基于核酸层析生物传感技术检测食源性致病菌的方法与流程

本发明涉及生物传感检测技术领域，具体地说，涉及一种基于核酸层析生物传感技术检测食源性致病菌的方法。

背景技术：

近年来，食源性致病菌引发的食品安全事件频发，相应的检测技术要求也逐渐严格。传统的检测技术主要依赖于平板培养以及生理生化鉴定，对于一些难以培养的菌株而言，容易产生检测的假阴性。近年来兴起的快速检测技术有酶联免疫技术、pcr及定量pcr技术、等温扩增技术、传感器技术等，综合比较，传感器技术在现场快速检测中因其高灵敏度和便携性而占有更大的优势。

随着技术的发展，各种各样的传感器都应用于致病菌的检测，例如光学传感器、电化学传感器、晶体传感器等。大部分传感器都具有很好的检测性能，但因为检测成本的原因不能在现场进行推广。相比之下，核酸层析生物传感器的优势就体现出来：成本低、易合成、稳定性好等，使之成为致病菌快速检测领域的一股新流。

识别元件是核酸层析生物传感器的一个重要部件。传统的信号识别通过抗原抗体之间的免疫亲和实现，但是抗体的成本高且稳定性差，不适合推广应用。近年来核酸杂交逐渐应用到信号识别中，体现出良好的灵敏度和稳定性。肽核酸是一种人工核酸，能够与核酸之间发生碱基配对，且稳定性更高，因此，将肽核酸应用在核酸传感器的识别元件中，将会显著提高检测的灵敏度和稳定性。

为了提高检测的灵敏度，信号的放大至关重要，通过分子扩增技术能够有效实现原始信号的放大。一般用到的预扩增技术有pcr技术、lamp技术、rpa技术等，考虑到现场检测的时效性，rpa技术最能满足检测需求。rpa技术是一种重组聚合酶扩增技术，能够在短时间内实现产物的累积，但是产物是双链核酸，无法用单链核酸试纸条进行可视化检测。为了提高rpa技术的实用性，将通用接头及核酸阻断技术引入到rpa技术中，建立一种新型的通用接头阻断重组聚合酶扩增技术，能够得到带有单链接头的扩增产物，利用单链试纸条实现可视化检测。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于核酸层析生物传感技术检测食源性致病菌的方法。

本发明构思如下：通过建立一种功能核酸全程控制的便携、简单、封闭式的生物传感器，用于实现食源性致病菌的现场快超灵敏检测。将通用接头阻断技术应用在rpa技术中实现双链产物向单链产物的转化，同时也能推广应用到其他的双链分子扩增技术中，拓展了分子扩增技术的应用范围。本发明构建的基于肽核酸的单链核酸层析试纸条，能够高效捕获单链核酸，提高检测灵敏度和稳定性，实现可视化检测。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种用于构建rpa生物传感器的通用阻断接头序列，其核苷酸序列如seqidno:1所示。

本发明还提供一种基于肽核酸的核酸层析试纸条，所述试纸条的制备方法包括以下步骤：

1)纳米金颗粒的制备；

2)肽核酸探针的制备：人工合成质控捕获探针ccp、检测捕获探针tcp和连接探针p，它们的序列分别为：

质控捕获探针ccp：5’-biotin-tggtggtgctggtt-3’

检测捕获探针tcp：5’-biotin-aaccagcaccacca-3’

连接探针p：5’-cys-aaccagcaccacca-glu-glu-glu-3’

3)纳米金修饰的连接探针p的制备；

4)基于肽核酸的核酸层析试纸条的组装：所述试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，其中，所述硝酸纤维素膜上设有至少1条检测线和1条质控线；

①将样品垫和结合垫浸泡在缓冲液中，然后37℃烘干2-3h；所述缓冲液为：0.25-0.5％tritonx-100，0.1-0.2m硼酸盐缓冲液，0.15-0.3mnacl，ph8.0；其中，所述结合垫上固定有纳米金修饰的连接探针p；

②将30-50μl的1mg/ml链霉亲和素溶液与30-50μl的100μm肽核酸捕获探针溶液进行混合，然后在室温下孵育1-2h，分别制备出链霉亲和素-生物素化的质控捕获探针和检测捕获探针，然后分别在硝酸纤维素膜上划出质控线和检测线，37℃烘干12-14h；

③将上述样品垫、结合垫、带有质控线和检测线的硝酸纤维素膜以及吸收垫依次粘贴在底板上，完成试纸条的组装。

步骤1)中利用柠檬酸钠烧金法制备粒径为13nm的纳米金颗粒。

步骤3)具体为：将5-10μm步骤2)的连接探针p与10-20nm步骤1)的纳米金颗粒在5mm磷酸缓冲液中反应12-14h，然后14000rpm离心20-30分钟，收集沉淀物，再用5mm磷酸缓冲液冲洗沉淀物，最后溶解在10mm的磷酸缓冲液中，即得纳米金修饰的连接探针p。

在本发明的一个优选实施方式中，所述基于肽核酸的核酸层析试纸条的制备如下：

步骤3)具体为：将5μm步骤2)的连接探针p与10nm步骤1)的纳米金颗粒在5mm磷酸缓冲液中反应12h，然后14000rpm离心20分钟，收集沉淀物，再用5mm磷酸缓冲液冲洗沉淀物，最后溶解在10mm的磷酸缓冲液中，即得纳米金修饰的连接探针p。

步骤4)基于肽核酸的核酸层析试纸条的组装：

①将样品垫和结合垫浸泡在缓冲液中，然后37℃烘干2-3h；所述缓冲液为：0.25％tritonx-100，0.1m硼酸盐缓冲液，0.15mnacl，ph8.0；

②将30μl的1mg/ml链霉亲和素溶液与30μl的100μm肽核酸捕获探针溶液进行混合，然后在室温下孵育1h，分别制备出链霉亲和素-生物素化的质控捕获探针和检测捕获探针，然后分别在硝酸纤维素膜上划出质控线和检测线，37℃烘干12h；

③将上述样品垫、结合垫、带有质控线和检测线的硝酸纤维素膜以及吸收垫依次粘贴在底板上，完成试纸条的组装。组装好的试纸条的结构示意图见图5。

继而，本发明提供一种基于核酸层析生物传感技术检测食源性致病菌的方法，包括以下步骤：

s1、以目标致病菌的高特异性毒力基因为靶序列，设计rpa引物rpa-uf和rpa-ur；

s2、提取待测样品dna，以dna为模板，利用步骤s1的rpa引物rpa-uf和rpa-ur进行rpa扩增反应；

s3、将步骤s2的rpa扩增产物与分析缓冲液混合，滴加到上述基于肽核酸的核酸层析试纸条的样品垫上，反应5-8min，判读结果。阴性反应：质控线显色，检测线不显色；阳性反应：质控线、检测线均显色；失效反应：若质控线不显色，则检测失败或试纸条失效。

其中，步骤s1具体为：以目标致病菌的高特异性毒力基因为靶序列，设计rpa扩增引物rpa-f、rpa-r，将所述的通用阻断接头序列和至少1个c3阻断子顺次连接到引物rpa-f、rpa-r的5’端，得到用于通用接头阻断rpa扩增技术的引物rpa-uf、rpa-ur。

步骤s3所述分析缓冲液为：4×ssc，2％bsa，0.05％tween-20，ph7.0。

步骤s1是将所述通用阻断接头序列和1个、2个或4个c3阻断子顺次连接到引物rpa-f、rpa-r的5’端，得到用于通用接头阻断rpa扩增技术的引物rpa-uf、rpa-ur。优选地，将所述通用阻断接头序列和2个c3阻断子顺次连接到引物rpa-f、rpa-r的5’端。

按照twistamp基础试剂盒(twistdx公司，英国)说明，配制rpa扩增反应体系，具体如下：

i)根据rpa反应试剂盒说明书，配制混合液：29.5μl复水反应液，10μm引物rpa-uf和rpa-ur各2.4μl，2.4μl模板dna，ddh2o补齐47.5μl；

ii)将上述混合液转移到含有冻干粉的冻存管中，完全溶解后添加280mm醋酸镁2.5μl。

rpa扩增反应的条件为：38℃反应20分钟。

本发明进一步提供含有上述用于构建rpa生物传感器的通用阻断接头序列和/或上述基于肽核酸的核酸层析试纸条的试剂盒。

在本发明的一个具体实施方式中，利用上述基于核酸层析生物传感技术对鼠伤寒沙门氏菌进行了检测(非诊断目的)。具体方法如下：

1、引物及探针设计

选取沙门氏菌的inva基因作为靶序列(genbank：dq644633.1)，根据twistamp^tm反应试剂盒指导，自行设计rpa扩增引物(rpa-f，rpa-r)。将通用接头以及c3阻断子连接到rpa引物的5’端，用于设计通用接头阻断重组聚合酶扩增技术(ublrpa)的引物(rpa-uf，rpa-ur)。为了验证阻断的效果，设置了0、1、2、4个c3阻断子，在序列中用x表示。根据通用接头设计核酸试纸条上的探针，c线上的质控探针(ccp)、t线上的捕获探针(tcp)、纳米金的连接探针(p)，这些探针全部是用肽核酸(pna)合成。其中ccp和tcp的n端都修饰有生物素(bio)，p的n端修饰有半胱氨酸残基，c端修饰有三个连续的谷氨酸。(表1)

表1

实验前期共设计了5对引物rpa-f和rpa-r，通过rpa扩增后，根据最终产物电泳图条带的明暗清晰程度来选择最合适的引物对，表1中的引物rpa-f和rpa-r在5对引物中扩增效果最佳。

2、rpa和ublrpa反应

利用twistamp基础试剂盒进行rpa引物的可行性验证，通过2％凝胶电泳发现具有良好的扩增条带，证明引物能够用于rpa反应。为了验证通用接头不会对rpa扩增产生抑制，分别利用带有接头的引物进行扩增，结果用2％凝胶电泳验证，具有明显的扩增条带，证明接头不会影响rpa扩增，能够用于建立ublrpa技术。随后利用添加阻断子的引物进行扩增，验证阻断子的数目对阻断效果的影响，阻断的产物是单双链复合体，在凝胶电泳中难以判断产物大小，因此产物用毛细管电泳进行分析，结果发现1、2和4个阻断子都有较好的阻断效果。为了保证阻断的严格性，后续实验选取2个阻断子，成功建立了ublrpa扩增技术。

3、纳米金和纳米金探针的制备

利用柠檬酸钠烧金法制备纳米金，利用tem观察纳米金颗粒的尺寸，同时测量纳米金的zeta扫描电位，随后将制备好的纳米金与肽核酸进行偶联，制备纳米金探针。制备期间，为了防止纳米金聚沉，选用bspp缓冲液进行孵育。5-10μmpna探针与10-20nmau-np在5mm磷酸缓冲液反应12-14h，然后14000rpm离心20-30分钟分离纳米金探针，再用5mm磷酸缓冲液进行冲洗两遍，最后溶解在10mm的磷酸缓冲液中，保存使用。制备好的纳米金探针利用tem观察形态，同时测量纳米金探针的zeta扫描电位。

4、基于pna的核酸试纸条的建立

利用肽核酸制备基于pna的核酸层析试纸条(plfd)。该试纸条分为4部分：样品垫、结合垫、nc膜和吸附垫。样品垫和结合垫(结合垫上固定有纳米金修饰的连接探针p)浸泡在缓冲液(0.25-0.5％tritonx-100，0.1-0.2m硼酸盐缓冲液，0.15-0.3mnacl，ph8.0)中，然后37℃烘干2-3h。将30-50μl的1mg/ml链霉亲和素溶液与30-50μl的100μm捕获探针进行混合，然后在室温下孵育1-2h，制备出链霉亲和素-生物素化的质控/检测捕获探针(ccp/tcp)。然后分别用ccp和tcp在nc膜上划c线和t线，37℃烘干12-14h。

5、实际样品检测

利用ublrpa扩增技术和plfd试纸条搭建完成的基于功能核酸的生物传感器，用于实际样品检测。采用加标回收的方式，利用不同浓度(10¹、10²、10³、10⁴)的沙门氏菌人工污染牛奶样品，然后利用建立的生物传感器进行检测。首先利用ublrpa扩增沙门氏菌的基因组，得到含有通用接头的单双链复合产物；然后利用plfd试纸进行可视化分析，将50μl分析缓冲液(4×ssc，2％bsa，0.05％tween-20(ph7.0))与10-20μl产物混合，滴加到样品垫上，5-8min判定结果，随后读取红色条带的吸峰值。验证结果良好，回收率在94.7±6.9％至107.1±3.4％之间，证明该传感器能够用于沙门氏菌的检测。

本发明具有以下优点：

(一)首次建立了通用接头阻断技术，实现双链向单链产物的转化。

(二)利用通用接头和c3阻断子建立了通用接头阻断重组聚合酶扩增技术。

(三)利用pna探针建立了单链核酸杂交试纸条，实现核酸产物的可视化分析。

(四)搭建了一个简单、便携、封闭式生物传感器，用于食源性致病菌的超灵敏检测。

(五)本方法具有通用型，仅需根据检测对象更换引物，即可实现现场可视化检测。

(六)本方法针对沙门氏菌的检测水平可达4cfuml^-1。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中ublrpa扩增结果；其中，(a)接头引物可行性验证；泳道m：dnamarkerdl2000，泳道1-2：引物rpa-f和rpa-r，泳道3-4：引物rpa-uf0和rpa-r，泳道5-6：引物rpa-f和rpa-ur0，泳道7-8：引物rpa-uf0和rpa-ur0，泳道9：阴性对照；(b)阻断子效果验证，泳道l：dnamarkerdl150，泳道1：无接头阳性对照，泳道2：0个c3阻断子，泳道3：1个c3阻断子；泳道4：2个c3阻断子，泳道5：4个c3阻断子；(c)ublrpa的特异性，泳道m：dnamarkerdl2000，泳道1：salmonellatyphimuriumcicc10420，泳道2：salmonellaentericaatcc55105，泳道3：salmonellaspp，cgmcc1.1552，泳道4：listeriamonocytogenesatcc19112，泳道5：listeriamonocytogenescau05021，泳道6：pseudomonasaeruginosaatcc47085，泳道7：escherichiacolicicc10899，泳道8：staphyloccocusaureuscicc10306，泳道9：clostridiumperfringensatcc10388，泳道10：bacilluscereusatcc21928，泳道11：enterobactersakazakiiatcc51329，泳道12：shigellasonneicicc21535，泳道13：bifidobacteriumlongumcgmcc2265，泳道14：acetobacteracetiatcc15973，泳道15：zygosaccharomycesbailiiatcc56075，泳道16：bacteroidesfragilisatcc25285，泳道17：阴性对照。

图2为本发明较佳实施例中纳米金颗粒、pna以及纳米金探针的zeta扫描电位图；其中，(a)aunps，(b)pna探针，(c)纳米金探针。

图3为本发明较佳实施例中itc数据曲线以及结合等温拟合曲线(a)pna和dna，(b)dna和dna。

图4为本发明较佳实施例中利用plfd核酸层析试纸条分析ublrpa产物；其中，(a)灵敏度，条带1：10⁶cfuml^-1，条带2：10⁵cfuml^-1，条带3：10⁴cfuml^-1，条带4：10³cfuml^-1，条带5：10²cfuml^-1，条带6：10cfuml-¹，条带7：1cfuml^-1，条带8：阴性对照；(b)最低检测限实验.，条带1：10cfuml^-1，条带2：8cfuml^-1，条带3：6cfuml^-1，条带4：4cfuml^-1，条带5：2cfuml^-1，条带6：阴性对照；(c)标准曲线。

图5为本发明基于肽核酸的核酸层析试纸条的结构示意图。其中，1-样品垫，2-硝酸纤维素膜，3-结合垫，4-吸收垫，5-检测线，6-质控线，7-底板。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw，molecularcloning：alaboratorymanual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1基于核酸层析生物传感技术检测食源性致病菌的方法

本实施例中共有16种微生物用于生物传感器的构建，将鼠伤寒沙门氏菌作为生物传感器构建的模式菌株(表2)。

表2

所有的菌株用lb培养基进行活化，37℃培养16h，其中鼠伤寒沙门氏菌用0.8％的生理盐水进行梯度稀释，保证终浓度为1-10⁶cfuml^-1。

1、引物及探针设计

选取沙门氏菌的inva基因作为靶序列(genbank：dq644633.1)，根据twistamp^tm反应试剂盒指导，自行设计rpa扩增引物(rpa-f，rpa-r)。将通用接头以及c3阻断子连接到rpa引物的5’端，用于设计通用接头阻断重组聚合酶扩增技术(ublrpa)的引物(rpa-uf，rpa-ur)。为了验证阻断的效果，设置了0、1、2、4个c3阻断子，在序列中用x表示。根据通用接头设计核酸试纸条上的探针，c线上的质控探针(ccp)、t线上的捕获探针(tcp)、纳米金修饰的连接探针(p)，这些探针全部是用肽核酸(pna)合成。其中ccp和tcp的n端都修饰有生物素(bio)，p的n端修饰有半胱氨酸残基，c端修饰有三个连续的谷氨酸。(表1)

2、rpa和ublrpa反应

利用twistamp基础试剂盒进行rpa引物的可行性验证，通过2％凝胶电泳发现具有良好的扩增条带，证明引物能够用于rpa反应。为了验证通用接头不会对rpa扩增产生抑制，分别利用带有接头的引物进行扩增，结果用2％凝胶电泳验证，具有明显的扩增条带，证明接头不会影响rpa扩增，能够用于建立ublrpa技术。随后利用添加阻断子的引物进行扩增，验证阻断子的数目对阻断效果的影响，阻断的产物是单双链复合体，在凝胶电泳中难以判断产物大小，因此产物用毛细管电泳进行分析，结果发现1、2和4个阻断子都有较好的阻断效果。为了保证阻断的严格性，后续实验选取2个阻断子，成功建立了ublrpa扩增技术。

3、ublrpa扩增技术的建立

通用接头是一条富含鸟嘌呤的单链核酸，根据rpa引物设计指导，富含鸟嘌呤会影响引物的扩增效率。基于此，首先验证通用接头是否会对扩增产生抑制。设置四组实验进行验证：rpa-f和rpa-r，rpa-uf0和rpa-r，rpa-f和rpa-ur0，以及rpa-uf0和rpa-ur0，结果用2％凝胶电泳进行分析。结果显示(图1a)接头并没有抑制扩增，带有一个接头的引物扩增出来的产物比没有接头的长19bp，带有两个接头的引物扩增出来的产物比没有接头的长38bp。

接头引物验证成功之后，进一步分析阻断子的阻断作用，建立通用接头阻断技术。设置1、2和4个c3阻断子进行扩增，结果用毛细管电泳进行分析。结果显示(图1b)c3阻断子具有显著的阻断效果，产物大小与没有阻断的接头引物具有明显的大小差异。为了保证阻断效果的稳定性及严格性，选取2个c3阻断子建立ublrpa扩增技术。然后利用该技术进行特异性验证，结果证明(图1c)只有沙门氏菌有扩增条带，其他菌株没有扩增条带，证明该技术具有良好的特异性。

4、纳米金及纳米金探针的制备

纳米金的尺寸会影响纳米金的性能，利用柠檬酸钠烧金法制备出13nm的纳米金颗粒，能够用于纳米金探针的制备。将5μm连接探针p(pna)与10nmau-np在5mm磷酸缓冲液中反应12h，然后14000rpm离心20分钟分离纳米金探针，再用5mm磷酸缓冲液进行冲洗两遍，最后溶解在10mm的磷酸缓冲液中，保存使用。为了验证纳米金探针是否制备成功，分析纳米金颗粒、pna以及纳米金探针的zeta扫描电位。结果显示(图2)纳米金和pna寡链的电位分别是-35.1mv和-7.32mv，连接之后，纳米金探针的电位变成-15.2mv，证明连接成功，能够用于试纸条的制备。

5、pna与dna的结合验证

肽核酸pna能够与核酸发生碱基配对，并且与dna的结合力要强于dna与dna的结合力。为了验证传感器的pna探针与产物上的单链dna的结合效果，利用等温量热滴定法(itc)进行分析。利用试纸条的分析缓冲液(4×ssc,2％bsa，0.05％tween-20(ph7.0))作为itc的缓冲液，滴定采用70μmpna/dna探针，样品池采用15μmdna溶液，全程设置20针，每300s一针。结果显示(图3)pna与dna结合的亲和力常数kd＝5.599e^-5m，结合位点数n为1.212，dna与dna结合的亲和力常数kd＝3.845e^-4m，结合位点数n为1.096，证明pna与dna之间的结合效率更强。其中，e是数学常数，m表示摩尔浓度单位。

6、生物传感器性能测试

利用肽核酸制备基于pna的核酸层析试纸条(plfd)。该试纸条分为4部分：样品垫、结合垫、nc膜和吸附垫。样品垫和结合垫浸泡在缓冲液(0.25％tritonx-100，0.1m硼酸盐缓冲液，0.15mnacl，ph8.0)中，然后37℃烘干2h。将30μl的1mg/ml链霉亲和素溶液与30μl的100μmpna捕获探针进行混合，然后在室温下孵育1h，制备出链霉亲和素-生物素化的质控/检测捕获探针(ccp/tcp)。然后分别用ccp和tcp在nc膜上划c线和t线，37℃烘干12h。

利用上述制备的plfd核酸试纸条，对ublrpa扩增产物进行可视化分析，整合形成完整的功能核酸生物传感器，然后分析传感器的灵敏度。首先制备不同浓度的沙门氏菌：0-10⁶cfuml^-1，然后利用ublrpa扩增技术对基因组进行扩增，得到单双链复合产物，最后用plfd核酸试纸条进行结果分析。结果显示(图4a)随着菌体浓度的降低，t线上红色条带的颜色逐渐变浅，定量检测限为10cfuml^-1。随后将沙门氏菌继续稀释为8、6、4、2cfuml^-1，进行最低检测限分析，结果显示(图4b)低于4cfuml^-1时t线不再出现，证明该传感器的最低检测限为4cfuml^-1。读取试纸条上t线的吸光值，利用峰面积与菌体浓拟合定量曲线，结果显示(图4c)在10-10⁶cfuml^-1范围内具有良好的线性关系，峰面积＝2727.86lg鼠伤寒沙门氏菌浓度+20032.86(r²＝0.99046)。其中，鼠伤寒沙门氏菌浓度单位为cfu/ml。

配制rpa扩增反应体系的方法如下：

i)根据rpa反应试剂盒说明书，配制混合液：29.5μl复水反应液，10μm引物rpa-uf和rpa-ur各2.4μl，2.4μl模板dna，ddh2o补齐47.5μl；

ii)将上述混合液转移到含有冻干粉的冻存管中，完全溶解后添加280mm醋酸镁2.5μl。

rpa扩增反应的条件为：38℃反应20分钟。

7、牛奶中沙门氏菌的检测

为了进一步验证该传感器的适用性，设置了沙门氏菌的加标回收实验。在2.5ml牛奶中分别添加10、10³、10⁵cfuml^-1的沙门氏菌，混匀1min。然后利用该传感器技术对其中的沙门氏菌进行定量检测分析，结果显示(表3)回收率在94.7±6.9％至107.1±3.4％之间，证明该传感器能够用于现场检测。

表3人工污染牛奶中沙门氏菌回收率

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业大学

<120>基于核酸层析生物传感技术检测食源性致病菌的方法

<130>khp171113519.9

<160>3

<170>patentinversion3.3

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<212>dna

<213>人工序列

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