本发明涉及生物制品技术领域，尤其是涉及石莼活性多肽的制备方法。
背景技术：
石莼属绿藻门、绿藻纲、石莼目、石莼科、石莼属，其藻体呈黄绿色，有两层细胞组成的膜状体，边缘宽可达厘米左右。石莼多生长在中、低潮带的岩石上或石沼中，南方种类颜色偏黄，北方种类颜色偏绿，藻体含有多种维生素、麦角固醇，以及酸及丙、丁、戊、十四、十六酸有机酸等。石莼是一种大型海藻，广泛分布于西太平洋沿海。其适温范围0-35℃，适盐范围15-35%，具有很强的生命力和再生力，生长极泼辣，在水质肥沃的内湾生长更为旺盛，是我国野生藻类中资源极为丰富的一种。它不仅藻体鲜艳、味道鲜美，而且富含许多营养物质，具有很高的经济价值。但其在海藻加工工业中的利用价值远不如褐藻和红藻，因而通常作为天然垃圾废弃堆积，造成严重的环境污染和资源浪费。
干石莼经过化学分析表明，主要成分有粗纤维、碳水化合物、蛋白质及灰分，并含有少量脂肪，石莼中还含有k、na、ca、mg、ni、zn、mo、cu等多种微量元素。蛋白质含量较高，一般含量在17～26%之间，不同产地的石莼蛋白质含量不尽相同、另外季节等因素也会对孔石莼中的蛋白质含量产生一定的影响作用，石莼蛋白质中含有丰富的氨基酸，其中有8种为人体必需氨基酸。石莼功用始载于《本草拾遗》，日“石莼生南海，附石而生，似紫菜，色青”，主“味甘无毒，入水，利小便”，《本草纲目》中记载谓“出闽、浙者，大叶似菜”，故也名海青菜，有软坚散结、清热解毒、利水降脂等功效。药理研究表明，石莼在降血脂、降血糖、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化以及克生作用等多方面都显现出了较强的生物活性。石莼可作海菜食用，有清口、解毒、消炎等功效，也可以用于防治中暑、消肿，治喉痛、肠胃炎，除口臭等。
现有技术如授权公告号为cn102851345b的中国发明专利，公开了小球藻抗肿瘤多肽的制备方法，首先采用低温超高压连续流细胞破碎机提取小球藻蛋白，再用胰蛋白酶水解小球藻蛋白，超滤离心管过滤，获得分子量大小范围为0-3kd、3-5kd、5-10kd以及大于10kd的小球藻多肽。该方法制备的小球藻多肽对人肝癌细胞hepg2体外生长具有一定的抑制作用，有利于抗肿瘤保健食品和医药产品的开发利用，但是制备周期长，小球藻多肽得率低。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种活性蛋白肽制备效率高、得率高、纯度高、能耗低、对环境友好的石莼活性多肽的制备方法。
本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：石莼活性多肽的制备方法，包括细胞破碎、盐析、透析、蛋白酶解、超滤，具体包括以下步骤：
细胞破碎：将石莼粉按1:14-16料液比加水混匀，放入温度4-6℃、流速18-21ml/min、压力110-130mpa、循环2-3次的细胞破碎仪内进行细胞破碎，过滤，将滤液在温度为40-50℃、功率为200-300w的超声波处理25-35min，然后经3-5℃、7000-9000rpm的低温离心机离心18-22min，即得蛋白提取液，该步骤结合细胞破碎仪与超声波进行细胞破壁，不影响蛋白质的活性，能够大大缩短细胞破壁的时间，提高工作效果，可大批量化破碎藻细胞，适用于工业化生产；
盐析：向蛋白提取液中加入(nh4)2so4至20-25%饱和度，静止15-20min，继续加入(nh4)2so4至50-55%饱和度，静止15-20min，然后在3-5℃、4000-6000rpm下离心20-25min，即得盐析沉淀物，该步骤中加入大量的硫酸铵，使蛋白质得溶解度降低而沉淀析出，该方法优点在于硫酸铵浓度变化具有连续性，盐析效果好，节约能耗，且采用不同浓度的硫酸铵溶液，可缩短沉淀时间，效果良好；
透析：将盐析沉淀物溶解于磷酸盐缓冲液，然后装入透析袋，在ddh2o中透析，更换ddh2o4-6次，袋内溶液冷冻干燥，即得石莼蛋白，该方法利用小分子物质在溶液中可通过透析袋，而大分子物质不能通过透析袋的性质，达到除去(nh4)2so4小分子杂质的目的，操作简单，效果好，节约能耗；
蛋白酶解：将石莼蛋白按1:4-6料液比加水混匀，条件ph至7-8，加1000-1200u/g的胰蛋白酶酶和600-800u/g的木瓜蛋白酶，在45-50℃下酶解6-8h，灭酶，冷却，离心，上清液即为酶解液，该步骤采用双酶酶解法制备石莼活性多肽，利用两种蛋白酶作用的专一性，使原料蛋白质充分水解成活性多肽，提高石莼蛋白质的转化率，使蛋白质尽可能的降解为活性多肽，且可使活性肽具有味道鲜美、营养丰富的优点；
超滤：将酶解液用分子截留量为3-5kda的超滤膜超滤，超滤压力为0.2-0.22mpa，即得石莼活性多肽，其氨基酸序列为hshsvcgyyvshrgrcycrclrcrvlhpgklcvcvncsr，该活性多肽具有较强的抗氧化活性，结合细胞代谢中的自由基及过氧化物，防止线粒体的脂质过氧化等，保护细胞抵抗衰老，促进uvb老化的hsf的增殖和胶原蛋白产生的能力，能显著促进人成纤维细胞中胶原蛋白的合成，强化结缔组织，促进细胞活性，从而提升其弹性，减少皱纹，增强光泽与透明度，具有抗皮肤光老化活性的活性，能够延缓皮肤的衰老，可用于化妆品领域。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明提供的石莼活性多肽的制备方法，制备效率高、得率高、纯度高、能耗低、对环境友好，工艺简单有效，生产成本低，产量大，适合大规模制备石莼活性多肽；该制备方法采用的双酶酶解法可利用两种蛋白酶作用的专一性，使原料蛋白质充分水解成活性多肽，提高石莼蛋白质的转化率，使蛋白质尽可能的降解为活性多肽；该提取方法得到的活性多肽具有较强的抗氧化活性，结合细胞代谢中的自由基及过氧化物，防止线粒体的脂质过氧化等，保护细胞抵抗衰老；该活性多肽能促进uvb老化的hsf的增殖和胶原蛋白产生的能力，能显著促进人成纤维细胞中胶原蛋白的合成，强化结缔组织，促进细胞活性，从而提升其弹性，减少皱纹，增强光泽与透明度，具有抗皮肤光老化活性的活性，能够延缓皮肤的衰老，可用于化妆品领域。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
石莼活性多肽的制备方法，包括细胞破碎、盐析、透析、蛋白酶解、超滤，具体包括以下步骤：
1）细胞破碎：将石莼粉按1:15料液比加水混匀，放入温度4℃、流速18ml/min、压力120mpa、循环3次的细胞破碎仪内进行细胞破碎，过滤，将滤液在温度为45℃、功率为200w的超声波处理30min，然后经4℃、8000rpm的低温离心机离心20min，即得蛋白提取液，该步骤结合细胞破碎仪与超声波进行细胞破壁，不影响蛋白质的活性，能够大大缩短细胞破壁的时间，提高工作效果，可大批量化破碎藻细胞，适用于工业化生产；
2）盐析：向蛋白提取液中加入(nh4)2so4至25%饱和度，静止15min，继续加入(nh4)2so4至55%饱和度，静止20min，然后在4℃、5000rpm下离心25min，即得盐析沉淀物，该步骤中加入大量的硫酸铵，使蛋白质得溶解度降低而沉淀析出，该方法优点在于硫酸铵浓度变化具有连续性，盐析效果好，节约能耗，且采用不同浓度的硫酸铵溶液，可缩短沉淀时间，效果良好；
3）透析：将盐析沉淀物溶解于磷酸盐缓冲液，然后装入透析袋，在ddh2o中透析，更换ddh2o5次，袋内溶液冷冻干燥，即得石莼蛋白，该方法利用小分子物质在溶液中可通过透析袋，而大分子物质不能通过透析袋的性质，达到除去(nh4)2so4小分子杂质的目的，操作简单，效果好，节约能耗；
4）蛋白酶解：将石莼蛋白按1:5料液比加水混匀，调节ph至7.5，加1200u/g的胰蛋白酶酶和700u/g的木瓜蛋白酶，在45℃下酶解8h，在100℃水浴灭酶16min，冷却至室温，在4℃、5000rpm下离心25min，上清液即为酶解液，该步骤采用双酶酶解法制备石莼活性多肽，利用两种蛋白酶作用的专一性，使原料蛋白质充分水解成活性多肽，提高石莼蛋白质的转化率，使蛋白质尽可能的降解为活性多肽，且可使活性肽具有味道鲜美、营养丰富的优点；
5）超滤：将酶解液用分子截留量为3kda的超滤膜超滤，超滤压力为0.2mpa，即得石莼活性多肽，其氨基酸序列为hshsvcgyyvshrgrcycrclrcrvlhpgklcvcvncsr，该活性多肽具有较强的抗氧化活性，结合细胞代谢中的自由基及过氧化物，防止线粒体的脂质过氧化等，保护细胞抵抗衰老，促进uvb老化的hsf的增殖和胶原蛋白产生的能力，能显著促进人成纤维细胞中胶原蛋白的合成，强化结缔组织，促进细胞活性，从而提升其弹性，减少皱纹，增强光泽与透明度，具有抗皮肤光老化活性的活性，能够延缓皮肤的衰老，可用于化妆品领域。
实施例2：
石莼活性多肽的制备方法，包括细胞破碎、盐析、透析、蛋白酶解、超滤，具体包括以下步骤：
1）将石莼粉按1:14料液比加水混匀，放入温度4℃、流速21ml/min、压力130mpa、循环2次的细胞破碎仪内进行细胞破碎，过滤，将滤液在温度为50℃、功率为200w的超声波处理35min，然后经低温离心机离心即得蛋白提取液，该步骤结合细胞破碎仪与超声波进行细胞破壁，不影响蛋白质的活性，能够大大缩短细胞破壁的时间，提高工作效果，可大批量化破碎藻细胞，适用于工业化生产；
2）盐析：向蛋白提取液中加入(nh4)2so4至22%饱和度，静止18min，继续加入(nh4)2so4至52%饱和度，静止16min，离心，即得盐析沉淀物，该步骤中加入大量的硫酸铵，使蛋白质得溶解度降低而沉淀析出，该方法优点在于硫酸铵浓度变化具有连续性，盐析效果好，节约能耗，且采用不同浓度的硫酸铵溶液，可缩短沉淀时间，效果良好；
3）透析：将盐析沉淀物溶解于磷酸盐缓冲液，然后装入透析袋，在ddh2o中透析，更换ddh2o4次，袋内溶液冷冻干燥，即得石莼蛋白，该方法利用小分子物质在溶液中可通过透析袋，而大分子物质不能通过透析袋的性质，达到除去(nh4)2so4小分子杂质的目的，操作简单，效果好，节约能耗；
4）蛋白酶解：将石莼蛋白按1:4料液比加水混匀，调节ph至7.8，加1100u/g的胰蛋白酶酶和800u/g的木瓜蛋白酶，在45℃下酶解8h，灭酶，冷却，离心，上清液即为酶解液，该步骤采用双酶酶解法制备石莼活性多肽，利用两种蛋白酶作用的专一性，使原料蛋白质充分水解成活性多肽，提高石莼蛋白质的转化率，使蛋白质尽可能的降解为活性多肽，且可使活性肽具有味道鲜美、营养丰富的优点；
5）超滤：将酶解液用分子截留量为4kda的超滤膜超滤，超滤压力为0.21mpa，即得石莼活性多肽，其氨基酸序列为hshsvcgyyvshrgrcycrclrcrvlhpgklcvcvncsr，该活性多肽具有较强的抗氧化活性，结合细胞代谢中的自由基及过氧化物，防止线粒体的脂质过氧化等，保护细胞抵抗衰老，促进uvb老化的hsf的增殖和胶原蛋白产生的能力，能显著促进人成纤维细胞中胶原蛋白的合成，强化结缔组织，促进细胞活性，从而提升其弹性，减少皱纹，增强光泽与透明度，具有抗皮肤光老化活性的活性，能够延缓皮肤的衰老，可用于化妆品领域。
实施例3：
石莼活性多肽的制备方法：将石莼粉按1:16料液比加水混匀，放入温度6℃、流速20ml/min、压力110mpa、循环3次的细胞破碎仪内进行细胞破碎，过滤，将滤液在温度为48℃、功率为220w的超声波处理30min，离心；向离心液中加入(nh4)2so4至25%饱和度，静止18min，继续加入(nh4)2so4至53%饱和度，静止17min，离心，即得盐析沉淀物；将盐析沉淀物溶解于磷酸盐缓冲液，然后装入透析袋，在ddh2o中透析，更换ddh2o6次，袋内溶液冷冻干燥，即得石莼蛋白；将石莼蛋白按1:4料液比加水混匀，调节ph至7.8，加1200u/g的胰蛋白酶酶和800u/g的木瓜蛋白酶，在50℃下酶解6h，灭酶，冷却，离心；将上清液用分子截留量为5kda的超滤膜超滤，超滤压力为0.2mpa，即得石莼活性多肽。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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<110>舟山富晟食品科技有限公司
<120>石莼活性多肽的制备方法
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