一种磁性人工受体及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种磁性人工受体及其制备方法和在高选择性、高特异性垂钓中药潜在抗脑卒中活性成分中的应用。

背景技术：

脑卒中是一种突发性局部脑组织缺血导致的疾病，具有高死亡率、高致残率、高复发率的特点。fda获准的唯一药物组织型纤溶酶原激活剂(tissueplasminogenativator，tpa)由于时间窗狭窄，并发症危险，禁忌症限制等大大降低了使用效率，因此脑卒中药物的研发迫在眉睫。针对脑卒中损伤机制的研究发现，阻断突触后密度蛋白-95(psd-95)与神经元型一氧化氮合酶(nnos)的偶联，能够降低no的释放，减轻缺血性脑卒中的神经细胞凋亡和损伤，在不影响其他神经功能的基础上发挥神经保护作用。由此设计的小分子解偶联剂zl006具有较好的生物活性，但是zl006脂溶性差，不易透过血脑屏障，限制了其临床使用，因此新的小分子解偶联剂成为脑卒中药物研究的热点。

近年来，中药治疗脑卒中已经取得了实际的进展，例如丹参注射液治疗出血性脑卒中以其疗效好、不良反应小等特点应用日益广泛。然而中药成分复杂，含量低和不稳定等特点限制了中药的进一步发展，因此，分离，提取中药中的有效成分是中药开发的重要内容。传统的分离提取技术在无效成分的去除和有效成分的保留上，存在操作复杂，分离时间长，效率低等不足。分子印记聚合物(molecularlyimprintedpolymers，mips)是模拟自然界中受体-抗体相互作用原理，通过分子印记技术合成的纳米聚合物材料，能够实现对模板分子或与模板分子结构相似的分子特异性识别，选择性吸附。在中药成分分离，富集，提取等方面有很好的应用前景。

磁性表面分子印记聚合物，采用沉淀聚合的方式，在聚合物的表面形成印记空穴，提高了mip结合速率，且利用磁性加快分离效率。中国专利(申请号:201019026093.4)用6-n-(2-羟基-3,5-二氯苄基)氨基苯并三氮唑或者4-n-(2-羟基-3,5-二氯苄基)氨基水杨酸为模板，合成了psd-95/nnos解偶联剂分子印记聚合物，但合成的本体mip存在刚性低、不稳定、吸附量小、操作繁琐且需要研磨，印记位点易破坏等缺陷。而以磁性fe3o4为载体，zl006为模板，制备磁性表面分子印记聚合物作为人工受体，将其用于实际样品中psd-95/nnos解偶联剂的垂钓尚未见报道。

技术实现要素：

解决的技术问题：本发明提供一种磁性人工受体及其制备方法和应用，具体来说是从中药中高效、特异性垂钓nnos-psd-95解偶联剂的方法，实现对nnos-psd-95解偶联剂的选择性捕获，为找到活性显著、毒副作用小的抗脑卒中候选药物奠定基础，同时为中药活性成分的的特异性和高效筛选提供新思路和新方法。

技术方案：一种磁性人工受体的制备方法，按比例关系，包括以下步骤：(1)fe3o4@sio2复合颗粒的制备：fecl3·6h2o和fecl2·4h2o用水热法反应制备得到fe3o4磁性纳米粒，取0.3g制得的fe3o4磁性纳米粒超声分散于50ml乙醇中，加入2ml去离子水和2ml氨水，搅拌均匀后，以20μl/min的速度滴加5ml正硅酸乙酯，室温下搅拌反应12h，产物磁性分离，并用去离子水洗至中性，室温真空干燥后备用；(2)fe3o4@sio2@mps复合颗粒的制备：取上述fe3o4@sio2复合颗粒0.5g超声分散于50ml甲苯中，加入10ml甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，以500r/min的速度机械搅拌均匀，充入氮气除氧15min，升温至55℃，继续搅拌反应24h，产物磁性分离，用甲苯洗3次，甲醇洗3次，室温真空干燥后备用；(3)磁性人工受体的制备：将模板分子和功能单体超声分散于致孔剂中，室温下避光静置4h，形成预聚合溶液；充氮气除氧15min，再加入交联剂和引发剂，500r/min的速度机械搅拌溶解；取上述fe3o4@sio2@mps复合颗粒超声分散于致孔剂中，边搅拌边加入到预聚合溶液中，50℃搅拌反应1h，升高温度至60℃，继续搅拌反应24h，产物用酸性洗脱液反复洗涤至检测不到模板分子为止，甲醇洗至中性，真空干燥即得；其中模板分子为zl006，功能单体为甲基丙烯酸、丙烯酸、2-乙烯基吡啶、2-(三氟甲基)丙烯酸或4-乙烯基吡啶，交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯或三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，引发剂为偶氮二异丁腈，所述zl006与功能单体的摩尔比为1:4～1:9；功能单体与交联剂的摩尔比为1:3～1:6；致孔剂与模板分子的摩尔量之比为100～300ml/mmol；引发剂用量为模板分子、功能单体和交联剂总质量的3％～5％；致孔剂为乙醇、乙腈、体积比1:1～9:1的乙腈-乙醇混合液或体积比1:1～9:1的乙腈-甲醇混合液；fe3o4@sio2@mps复合颗粒与模板分子的摩尔量之比为1:1～1:5g/mmol；酸性洗脱液为体积比为1:1～9:1的甲醇-冰醋酸混合溶液。

上述制备方法制得的磁性人工受体。

上述磁性人工受体在筛选中药潜在抗脑卒中活性成分中的应用。

应用具体步骤为，将磁性人工受体超声5～10min，均匀分散于预筛选中药材的提取液中，将上述所得溶液置于振荡培养箱中振荡孵化0.5～3小时后，磁性分离人工受体微球，淋洗液淋洗，去除人工受体微球表面的非特异性吸附组分，最后加入酸性溶剂振荡洗脱，磁性分离洗脱液，得到具有潜在抗脑卒中活性的化学成分。

上述中药材提取溶剂为各体积比的乙醇-水混合液、乙醇溶液，乙腈溶液或各体积比甲醇-水混合液，再加入甲苯稀释作为提取液其中中药材提取溶剂中还含有体积分数50％～90％的甲苯。

上述中药材的提取液与磁性人工受体的液质比为1:4～1:20(ml/mg)，孵化温度为20～40℃，振荡培养箱转速为100～200r/min。

上述淋洗液为乙醇、乙腈、甲苯、体积比1:1～9:1的甲苯-乙腈混合液或体积比1:1～9:1的甲苯-乙醇混合液。

上述酸性溶剂为体积比4:1～9:1的甲醇-冰醋酸的混合液，振荡培养箱转速为100～200r/min，洗脱时间为0.5～1小时，温度为20～40℃。

有益效果：由于中药体系是一个复杂的、化学成分多样化的天然组合化合物库，非特异性、非选择性的体外化学成分分离-活性追踪等传统方法，从成千上万化学成分或药材中找出对特定靶点有针对性作用的药物或成分是一项费时费力的工作，本发明应用分子印记技术构建人工受体为“定向捕集”nnos-psd-95解偶联提供了可能，大大提高天然药物筛选的效率。

本发明以zl006为模板，在磁性纳米硅胶材料的表面设计合成有序、致密分子印记壳层，减少了印记位点被“包埋”的现象，其结合速率和分离效率较高。同时将磁性材料、纳米硅胶以及表面分子印记技术相结合，可在外磁场作用下实现对靶标物质的快速直接分离，为中药活性物质的选择性快速分离富集与检测提供了一种新的强有力手段。

磁性人工受体表面的空穴能够从天然植物中分离出与之结构相似的化合物，其他结构的化合物不能被选择吸附，提高了筛选天然活性成分的效率，且分离富集的化合物可作为临床药理研究的原料来源。

附图说明

图1是实施例1用磁性人工受体垂钓虎杖提取液前后的高效液相色谱图。

a虎杖提取液处理前后的高效液相色谱图，b检测化合物的结构式。

图2是磁性人工受体的静态吸附等温曲线。

图3是磁性人工受体的吸附动力学曲线图。

具体实施方式

以下结合附图实施例及测试例对本发明作进一步详细描述。

聚乙二醇200(peg-200)

正硅酸乙酯(teos)

甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(mps)

甲基丙烯酸(maa)

乙二醇二甲基丙烯酸酯(egdma)

偶氮二异丁腈(aibn)

实施例1

磁性人工受体的制备

制备fe3o4磁性纳米粒：取fecl3·6h2o(4.72g)溶解于80ml去离子水中，通氮气除氧15min，氮气保护下，边搅拌边加入fecl2·4h2o(1.72g)，升高温度至80℃，逐滴加入氨水10ml，继续反应1h，剧烈搅拌下加入2mlpeg-200溶液，反应10min。利用磁性分离出fe3o4纳米粒，去离子水洗至中性，分散于乙醇中备用。

fe3o4@sio2复合颗粒的制备：取干燥的fe3o4磁性纳米粒(0.3g)超声分散于50ml乙醇中，加入去离子水(2ml)，氨水(2ml)以200r/min速度机械搅拌均匀，以20μl/min的速度滴加teos(5ml)，室温下搅拌反应12h，产物磁性分离，用去离子水洗至中性，室温真空干燥后备用。

fe3o4@sio2@mps复合颗粒的制备：取上述fe3o4@sio2复合颗粒(0.5g)超声分散于50ml甲苯中，充入氮气除氧15min，加入mps(10ml)，500r/min的速度机械搅拌均匀，升温至55℃，继续搅拌反应24h，产物磁性分离，用甲苯洗3次，甲醇洗3次，室温真空干燥后备用。

磁性人工受体(mip)的制备：将zl006(0.23g)和maa(0.36ml)超声分散于乙腈-乙醇(8:2，v/v)混合溶液(30ml)中，室温下避光静置4h，形成预聚合溶液。充氮气除氧15min，加入egdma(2.64ml)和aibn(0.13g)，500r/min的速度机械搅拌溶解。取上述fe3o4@sio2@mps复合颗粒(0.1g)超声分散于乙腈-乙醇(8:2，v/v)混合溶液(20ml)中，边搅拌边加入到预聚合溶液中，50℃搅拌1h，升高温度至60℃，继续搅拌24h。产物用甲醇-冰醋酸(9:1，v/v)反复洗涤至zl006完全脱去。真空干燥即得mip。

磁性非人工受体(nip)的制备过程，除在合成过程中不添加模板分子外，其余步骤同mip。

以下所用mip和nip用此方法合成所得。

应用1：

虎杖干燥后磨成粉，过200目筛。取虎杖粉末(2g)加入到乙醇(10ml)中加热回流1h，粗提液过滤，补加乙醇至10ml，再加入9倍体积的甲苯稀释得提取液。

磁性人工受体微球(100mg)超声5min，均匀分散于虎杖提取液(5ml)中，将上述溶液置于振荡培养箱中150r/min孵化2h，磁性分离出人工受体微球。加入甲苯(5ml)淋洗3次，磁性分离，去除残留液。再加入甲醇-冰醋酸(9:1，v/v)(5ml)混合后置于振荡培养箱中160r/min振荡洗脱1h，磁性分离，收集洗脱液。将洗脱液蒸发至干，并复溶于乙醇(1ml)中。

取虎杖提取液(5ml)蒸发至干，复溶于乙醇(1ml)中，作为上样液。将复溶后的上样液和洗脱液分别用0.22μm尼龙滤膜滤过，再经高效液相色谱法(hplc)检测。色谱条件：色谱柱为wondacractods-2(5μm，4.6×250mm)分析柱；柱温：40℃；进样量：20μl；流速1ml/min；检测波长：290nm(uv)；流动相为水(a)-乙腈(b)；梯度洗脱，洗脱方法为：0～40min，b:17％～61％；40～55min，b：61％～100％，如图1。

从图1可以看出，洗脱液中化合物1、2、3、4、5因结构与zl006相似被保留，说明磁性人工受体对与模板结构相似的化合物有选择性，垂钓成功。

应用2：

制何首乌干燥后磨成粉，过200目筛。取制何首乌粉末(1g)加入到乙醇(10ml)中加热回流1h，粗提液过滤，补加乙醇至10ml，再加入9倍体积的甲苯稀释得提取液。

磁性人工受体微球(20mg)超声5min，均匀分散于制何首乌提取液(5ml)中，将上述溶液置于振荡培养箱中150r/min孵化1h。磁性分离出人工受体微球，加入甲苯-乙腈(9:1，v/v)混合液(5ml)淋洗3次，磁性分离，去除残留液。再加入甲醇-冰醋酸(9:1，v/v)(5ml)混合后置于振荡培养箱中200r/min振荡洗脱1h，磁性分离，收集洗脱液。将洗脱液蒸发至干，并复溶于乙醇(1ml)中。

取何首乌提取液(5ml)蒸发至干，并复溶于乙醇(1ml)中，作为上样液。将复溶后的上样液和洗脱液分别用0.22μm尼龙滤膜滤过，再经高效液相色谱法(hplc)检测。色谱条件：色谱柱为wondacractods-2(5μm，4.6×250mm)分析柱；柱温：40℃；进样量：20μl；流速1ml/min；检测波长：290nm(uv)；流动相为水(a)-乙腈(b)；梯度洗脱，洗脱方法为：0～40min，b:17％～61％；40～55min，b：61％～100％。

应用3：

大黄干燥后磨成粉，过200目筛。取大黄粉末(1g)加入到乙醇(10ml)中加热回流1h，粗提液过滤，补加乙醇至10ml，再加入5倍体积的甲苯稀释得提取液。

磁性人工受体微球(80mg)超声5min，均匀分散于虎杖提取液(5ml)中，将上述溶液置于振荡培养箱中150r/min孵化2h。磁性分离出人工受体微球，加入甲苯(5ml)淋洗3次，磁性分离，去除残留液。再加入甲醇-冰醋酸(9:1，v/v)(5ml)混合后置于振荡培养箱中160r/min振荡洗脱1h，磁性分离，收集洗脱液。将洗脱液蒸发至干，并复溶于1ml乙醇中。

取大黄提取液(5ml)蒸发至干，复溶于乙醇(1ml)中，作为上样液。将复溶后的上样液和洗脱液分别用0.22μm尼龙滤膜滤过，再经高效液相色谱法(hplc)检测。色谱条件：色谱柱为wondacractods-2(5μm，4.6×250mm)分析柱；柱温：40℃；进样量：20μl；流速1ml/min；检测波长：320nm(uv)；流动相为水(a)-乙腈(b)；梯度洗脱，洗脱方法为：0～40min，b:17％～53％；40～55min，b：53％～100％。

取上述合成的mip和nip进行如下测试实验。

测试实施例1.静态吸附实验

精密称取mip与nip各5份(20.0mg)，置于15ml三角瓶中，磁性微球超声10min分别均匀分散在0.5mmol/l，1.0mmol/l，3.0mmol/l，5.0mmol/l，7.0mmol/lzl006的乙腈-乙醇(8:2，v/v)混合溶液中，将上述溶液置于振荡培养箱中振荡孵化1h，取上清液，经0.22μm尼龙膜滤过，取续滤液稀释定容，紫外-可见分光光度仪于305nm处测定样品吸附前后的浓度，根据式(1)计算出平衡吸附量qe，平行操作三次。

式中：c0和ce分别为模板分子的起始浓度和平衡浓度(mmol/l)；v为吸附溶液的体积(ml)；m为印记聚合物的质量(g)。

从图2可以看出，mip的最大吸附量远远大于nip，说明mip对zl006的吸附不同于物理吸附，而是一种有特异性识别位点的选择性吸附，这种分子识别特性来自于该聚合物的结合基团与模板分子的功能基之间的氢键作用和空穴的几何选择性。

测试实施例2.动态吸附实验

精密称取mip与nip各7份(20.0mg)，置于15ml三角瓶中，磁性微球超声10min分别均匀分散于5.0mmol/lzl006的乙腈-乙醇(8:2，v/v)混合溶液中，将上述溶液置于振荡培养箱中振荡孵化1h，取上清液，经0.22μm尼龙膜滤过，取续滤液稀释定容，紫外-可见分光光度仪于305nm处测定样品吸附前后的浓度，根据式(1)计算出平衡吸附量qe，平行操作三次。

从图3可以看出，随着吸附时间的增加，印记材料对zl006的吸附量不断上升，40分钟后基本达到吸附平衡。实验表明，印记材料对zl006具有较快的吸附速率，与传统分离和富集方式相比更加快速。