一种用于检测油菜茎基溃疡病菌的引物探针组合及检测方法与流程

本发明涉及农业和植物检疫
技术领域：
，具体涉及一种用于检测油菜茎基溃疡病菌的引物探针组合及检测方法。
背景技术：
：油菜茎基溃疡病是油菜上最严重的真菌病害之一，其致病菌为小球腔菌属的油菜茎基溃疡病菌(leptosphaeriamaculans)，该病菌致病力强，能引起油菜茎基部发生溃烂，严重时可导致油菜减产达30％-50％，甚至更高。油菜茎基溃疡病菌在澳大利亚、加拿大、美国、欧洲等油菜主产国有发现，而在中国未见报道，属于中国进境植物检疫性有害生物。近年来，在我国出入境检验检疫机构从进口澳大利亚、乌克兰和加拿大等国进境油菜籽中多次截获茎基溃疡病菌l.maculans。中国油菜产区气候与澳大利亚、美国、欧洲三大州相似，且中国目前的油菜主要栽培品种高度感病。此外，随着贸易全球化，病菌传入的风险加剧。为防止油菜茎基溃疡的传入，高效快速检测成为预防油菜茎基溃疡病传入中国的技术关键。目前，用于油基茎基溃疡病菌的检测方法主要有滤纸培养法、pcr方法和环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)检测方法。常规pcr必须经过变性、退火、延伸三个步骤，用时在90分钟左右。lamp扩增方法针对靶基因序列的6个不同区域设计4种特异性lamp引物，利用一种链置换活性的bstdna聚合酶在等温条件(63℃左右)孵育30-60min，完成扩增。重组酶介导等温扩增(rpa)技术被认为是可以取代pcr的核酸检测技术。rpa技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链dna结合蛋白(ssb)和链置换dna聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最适温度在37℃-42℃之间，无需变性，在常温下即可进行。这无疑能大大加快核酸扩增速度。rpa检测的灵敏度很高，能够将痕量的核酸(尤其是dna)模板扩增到可以检出的水平，从单个模板分子得到大约1012扩增产物。而且rpa还用不着复杂的样品处理，适用于无法提取核酸的实地检测。此外，由于不需要温控设备，rpa可以真正实现便携式的快速核酸检测。技术实现要素：本发明的目的是提供一种用于检测油菜茎基溃疡病菌的引物探针组合及检测方法。本发明提供了一种引物对，由引物f和引物r组成；所述引物f为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链dna分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的dna分子；所述引物r为如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列2所示的单链dna分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的dna分子。本发明还保护引物探针组合，由所述引物对和探针组成；所述探针如下所示：区段a-(dt-荧光基团)-四氢呋喃残基-(dt-猝灭基团)-区段b；在所述探针的3'端进行修饰；所述区段a如序列表的序列3所示；所述区段b如序列表的序列4所示。所述荧光基团为fam；所述淬灭基团为bhq1。所述“在所述探针的3'端进行修饰”为采用c3-spacer或磷酸盐或生物素-teg或胺进行修饰。所述引物对或所述引物探针组合的用途为如下(b1)-(b4)中的至少一种：(b1)鉴定或辅助鉴定待测菌株是否为油菜茎基溃疡病菌；(b2)检测待测样本中是否含有油菜茎基溃疡病菌；(b3)制备用于鉴定或辅助鉴定待测菌株是否为油菜茎基溃疡病菌的试剂盒；(b4)制备用于检测待测样本中是否含有油菜茎基溃疡病菌的试剂盒。本发明还保护所述引物对或所述引物探针组合的应用，为如下(b1)-(b4)中的至少一种：(b1)鉴定或辅助鉴定待测菌株是否为油菜茎基溃疡病菌；(b2)检测待测样本中是否含有油菜茎基溃疡病菌；(b3)制备用于鉴定或辅助鉴定待测菌株是否为油菜茎基溃疡病菌的试剂盒；(b4)制备用于检测待测样本中是否含有油菜茎基溃疡病菌的试剂盒。本发明还保护含有所述引物对的试剂盒甲，或，含有所述引物探针组合的试剂盒乙；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)：(c1)鉴定或辅助鉴定待测菌株是否为油菜茎基溃疡病菌；(c2)检测待测样本中是否含有油菜茎基溃疡病菌。本发明还保护所述试剂盒甲或所述试剂盒乙的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。本发明还保护鉴定待测菌株是否为油菜茎基溃疡病菌的方法，包括如下步骤：以待测菌株的总dna为模板，采用所述引物探针组合进行重组酶介导等温扩增，如果在6-20分钟之间有荧光信号升起、待测菌株为或候选为油菜茎基溃疡病菌，如果在6-20分钟之间均没有荧光信号升起、待测菌株为或候选为非油菜茎基溃疡病菌。本发明还保护检测待测样本中是否含有油菜茎基溃疡病菌的方法，包括如下步骤：以待测样本的总dna为模板，采用所述引物探针组合进行重组酶介导等温扩增，如果在6-20分钟之间有荧光信号升起、待测样本含有或疑似含有油菜茎基溃疡病菌，如果在6-20分钟之间均没有荧光信号升起、待测样本不含有或疑似不含有油菜茎基溃疡病菌。以上任一所述待测菌株具体可为油菜茎基溃疡病菌、油菜黑胫病菌、枝顶孢菌或苜蓿黄萎病菌。以上任一所述重组酶介导等温扩增的反应体系具体可为：再水化缓冲液29.5μl，引物f和引物r各2.1μl，探针p0.6μl，dna模板(0.05-20ng)，去离子水补至47.5μl，混匀后加至含有冻干酶粉的0.2mltwistampbasic反应管中，充分溶解，加入醋酸镁溶液(280mmol/l)2.5μl，再加入一粒磁珠。反应体系中，引物f、引物r、探针p均以工作液形式加至反应体系中，引物f、引物r和探针p在工作液中的浓度均为10μmol/l。反应体系中，所述再水化缓冲液、冻干酶粉和twistampbasic反应管菌来自于试剂盒。所述试剂盒为twistdx公司，货号为taex002kit的产品。以上任一所述重组酶介导等温扩增的操作方法具体可为：39℃反应30分钟。以上任一所述重组酶介导等温扩增具体可采用twistdxt8等温扩增仪(twistdx,英国)进行。所述磁珠具体可为twistdxt8等温扩增仪自带的磁珠。本发明提供了一种用于检测油菜茎基溃疡病菌的引物探针组合及检测方法，试验结果表明，采用本发明的引物探针及检测方法对来自加拿大等国的油菜茎基溃疡病菌进行检测，在10分钟内能得到阳性扩增，而油菜黑胫病菌等其他菌株没有明显的荧光信号增加。整个检测过程在1小时内，其快速、特异性和灵敏的特点可以满足进境油菜籽样品的快速初检以及病菌分离物的快速鉴定。附图说明图1为特异性实验结果。图2为灵敏度实验结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。试剂盒：twistdx公司，货号：taex002kit。实施例中的供试菌株信息如表1所示。表1供试菌株信息序号菌株编号获取途径1油菜茎基溃疡病菌cbs275.63真菌生物多样性中心(cbs)2油菜茎基溃疡病菌atcc200782atcc3油菜黑胫病菌9912-4意大利进口甘蓝种子中截获4油菜黑胫病菌9907-2意大利进口甘蓝种子中截获5油菜黑胫病菌ss-13中国检科院菌种保存中心6油菜黑胫病菌cbs303.51真菌生物多样性中心(cbs)7油菜黑胫病菌ss-13-2中国检科院菌种保存中心8枝顶孢菌9-7-4中国检科院菌种保存中心9油菜黑胫病菌cbs11951真菌生物多样性中心(cbs)10枝顶孢菌菌株6azs-5中国检科院菌种保存中心11苜蓿黄萎病菌分离vaa2m1中国检科院菌种保存中心实施例1、鉴定油菜茎基溃疡病菌的rpa引物探针根据检疫性油菜茎基溃疡病菌leptosphaeriamaculansits区序列，采用引物设计软件设计了多组理论可行的rpa引物(包括三个上游引物和三个下游引物)，如表2所示。表2rpa候选引物f15'-aagcactgccgcctcgatcagtggcggc-3'f25'-actgccgcctcgatcagtggcggcagtctac-3'f35'-cactgccgcctcgatcagtggcggcagtc-3'r15'-ttgcaagtggttttaggggatccaattggtg-3'r25'-aattgcaagtggttttaggggatccaattggtggg-3'r35'-caattgcaagtggttttaggggatccaattggtgggc-3'将表1中上游引物和引物组成不同组合(f1/r1、f1/r2、f1/r3、f2/r1、f3/r1、f3/r3)进行效果验证、灵敏度分析和特异性分析，其中f1/r1、f1/r2、f1/r3检测不满足特异性要求，不仅检测油基茎基溃疡病菌产生阳性结果，检测其它菌(如油菜黑胫病菌)也会产生阳性结果。其余引物中，f2/r1、f3/r1、f3/r3均满足特异性要求，但f2/r1检测效果和灵敏度最优。经过综合分析，筛选出一对用于鉴定油基茎基溃疡病菌的最佳rpa引物，如下所示：f(序列表的序列1)：5'-actgccgcctcgatcagtggcggcagtctac-3'；r(序列表的序列2)：5'-ttgcaagtggttttaggggatccaattggtg-3'。进一步设计了用于鉴定油基茎基溃疡病菌的exo探针，如下所示：p:actgccgcctcgatcagtggcggcagtctac(fam-dt)(thf)(bhq1-dt)gattctgcccatgt-c3spacerthf代表四氢呋喃残基，有时称为“dspacer”。实际应用中，exo探针的3'末端的c3-spacer，也可替换为磷酸盐、生物素-teg或胺等修饰基团。实施例2、rpa检测方法的建立1、提取待测菌株的总dna。2、以步骤1得到的总dna为模板，采用实施例1制备的引物f、引物r和探针p进行rpa反应；具体操作如下：反应体系：取再水化缓冲液(试剂盒自带)29.5μl，引物f和引物r各2.1μl，探针p0.6μl，dna模板(0.05-20ng)，去离子水补至47.5μl，混匀后加至含有冻干酶粉(试剂盒自带)的0.2mltwistampbasic反应管(试剂盒自带)中，充分溶解，加入醋酸镁溶液(280mmol/l)2.5μl。反应体系中，引物f、引物r、探针p均以工作液形式加至反应体系中，引物f、引物r和探针p在工作液中的浓度均为10μmol/l。向反应体系中加入一粒磁珠(twistdxt8等温扩增仪自带)，放置于twistdxt8等温扩增仪(twistdx,英国)中，39℃反应30分钟，记录扩增产物的荧光信号并进行如下判断：如果在6-20分钟之间，有荧光信号升起，则所述待测菌株为或候选为油菜茎基溃疡病菌；若在6-20分钟之间无荧光信号升起，则所述待测菌株为或候选为非油菜茎基溃疡病菌。实施例3、特异性分别采用实施例2建立的两种检测方法对表1所示的供试菌株和感染了油基茎基溃疡的油菜籽荚壳进行检测。结果如图1所示。图1中，1为表1中序号为1的油菜茎基溃疡病菌菌株，2为表1中序号为2的油菜茎基溃疡病菌菌株，3为感染了油基茎基溃疡的油菜籽荚壳采用实线表示，4-12依次为表1中序号为3-11的菌株。结果表明，只有油菜茎基溃疡病菌菌株和感染了油基茎基溃疡的油菜籽荚壳的dna样本检测时在6-20分钟之间有荧光信号升起，而其余菌株的dna样本检测时在6-20分钟之间均没有荧光信号升起。上述结果表明，本发明的方法具有较高的特异性。实施例4、灵敏度1、提取表1中序号为1的油菜茎基溃疡病菌菌株的总dna，得到dna浓度为2.16ng/μl的dna溶液；2、用水10倍梯度稀释步骤1得到的dna溶液，得到各稀释液；3、取步骤2到的各稀释液作为模板，分别采用实施例2建立的两种检测方法；由于采用的稀释液的稀释度不同，形成如下不同的反应体系：反应体系1中，菌株总dna初始含量为：2.16ng；反应体系2中，菌株总dna初始含量为：0.216ng；反应体系3中，菌株总dna初始含量为：0.0216ng；反应体系4中，菌株总dna初始含量为：0.00216ng。结果如图2所示。图2中，1-4依次对应反应体系1-4。结果表明，本发明建立的pra检测方法可成功检测到0.0216ng基因组dna模板。<110>中国检验检疫科学研究院<120>一种用于检测油菜茎基溃疡病菌的引物探针组合及检测方法<160>4<210>1<211>31<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1actgccgcctcgatcagtggcggcagtctac31<210>2<211>31<212>dna<213>人工序列<220><223><400>2ttgcaagtggttttaggggatccaattggtg31<210>3<211>31<212>dna<213>人工序列<220><223><400>3actgccgcctcgatcagtggcggcagtctac31<210>4<211>14<212>dna<213>人工序列<220><223><400>4gattctgcccatgt14当前第1页12