个生物学重复，分别用plantrnakit(omegabio-tek)提取总rna，然后，利用fermentas公司的revertaid1^stcdnasynthesiskit，对2.5μg总rna，进行反转录获得cdna，用无菌双蒸馏水稀释10倍后，采用sybrgreeni试剂(康为世纪)进行实时定量rt-pcr。

引物：

atubq10-f：5’-gttccaatctatgagggatacacgc-3’(内参基因)

atubq10-r:5’-agaagttcgacttgtcattagaaagaaa-3’(内参基因)

atmpk20-qpcr_f:5’-tctccccttttcacaacaatctgc-3’

atmpk20-qpcr_r:5’-gctgccgctgcgactcctat-3’

qpcr反应体系如下：

2xsybrgreeni混合液:5μl

20μm正向引物:0.2μl

20μm反向引物:0.2μl

cdna模板：2μl

无菌水:加至总体积为10μl

pcr程序：95℃x15分钟热启动并变性模板，然后运行35个循环的95℃x15秒，60℃x1分钟，并运行溶解曲线。

利用下述公式，以atubq10为内参基因，计算atmpk20在各个组织器官内的表达水平，相对表达水平(relativeexpressionlevel)＝(e靶标)^δcp靶标(root–样品)/(e内参)^δcp内参(root–样品)

如图3所示，表明atmpk20在除了莲座叶、茎生叶以及根系之外的其他器官内表达水平均较高。

atmpk20的过表达载体的冻融法转化根癌农杆菌gv3101：

加1μl的重组质粒pcsgfpbt-atmpk20到50μl的gv3101感受态细胞中，冰上孵育30min。液氮冷冻1min后于37℃温育5min。加入yeb培养基在28℃进行活化培养2h。涂布于含有庆大霉素(25mg/l)、利福霉素(34mg/l)以及卡那霉素(50mg/l)的yeb培养基上,倒置于28℃培养2天。

拟南芥转化：将野生型拟南芥col-0生态型在正常光周期(14h光照/8-10h黑暗)下培养5周左右；挑取一个上述农杆菌的单菌落接种于5mlyeb培养基(含25mg/l庆大霉素、34mg/l利福霉素以及50mg/l卡那霉素),28℃,200rpm振荡培养约20h。然后，将5ml菌液全部转接入330mlyeb培养基中(含相应抗生素),28℃培养8h至od600≈0.8-1.0。室温5,000rpm离心10min，弃上清收集菌体。将农杆菌菌体悬浮于等体积(330ml)的渗透介质(1/2×ms基础盐,5.0％(w/v)蔗糖,ph5.7)悬浮。将上述农杆菌悬浮液倒入500ml的微波炉盒中，加入终浓度为0.02％的silwetl-77，混匀。将拟南芥的花蕾倒置浸蘸在含有目的载体的渗透介质中,浸蘸约20秒，其间轻微晃动。然后，横放在托盘里，用透明塑料盖盖住盆钵保持湿度，放在22℃温室中。14h后揭开盖，竖直盆钵，继续培养，直至植物成熟收获t1代种子，干燥。

转基因拟南芥的筛选与传代：将上述t1代种子进行次氯酸钠消毒处理后，播种于含30mg/l的潮霉素的1/2xms+1％蔗糖培养基上，4℃放置两天后，在温室萌发一周，挑选根系较长、子叶颜色呈现正常绿色的幼苗约40株,移栽于营养土中,继续在温室生长两个月直至成熟收获t2种子。类似地，将约40个独立株系的t2代种子再播种于含潮霉素的1/2xms培养基上进行选择萌发一周，统计孟德尔分离的抗性与不抗的幼苗的比例是否是3:1，据此判断是单拷贝还是多拷贝插入，并观察每一个株系的纯合性。然后，将来自40个独立t2株系的抗性幼苗移栽到营养土，继续培养收获t3代种子。

对多个独立的纯合株系的种子，萌发生长7天后，收集50mg幼苗，采用triol(上海生工)方法提取rna，按照说明书进行。然后，利用fermentas公司的revertaid1^stcdnasynthesiskit，对2.5μg总rna，进行反转录获得cdna，用无菌双蒸馏水稀释10倍后，采用sybrgreeni试剂(康为世纪)进行实时定量rt-pcr，筛选出高表达的目的株系。

引物：

atubq10-f：5’-gttccaatctatgagggatacacgc-3’(内参基因)

atubq10-r:5’-agaagttcgacttgtcattagaaagaaa-3’(内参基因)

atmpk20-qpcr_f:5’-tctccccttttcacaacaatctgc-3’

atmpk20-qpcr_r:5’-gctgccgctgcgactcctat-3’

qpcr反应体系如下：

2xsybrgreeni混合液:5μl

20μm正向引物:0.2μl

20μm反向引物:0.2μl

cdna模板：2μl

无菌水:加至总体积为10μl

pcr程序：95℃x15分钟热启动并变性模板，然后运行35个循环的95℃x15秒，60℃x1分钟。

利用下述公式，以atubq10为内参基因，计算atmpk20在各个过表达株系(oe)中，与野生型col-0(wt)比较后的转录本水平。结果显示，鉴定出多个高表达的多个独立株系，选择oe#13与oe#20进行后续的表型分析与种子大小的比较(图4)。

比值或倍数＝(e靶标)^δcp靶标(wt–oe)/(e内参)^δcp内参(wt–oe)

种子大小的比较方法：将同时播种、同样条件生长并收获的成熟并干燥的野生型拟南芥、atmpk20的t-dna插入突变体以及过表达株系的种子，分别盛放在7.5cm直径的玻璃培养皿中，均匀铺开，在体视镜下观察并比较大小、拍照，每个基因型重复三次。然后，利用图像处理软件imagej，对各个基因型的种子的长度与宽度进行测量，并利用spss软件进行统计分析。

结果表明，atmk20的两个独立的过表达株系(oe#13与oe#20)的种子的大小明显比突变体以及野生型col-0增大(图5)。进一步通过分析各个基因型种子的长度与宽度，并进行统计分析，结果发现，atmk20的两个独立的过表达株系oe#13与oe#20的种子的长度显著长于wt，而突变体与wt间差异不显著(图6a)。就种子宽度而言，atmk20的两个独立的过表达株系oe#13与oe#20的种子的宽度显著长于wt，而突变体与wt比较显著要短(图6b)。综上，atmpk20的表达水平高低明显地与种子的大小正相关，说明通过操控atmpk20的表达，可望增大种子的大小，显示出良好的应用前景。

本发明实施例中未尽之处，本领域技术人员均可从现有技术中选用。

以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。

sequencelisting

<110>西北农林科技大学

<120>一种调控种子大小的拟南芥mpk基因及增加种子大小的方法

<160>1

<210>1

<211>1821

<212>dna

<213>拟南芥

<400>1

atgcagcaagataatcgcaaaaagaataatctggagatggagttcttttctgactatggc60

gatgccaatagatttaaagttcaagaagttattggaaaaggcagttatggagttgtttgc120

tcagctatagacactcttacgggtgagaaagtcgcgataaagaaaattcatgatattttt180

gagcatatttctgatgctgcgaggattctacgtgagattaaacttcttagactcctaagg240

catccagatatagttgaaattaagcacattatgcttcctccttcacgaagagaattcaaa300

gatatttatgttgtctttgagctcatggaatcggatcttcatcaagttattaaagccaat360

gatgatttgactagagagcattaccagtttttcctgtatcagttattgcgtgcactgaag420

tacattcacacagctaatgtctaccaccgagacctgaaaccaaagaacatattggcaaat480

gcaaactgtaaacttaagatttgtgattttggattggcaagggttgcattcaatgatacc540

cccacaacaatcttctggactgactatgttgctaccagatggtatagagctccagagctt600

tgtggatctttttactctaagtatacacccgcaattgacatctggagtataggctgcatt660

tttgcggaggtgttgatgggtaaaccacttttccctggaaagaatgtggttcaccagctg720

gatcttatgactgatctgctagggacaccttccctggacaccatctcacgggtgaggaat780

gagaaggcaaggaggtacttaacaagcatgaggaaaaagccacccattccgtttgcacag840

aaattcccaaatgcagatcctttgtctctgaagttgttggagaggcttcttgcttttgat900

ccaaaagaccggccaactgctgaagaggcacttgctgatccatattttaagggattggca960

aaagtggaaagggagccttcatgtcaacccatcacgaagatggaatttgagttcgagaga1020

agaaaggtcactaaagaggatataagagagctaatttctagggagatacttgagtaccac1080

cctcagctgcttaaagatcatatgaacggggctgataaagccagttttctctacccaagt1140

gctgttgatcaatttagaagacaatttgcgcatcttgaagaaaacagtggtaaaaccggc1200

cctgtggcacctctagaaaggaaacatgcctctcttcccagatcaacggtcatacactca1260

accgcagtagcacgaggaggacaaccaaaacttatgaataacacaaacacattgaaccct1320

gaaactactcaaaacattccttttaatcatgcaacaatacaagcacaacaaagaaacctc1380

tcagcagccaaaccaagcacattcatgggcccggttgcacctttcgacaatggcagaatc1440

agcagagatgcatatgacccgagatcattcatccggagcactaatctccccttttcacaa1500

caatctgctgcaacagtcgccatgggaaagcagcaagagagaagaacaactatggagcct1560

gagaagcaggcaagacaaatatctcagtataatagatatgcaccagatgtagccatcaac1620

atagacaacaacccgtttatcatggctagaacgggaatgaacaaagccgaaaacatcagt1680

gaccggatcataatcgacacaaatctgttacaggcaactgccggaataggagtcgcagcg1740

gcagctgcagcagctgctcctggtggttctgctcaccggaaagttggagctgttcggtac1800

ggtatgtcaaagatgtactag1821