本发明属于药用真菌及生物工程应用领域，具体涉及一种灵芝固体菌种及其在灵芝液体深层发酵上的应用。
背景技术：
灵芝（ganodermalucidum）又称为仙草、瑞草、神芝、不老草，其属担子菌纲、伞菌目、多孔菌科、灵芝属真菌，生长于不同死亡或处于生长的阔叶树树干、树枝上，古人认为其具有起死回生之神效。灵芝在中国主要指包括赤芝、紫芝以及松杉灵芝等具有药用价值的芝类。灵芝在我国等东方国家已有2000多年的药用历史，可用于肝炎、高血压、高血脂和胃癌等多种疾病的治疗。灵芝性温、味甘、微苦，有益心气、生血、助心安神、益肺气、坚筋骨、利关节、安神补肝等多种功能。食用灵芝可延年益寿、增强体格。
灵芝含有丰富的活性成分，如多糖、三萜类、甾醇、核酸、蛋白质、生物碱、呋喃衍生物等，其中多糖和三萜是灵芝的主要功能活性成分。灵芝多糖具有抗癌、抗肿瘤、免疫调节、抗衰老、抗氧化等作用；灵芝三萜具有抗肿瘤、抗艾滋病毒、抗菌以及抗氧化活性。由于多糖及三萜具有多种生理活性，其大量高效生产已成为重要关注点。但迄今为止灵芝多糖及三萜（主要为灵芝酸）等灵芝活性成分的生产仍然主要依赖人工所栽培的子实体为原料，采用微波、超声辅助提取的方法获取，存在产率低、难以规模化生产以及不同批次子实体的活性成分组成及含量有较大差异等缺点，导致灵芝产品价格高以及产品难以标准化生产。
不同于传统栽培法，灵芝液体深层发酵具有生产周期短、过程易控制、生产成本低、占用空间小以及可工业化生产等优点，此外，已证实灵芝液体发酵产物如灵芝多糖和三萜具有与子实体相近的生物活性，因此，以灵芝多糖、三萜以及生物量为目标产物的液体深层发酵成为灵芝研究的热点。目前，灵芝液体深层发酵通常采用菌球型液体菌种作为发酵的种子，但灵芝菌丝生长慢，导致菌种制备周期长，且操作及培养过程中均易发生微生物污染，导致菌种制备失败，影响生产，且发酵工艺要求频繁制备液体菌种，过程繁琐。因此，有必要开发适合灵芝液体深层发酵的新型菌种及建立与其相适应的发酵工艺。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种灵芝固体菌种及其在灵芝液体深层发酵上的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种灵芝固体菌种，是将花生壳粉与麸皮粉或细米糠粉碎后按比例混合，以干重计，混合料中花生壳粉所占重量为80%、麸皮粉或细米糠所占重量为20%；然后调节混合料的含水量为60%，再将其装入菌种瓶或聚丙烯塑料菌袋中，用棉花塞封口，经121℃灭菌2h后冷却，于无菌条件下在其表面接入一块长2cm、宽1cm的灵芝斜面菌种，然后于25℃、相对湿度60-70%的条件下进行暗培养，待菌丝吃料完全后制得所述灵芝固体菌种，4℃下保藏。
所述灵芝固体菌种可直接用于灵芝的液体深层发酵，即在无菌条件下将所述灵芝固体菌种捣碎，接种于液体发酵培养基中进行摇瓶发酵或发酵罐发酵；所述液体发酵培养基中含30g/l葡萄糖、20g/l玉米粉、4g/l蛋白胨、1.0g/l磷酸二氢钾、0.5g/l硫酸镁。
其中，采用摇瓶发酵时，每100ml液体发酵培养基中接种0.25g灵芝固体菌种；其发酵条件为：28℃下静置1天，随后以160r/min的转速培养5天。
采用发酵罐发酵时，每1l液体发酵培养基中接种1.5g灵芝固体菌种；其发酵条件为：在28℃、通气量0.5vvm、转速120~160r/min、ph自然的条件下培养5~6天。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明固体菌种于4℃下保藏，可多次、长期（6个月内）使用，其发酵性能无明显下降；且其以花生壳废弃物等作为原料，对生产设备要求低，使菌种制备成本低，有利于工业化制备。
（2）与传统菌球型液体菌种相比，本发明固体菌种的无菌条件易控制及维持，可降低发酵污染率；且其占用空间小，易长期保藏和运输；
（3）本发明以粉末状培养料作为菌种的生长基质，使其于液体发酵培养基中接种后易分散，从而可显著增加发酵生长点，加快发酵速度，以使生物量以及胞外多糖等活性成分产量均显著提高。
具体实施方式
本发明提供了一种灵芝固体菌种及其在灵芝液体深层发酵上的应用方法，下面实施例进一步描述本发明的使用方法，但这些实施例仅是规范性的，并不对本发明的范围构成任何限制。此外，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换仍在本发明保护范围内。
所用液体发酵培养基中含30g/l葡萄糖、20g/l玉米粉、4g/l蛋白胨、1.0g/l磷酸二氢钾、0.5g/l硫酸镁
实施例1采用灵芝固体菌种的液体摇瓶发酵工艺
1）将花生壳粉与麸皮粉采用中药粉碎机粉碎，将两者按重量比8:2混合；
2）调节混合料的含水量为60%，然后取100g装入250ml三角瓶中，将培养料稍为压实（要留有一定空隙度，以利通气），用棉花塞封口；
3）将培养料于121℃灭菌2h；
4）待培养料冷却后，于无菌条件下在其表面接入一块长2cm、宽1cm的灵芝斜面菌种，然后于25℃、相对湿度60-70%的条件下进行暗培养，待菌丝吃料完全后制得灵芝固体菌种；
5）在无菌条件下将灵芝固体菌种用无菌药匙捣碎，取0.2g接种于装有80ml液体发酵培养基的250ml摇瓶中，于28℃下静置1天，随后以160r/min的转速培养5天。
发酵结束收集灵芝菌丝体，分析胞外多糖及生物量。结果显示，所得灵芝菌丝体的生物量达到15.2g/l，胞外多糖含量为1.12g/l；而采用传统灵芝液体菌种进行发酵，其生物量仅为9.1g/l，胞外多糖含量为0.76g/l，即本实施例较现有技术的生物量及胞外多糖含量分别提高了67%以及47.4%。
实施例2采用灵芝固体菌种的发酵罐液体深层发酵
1）将花生壳粉与细米糠采用中药粉碎机粉碎，将两者按重量比8:2混合；
2）调节混合料的含水量为60%，然后取300g装入1l三角瓶中，将培养料稍为压实（要留有一定空隙度，以利通气），用棉花塞封口；
3）将培养料于121℃灭菌2h；
4）待培养料冷却后，于无菌条件下在其表面接入一块长2cm、宽1cm的灵芝斜面菌种，然后于25℃、相对湿度60-70%的条件下进行暗培养，待菌丝吃料完全后制得灵芝固体菌种；
5）在无菌条件下将灵芝固体菌种用无菌药匙捣碎，取10.5g接种于装有7l液体发酵培养基中的10l发酵罐中，在28℃、罐压0.1mpa、通气量0.5vvm、转速160r/min、ph自然的条件下培养6天。
发酵结束收集灵芝菌丝体，分析胞外多糖及生物量。结果显示，所得灵芝菌丝体的生物量达到14.3g/l，胞外多糖含量为0.91g/l；而采用传统灵芝液体菌种进行发酵，其生物量为11.4g/l，胞外多糖含量为0.68g/l，即本实施例较现有技术的生物量及胞外多糖含量分别提高25.4%和33.8%。
实施例3采用长期保藏固体菌种的灵芝液体摇瓶发酵
1）将花生壳粉与麸皮粉采用中药粉碎机粉碎，将两者按重量比8:2混合；
2）调节混合料的含水量为60%，然后取100g装入250ml三角瓶中，将培养料稍为压实（要留有一定空隙度，以利通气），用棉花塞封口；
3）将培养料于121℃灭菌2h；
4）待培养料冷却后，于无菌条件下在其表面接入一块长2cm、宽1cm的灵芝斜面菌种，然后于25℃、相对湿度60-70%的条件下进行暗培养，待菌丝吃料完全后制得灵芝固体菌种，于4℃冷箱中保藏；
5）在无菌条件下用无菌药匙取保藏3个月的灵芝固体菌种0.2g，接种于装有80ml液体发酵培养基的250ml摇瓶中，于28℃下静置1天，随后以160r/min的转速培养5天。
发酵结束收集灵芝菌丝体，分析胞外多糖及生物量。结果显示，所得灵芝菌丝体的生物量达到14.6g/l，胞外多糖含量为1.04g/l；而采用传统灵芝液体菌种进行发酵，其生物量仅为9.3g/l，胞外多糖含量为0.80g/l，即本实施例较现有技术的生物量及胞外多糖含量分别提高了56.7%以及30%。
实施例4采用长期保藏灵芝固体菌种及其发酵罐液体深层发酵工艺
1）将花生壳粉与麸皮粉采用中药粉碎机粉碎，将两者按重量比8:2混合；
2）调节混合料的含水量为60%，然后取300g装入1l三角瓶中，将培养料稍为压实（要留有一定空隙度，以利通气），用棉花塞封口；
3）将培养料于121℃灭菌2h；
4）待培养料冷却后，于无菌条件下在其表面接入一块长2cm、宽1cm的灵芝斜面菌种，然后于25℃、相对湿度60-70%的条件下进行暗培养，待菌丝吃料完全后制得灵芝固体菌种，于4℃冷箱中保藏；
5）在无菌条件下用无菌玻棒将保藏4个月的灵芝固体菌种捣碎，取10.5g接种于装有7l液体发酵培养基的10l发酵罐中，在28℃、罐压0.1mpa、通气量0.5vvm、转速120r/min、ph自然的条件下培养5天。
发酵结束收集灵芝菌丝体，分析胞外多糖及生物量。结果显示，所得灵芝菌丝体的生物量达到14.8g/l，胞外多糖含量为0.82g/l；而采用传统灵芝液体菌种进行发酵，其生物量为11.7g/l，胞外多糖含量为0.75g/l，即本实施例较现有技术的生物量及胞外多糖含量分别提高了26.5%和9%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。