一种用于原代人表皮细胞培养的无血清培养基体系的制作方法

本发明涉及生物医学材料技术领域，尤其涉及一种用于原代人表皮细胞培养的无血清培养基体系。

背景技术：

组织工程皮肤是目前组织工程领域的热点，近年来已经有许多产品应用于临床和化妆品安全检测当中。组织工程皮肤研发中需要解决的一大问题就是种子细胞：表皮细胞的大规模培养。

表皮细胞常用的培养方法主要有三种：滋养层法、无滋养层法和气液相培养法；所用的培养液包括有血清和无血清两种培养液。滋养层最初是用小鼠成纤维细胞(3t3)作为滋养层，由于3t3能分泌促进表皮细胞生长和分裂的细胞因子，从而促进了表皮细胞的生长，但3t3作为异体细胞，同时也分泌一些异体蛋白，导致移植到人体后发生免疫排斥反应，且其作为滋养层在处理过程中相对复杂。因此，研究者们后续发明了胶原膜、透明质酸膜、壳聚糖膜等作为滋养层的培养方法，这些方法后来被得到广泛的应用。滋养层法使用的培养液为有血清培养液，表皮细胞在这种培养液中具有良好的生长繁殖能力，但同时成纤维细胞在这种培养液中也有很好的增殖能力，导致表皮细胞容易被成纤维细胞污染。气液相培养法主要是用异体或异种真皮，各种化学膜作为表皮细胞载体，在培养过程中将表皮暴露在培养的空气中，尽量模拟表皮细胞在人体的生长环境，但该中培养方法在培养过程中观察不方便，操作复杂，需要特定的培养皿，且容易导致污染。无滋养层法，使用的主要是无血清培养液：mcdb153、k-sfm和kmc等。该种方法培养的表皮细胞可直观地在显微镜下进行观察，并且成纤维细胞的生长在此培养基中得到抑制，表皮细胞却保持着活性和增殖力。和有血清培养基相比，该种方法下原代表皮细胞的增殖能力有所下降。

血清成分复杂，不明因子繁多，且各批血清间所含的生长因子和激素的变化很大，因此越来越多的科研工作这致力于探索表皮细胞无血清培养的可能性并取得了一定程度的成果。申请号为：201510452454.7中发明了一种用于表皮细胞培养的无血清培养体系，该体系在基础培养基中添加了氨基酸、霍乱毒素、促生长因子、腺嘌呤、铁源、三碘甲状腺原氨酸以及钙盐，该方法虽然可用于表皮细胞的培养，但其中添加的霍乱毒素对细胞的通透性确实有影响，不可避免其具有的毒性，具有一定的缺陷。

技术实现要素：

在本发明提供了一种用于原代人表皮细胞培养的无血清培养基体系，该无血清培养基用于体外培养人表皮细胞。该培养基中不添加霍乱毒素和各种贴壁因子，避免了这些复杂成分造成的潜在隐患，表皮细胞生长良好，从而满足规模生产和应用的需要。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种用于原代人表皮细胞培养的无血清培养基体系，用于原代人表皮细胞培养的无血清培养基体系包括基础培养基和外源添加因子；

其中，所述基础培养基可以是dmem商用培养基与f12商用培养基按照一定比例混合的培养基，也可以是商品化培养基mcdb153；所述外源添加因子包括：l-谷氨酰胺、表皮生长因子（egf）、牛垂体提取物（bpe）、胰岛素、青霉素-链霉素、氯化钙、转铁蛋白、腺嘌呤、氢化可的松和亚硒酸钠。

进一步地，所述基础培养基为dmem商用培养基与f12商用培养基按照1:1～3:1的比例混合的培养基，或者是单独的mcdb153商用培养基。

进一步地，所述外源添加因子包括：l-谷氨酰胺的浓度为0.5~1mm，牛垂体提取物（bpe）的浓度为0.01~0.03mg/ml，表皮生长因子（egf）的浓度为0.05~1ng/ml，胰岛素的浓度为0.01~0.06mg/ml，青霉素-链霉素的浓度为10ku/ml，链霉素的浓度为10mg/ml,氯化钙的浓度为0.5~1mm，转铁蛋白的浓度为10~15μg/ml，腺嘌呤的浓度为100~200μm，氢化可的松的浓度为0.5~1μg/ml，亚硒酸钠的浓度为1~15μg/l。

进一步地，所述青霉素-链霉素为青霉素。

本发明的用于原代人表皮细胞培养的无血清培养基体系，不添加霍乱毒素和各类贴壁因子。适用于人表皮细胞的原代和传代培养，以及由血清环境直接转入无血清环境的原代人表皮细胞体外培养，所培养细胞的生长状态与含血清培养的效果一致。

细胞在无血清培养时必须加有活性因子，以取代血清支持细胞生长，如各种激素、生长因子和转运蛋白等，其中起主要作用的有3~4种，普遍认为胰岛素、转铁蛋白、谷氨酰胺和亚硒酸钠是无血清培养中的必需成份。

本发明中表皮生长因子能加强蛋白质基因的转录，加速细胞从分裂间期向分裂期的转换，缩短细胞群体倍增时间，促进细胞分裂与增值；避免表皮细胞由于缺乏细胞生长因子，出现增殖缓慢，传代次数减少的现象。

本发明中的谷氨酰胺是细胞内合成嘌呤、嘧啶、蛋白质及多肽必须的氨基酸，是细胞生长的主要能源和氮源，缺乏谷氨酰胺，会导致细胞生长不良甚至死亡；此外，转铁蛋白的添加也为表皮细胞生产提供能量来源。转铁蛋白可用柠檬酸铁代替，浓度为30~50mg/l

本发明中的氢化可的松属于糖皮质激素，和胰岛素一样是血清中的重要组分，激素的缺乏会导致细胞无法正常增殖。本发明组分中包含了血清激素的两种主要组分，模拟血清环境，满足细胞生长。氢化可的松可被地塞米松替代，浓度为0.03~0.05μg/l。

本发明中的抗氧化剂为亚硒酸钠。细胞在生理代谢过程中会产生自由基，自由基的聚集会导致细胞膜上形成过氧化物，过氧化物会使细胞膜发生肿胀、融合从而导致细胞死亡。在无血清培养时，由于抗氧化体系的缺乏，细胞更容易积累自由基，因此，添加适当的抗氧化剂能够避免细胞内发生氧化应激，造成细胞凋亡，从而增加细胞的培养代数。亚硒酸钠能够被2-巯基乙醇（30~50μm）、维生素e（ve）（20~25mg/l）和维生素c（vc）（20~50mg/l）替代。

本发明的有益效果：

本发明的用于原代人表皮细胞培养的无血清培养基体系不含血清，解决了人表皮细胞在体外培养对血清的依赖性问题；并且，所述培养基不添加霍乱毒素和各类贴壁因子，避免了这些复杂成分潜在的安全隐患。此外，和含血清培养基相比，人表皮细胞在本发明的无血清培养基中细胞形态和贴壁率无差异，能满足多次传代需要，且生长状况相似。

附图说明

图1为现有的含血清培养基体系中的人表皮细胞；

图2为本发明实施例提供的用于原代人表皮细胞培养的无血清培养基体系中的人表皮细胞。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细地描述。

实施例1

培养基配制：将350mldmem培养基和150mlf12培养基混合，共配制500ml；首先按照0.01mg/ml加入bpe，混匀，再分别加入l-谷氨酰胺1mm、egf0.05ng/ml、胰岛素0.06mg/ml、青霉素：10ku/ml；链霉素：10mg/ml、氯化钙0.5mm、转铁蛋白8μg/ml、腺嘌呤200μm、氢化可的松0.5μg/ml、亚硒酸钠15μg/l；用hci调节ph至7.2，定容后用0.2μm滤膜过滤除菌，得到无血清人表皮细胞培养基。

使用实例：将消化后的人表皮细胞用pbs溶液清洗；离心处理后用上述无血清人表皮细胞培养基重悬，按照3×105个每瓶接种，置于培养箱在37℃、5%co2条件下培养；过夜后观察细胞形态，24h后换液，继续培养，之后每隔2d换液。原代人表皮细胞在无血清培养基中能较快贴壁，24h内贴壁率可达60~70%，10天左右细胞达到60%汇合，即可进行传代培养。

原代人表皮细胞在本发明培养基中能够保持较好的细胞形态，细胞边缘清晰、伸展良好，细胞增殖旺盛，与含血清培养基的人表皮细胞状态相似（参见附图1和2）。

本发明实施例提供一种用于原代人表皮细胞培养的无血清培养基体系，该用于原代人表皮细胞培养的无血清培养基体系包括基础培养基和外源添加因子；其中，所述基础培养基为dmem商用培养基与f12商用培养基按照一定比例混合的培养基；所述外源添加因子包括：l-谷氨酰胺、表皮生长因子（egf）、牛垂体提取物（bpe）、胰岛素、青霉素-链霉素、氯化钙、转铁蛋白、腺嘌呤、氢化可的松和亚硒酸钠。基于上述实施例的描述，本发明的用于原代人表皮细胞培养的无血清培养基体系不含血清，解决了人表皮细胞在体外培养对血清的依赖性问题；并且，所述培养基不添加霍乱毒素和各类贴壁因子，避免了这些复杂成分潜在的安全隐患。此外，和含血清培养基相比，人表皮细胞在本发明的无血清培养基中细胞形态和贴壁率无差异，能满足多次传代需要，且生长状况相似。

实施例2

培养基配制：在商品化的基础培养基mcdb153中添加多种外源因子。其中bpe的浓度为0.03mg/ml，混匀后依次加入l-谷氨酰胺1mm、egf0.05ng/ml、胰岛素0.05mg/ml、青霉素：10ku/ml；链霉素：10mg/ml、氯化钙0.5mm、柠檬酸铁40mg/l、腺嘌呤200μm、氢化可的松0.8μg/ml、亚硒酸钠15μg/l；调节ph至7.2，定容后用0.2μm滤膜过滤除菌，得到无血清人表皮细胞培养基。

使用实例：将消化后的人表皮细胞用pbs溶液清洗；离心处理后用上述无血清人表皮细胞培养基重悬，按照3×105个每瓶接种，置于培养箱在37℃、5%co2条件下培养；过夜后观察细胞形态，24h后换液，继续培养，之后每隔2d换液。原代人表皮细胞在无血清培养基中能较快贴壁，24h内贴壁率可达60~70%，10天左右细胞达到60%汇合，即可进行传代培养。

原代人表皮细胞在该培养基中具有良好的细胞形态，细胞增殖状态良好，与含血清培养基的人表皮细胞状态相似。

本发明实施例提供一种用于原代人表皮细胞培养的无血清培养基体系，该无血清培养基体系包括基础培养基和外源添加因子；其中，所述基础培养基为商品化的mcdb153；所述外源添加因子包括：l-谷氨酰胺、表皮生长因子（egf）、牛垂体提取物（bpe）、胰岛素、青霉素-链霉素、氯化钙、柠檬酸铁、腺嘌呤、氢化可的松和亚硒酸钠。基于上述实施例的描述，本发明的用于原代人表皮细胞培养的无血清培养基体系不含血清，解决了人表皮细胞在体外培养对血清的依赖性问题，且和含血清培养基相比，人表皮细胞在本发明的无血清培养基中细胞形态和贴壁率无差异，能满足多次传代需要，且生长状况相似。

以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何在本申请揭露的技术范围内的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。