一种水稻叶绿体发育调控基因AHS1及其编码的蛋白质与应用的制作方法

本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及一种利用图位克隆技术克隆水稻ahs1(albinoinheatstress1)基因，以及利用转基因互补实验鉴定该基因的功能；同时还涉及利用该基因对水稻叶绿体发育过程及叶片颜色进行调控，用以改良农作物的光合作用效率，提高水稻增产潜力。

背景技术：

叶绿体是绿色植物叶肉细胞中特有的能够进行光合作用的细胞器，其主要分布于叶肉细胞和幼茎的皮层细胞中。在个体发育上，叶绿体来自于前质体，是由前质体发育成叶绿体。在叶绿体的发育过程中，其内的类囊体膜的形成与叶绿素的累积是两个相辅相成的过程。当与叶绿体发育相关的基因发生突变时，将会影响到叶绿体的正常发育，从而影响叶绿素的生物合成，导致叶绿素中的色素比例改变而产生叶色突变体。而叶色是影响水稻光合作用和产量的重要性状，在提高水稻产量和品种改良方面占有重要的地位。

水稻叶绿体是合成有机物质的重要场所，通过延缓叶片的衰老和延长光合器官的功能，可以增加干物质积累；尤其在水稻的生育后期，通过延长植株叶片的光合作用时间，积累更多的有机物质可以提高水稻增产的潜能。水稻中存在着一类重要的叶色突变体--常绿叶，其是一种功能型常绿突变体，其主要的表型特征为生长后期叶片衰老延缓、叶绿素含量和光合能力保持不变。因此，叶色基因的有效利用，不仅可以提高水稻的生产能力，也为今后的超级稻育种提供了新的途径和方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种能影响水稻叶绿体发育及叶片颜色的蛋白质、其基因及应用。

为实现上述目的，本发明提供了一种水稻叶绿体发育调控基因ahs1编码的蛋白质，所述蛋白质具有(a)或(b)所示的序列：(a)seqidno：2或图8所示的氨基酸序列；(b)在(a)所限定的氨基酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或多个氨基酸且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白质。

本发明还提供了一种编码上述蛋白质的基因，该基因具有(a)或(b)所示的序列：(a)seqidno：1或图7所示的基因组核苷酸序列；(b)在(a)所示的核苷酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或多个核苷酸而生成的可编码具有水稻叶绿体发育调控功能的蛋白质的突变基因、等位基因或衍生物。

本发明还提供了一种包含上述基因的植物表达载体。该植物表达载体为优选pcambia1300表达载体。

本发明还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述基因序列。该宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。

本发明还提供了一种改良水稻叶色的方法，将上述基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。

本发明还提供了上述蛋白质、基因、植物表达载体、宿主细胞在调控植物叶绿体发育中的应用。所述植物优选为禾本科植物，尤其为水稻。

进一步具体说明：本发明的目的是提供一种从水稻突变体albinoinheatstress1中克隆的新基因ahs1，如图7和seqidno：1所示的dna序列，也包括与seqidno：1所示的dna序列至少有70％同源性的基因序列；还包括在seqidno：1中添加和/或取代和/或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变基因、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能达到本发明的目的。本发明中的seqidno：2和图8所示的蛋白质属于三角状五肽包含蛋白，其中进行一个或多个替换，插入或缺失所获得的功能类似物也能达到本发明的目的。

本发明的另一个目的是提供一种用ahs1基因进行高效的植物转化的方法，具体地说，本发明提供了具有seqidno：1和图7所示序列的基因或基因部分片段的载体，其中，如图4所示的pcambia1300-ahs1,该载体可以表达有上述核苷酸序列编码的多肽或其同源类似物。

本发明还提供了一种利用植物表达载体转化植物细胞影响水稻叶片颜色的方法。具体地是利用植物表达载体转化植物细胞以影响水稻叶绿体发育的方法。

实现本发明的具体技术步骤如下：

(1)突变体ahs1的分离和遗传分析：

本发明的水稻苗期白化突变体ahs1来自粳稻品种日本晴(oryzasatival.cvnipponbare)ems(ethylmethylsulfonate)诱变产生的突变。通过与野生型的正反交实验，证明该突变体受隐性单基因控制，如图1所示。

(2)突变体ahs1与野生型叶肉细胞叶绿体及颖壳薄壁细胞叶绿体结构比较：

与野生型相比，突变体ahs1叶肉细胞叶绿体中类囊体结构不明显或数目明显下降(如图1b，1c所示)；与野生型相比，突变体ahs1颖壳薄壁细胞中无成熟或完整的叶绿体结构(如图2b，2c所示)。

(3)图位克隆ahs1基因：

1)ahs1的初定位：

为了分离ahs1基因，本发明首先构建了一个定位群体，由突变体ahs1与籼稻品种台中本地1号杂交组配成f2定位群体。再通过图位克隆的方法，利用sts、ssr等分子标记将ahs1位点初步定位在第5染色体介于5-11和a5-9标记之间的区域内(图3)。

2)ahs1的精细定位：

发展新的sts标记将ahs1精确定位于bacoj1268_b08上、k5-13和k5-27标记之间22kb范围内(图3)，通过分析此区段开放阅读框(orf)推测候选基因。

3)ahs1基因的鉴定和功能分析：

通过转基因技术，结果表明本发明获得了使突变体恢复正常表型的转基因水稻(图5，图6)，证明了本发明正确克隆了ahs1基因。

综上所述，本发明利用水稻苗期白化ahs1突变体，通过图位克隆技术首次在水稻中克隆到了ahs1基因，该基因编码一个三角状五肽包含蛋白，调控水稻叶片和颖壳中叶绿体早期发育，从而影响叶片颜色和颖壳颜色。通过对ahs1基因的功能分析，进一步明确了植物特别是禾本科植物叶绿体发育及叶片颜色形成的遗传机制，为改良农作物的光合作用效率，提高水稻增产潜力奠定了基础。

附图说明

图1是水稻叶绿体发育缺陷材料ahs1与野生型材料的苗期表型图(a)及叶片叶绿体显微结构图(b和c)。

图2是水稻叶绿体发育缺陷材料ahs1与野生型材料穗部表型图(a)及颖壳叶绿体显微结构图(b和c)。

图3是ahs1基因的精细定位与克隆图。

图4是pcambia1302-ahs1载体图谱。

图5是转基因互补t1代水稻植株和ahs1突变体植株表型图。左，ahs1突变体幼苗；右，转基因互补t1代幼苗。

图6是转基因互补t1代水稻植株和ahs1突变体穗部表型图。左，ahs1突变体穗部；右，转基因互补t1代穗部。

图7是ahs1基因的dna核苷酸序列图。

图8是ahs1基因编码的氨基酸序列图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应该理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。若未特别指明，实施例中所用的生化试剂、载体、耗材等均为市售购买产品。

实施例1.水稻叶绿体发育调控基因ahs1的克隆

(1)水稻材料：

水稻突变体ahs1(albinoinheatstress1)，其原始野生材料为粳稻品种日本晴(oryzasatival.cvnipponbare)。如图1所示，突变体ahs1苗期表现白化(图1a)；与野生型相比，ahs1叶绿体发育异常(图1b，1c)。在抽穗期，突变体ahs1颖壳表现出白化表型，突变体ahs1颖壳中无完整的叶绿体可见(图2b，2c)。

(2)分析和定位群体：

纯合的ahs1突变体和野生型籼稻品种台中本地1号进行杂交，f1代自交，得到f2群体，并从中选出2104株ahs1表型个体作为定位群体。在苗期每株取1克左右的嫩叶，用来提取植物总dna。

(3)ahs1基因的定位：

利用从定位群体中选取的ahs1表型个体，组成的小群体进行ssr分析，根据公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱，选取近似均匀分布于各条染色体上的ssr引物进行pcr扩增，采用如下扩增程序：94℃预变性4分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；最后72℃再延伸10分钟。pcr产物经5％琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙啶染色，检测pcr产物的多态性，将ahs1初步定位在第5号染色体短臂5-11和a5-9标记之间。在初定位的基础上继续设计ssr和sts标记，最终将ahs1精确定位于bac号为oj1268_b08区段上共22kb的范围之内，两边的分子标记为k5-13和k5-27(图3)，并与k5-29共分离。引物序列如下：

5-11f：gctctcctgtgggttttcagr：catggtgctcctactggttg

a5-9f：acttacatctgaggtgcatar：gcattgcagattacagatac

k5-13f：tcgtcgcacgcgagattttr：acaccgaactggggctgt

k5-27f：gcgtctcacctagcactatr：cgtcgctctatttatcacag

k5-29f：cgattttgatgaaccagatr：tgctctctcagactaaatg

(4)基因预测和测序分析：

根据精细定位的结果，在22kb范围内根据riceautomatedannotationsystem(http://ricegaas.dna.affrc.go.jp)的预测，发现在此区间内共有4个候选基因，根据两标记剩余的重组个体数及共分离标记，我们设计了各基因的测序引物，采用pcr方法分别从ahs1和野生型品种日本晴基因组中扩增出各个候选基因进行测序分析。发现其中1个候选基因的1个dna片段中，突变体ahs1扩增的产物与野生型品种日本晴比较有1个碱基替换。将上述测序过程重复验证两次，均得出相同的结果。因此，将该候选基因命名为ahs1。根据bac克隆oj1268_b08序列的基因注释信息，预测该候选基因编码一个三角状五肽包含蛋白。

实施例2.pcambia1300-ahs1植物表达载体构建

根据ncbi中提供的水稻品种日本晴(oryzasativalcv.nipponbare)全基因组序列，设计扩增ahs1候选基因全长序列的特异性扩增引物，并根据选用的pcambia1300表达载体及ahs1候选基因序列的特征，在特异性引物两端添加特异性酶切位点(图4)。具体设计的引物为：正向引物(p1f)5’端添加ecori酶切位点(gaattc)，反向引物(p1r)5’端添加sse83871酶切位点(cctgcagg)，引物序列如下：

p1f正向引物：5’-cggaattcactccgatttccgtctctt-3’

p1r反向引物：5’-tgcctgcagggcagaaacgataagcacata-3’

然后提取水稻品种日本晴基因组dna，并以日本晴基因组dna为模板，利用上面设计的引物(p1f和p1r)扩增ahs1候选基因全长序列共计4934bp：包括ahs1基因组dna全长及其上下游序列。采用如下扩增程序：94℃预变性4分钟；98℃变性30秒，55℃退火30秒，68℃延伸5分钟，35个循环；最后72℃再延伸10分钟。回收pcr扩增的目的片段，将其连接zeroblunttopo载体到(invitrogen)，转化大肠杆菌dh5a感受态细胞，然后经过菌落pcr鉴定筛选阳性克隆，并将阳性克隆送invitrogen公司测序。将经过测序鉴定的阳性克隆进行质粒提取，提取的质粒用ecori和sse83871双酶切，并回收ahs1互补片段。同时利用ecori和sse83871对pcambia1300进行双酶切线性化，并回收pcambia1300骨架，将酶切后回收的ahs1互补片段与酶切后回收的pcambia1300骨架用t4连接酶(购于neb公司)进行连接，得到ahs1互补表达载体pcambia1300-ahs1(图4)，采用电击转化法将pcambia1300-ahs1表达载体转入根瘤农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)eha105中。

实施例3.将pcambia1300-ahs1植物表达载体转化水稻

采用农杆菌介导的水稻成熟胚愈伤浸染转化方法，将重组表达载体pcambia1300-ahs1转入水稻成熟胚中，转化方法如下：(1)水稻成熟胚愈伤组织的诱导：将成熟的日本晴种子去壳，然后用75％酒精表面消毒2min,然后用30％naclo溶液浸泡30min,并重复一次，然后用灭菌水清洗4-5次。然后将种子置于诱导培养基上培养，26度避光培养诱导愈伤组织用于转化。(2)水稻愈伤组织与农杆菌的共培养：将实施例2中鉴定含有pcambia1300-ahs1表达载体的eha105菌株进行活化、富集、重悬，调整od600＝0.4-0.6。将愈伤组织收集于50ml无菌离心管中，倒入重悬好的农杆菌悬浮液，浸染愈伤。浸泡15-30min后，倒掉悬浮液，将浸染过的愈伤置于无菌滤纸上吸干多余的农杆菌菌液。然后将愈伤置于铺有无菌滤纸的培养皿中，26度避光培养2-3天。(3)抗性愈伤的筛选：共培养完成后，将愈伤转移至含有50mg/ml的潮霉素的筛选培养基中，26-28度条件下抗性筛选。(4)抗性愈伤的分化：将筛选培养基中生长状态良好的愈伤置于分化培养基中，置于16小时光照/8小时黑暗、环境温度在26-28度之间的条件下，分化培养，直至分化长出小苗。(5)分化小苗的生根：待分化小苗月2cm左右时，将小苗转移到生根培养基中，进行生根培养。长出根系的小苗移栽于温室或转基因圃中进行生长。对植株进行鉴定和连续的观察发现，与同时期的突变体比较，转基因互补t1代植株苗期叶片颜色恢复到正常状态(图5)，转基因互补t1代植株穗部颖壳也恢复到绿色(图6)。

序列表

<110>中国水稻研究所

<120>一种水稻叶绿体发育调控基因ahs1及其编码的蛋白质与应用

<160>14

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2613

<212>dna

<213>稻属水稻(oryzasativa)

<400>1

atgccgccaccgccagctagaacccacccgaaccctcccctcctccacctcctcgcctcc60

caccgcgcgccgcagccgctcccgctcacgccggcgcacggccacctcccgccgcggaag120

cgtccccgcggagtcggctccgcagcggcgccgccgccgccgcgtgccgccgcctccgcg180

gaggccacctactctgaccggagcgccgcgctgcgggcgctctgtagccatggccagctg240

gcgcaggcgctctggctcctcgagtcctccccggagccgcccgacgagggcgcctacgtc300

gcgctgttccggctctgcgagtggcgccgcgcggtcgacgccgggatgcgggcgtgcgcg360

cgcgccgacgccgagcacccgagcttcgggctccgcctcgggaacgctatgctcagcatg420

ctcgtcaggttcggggagatatggcacgcgtggagggtgttcgccaaaatgcctgagagg480

gacgtcttctcctggaacgtcatggtaggcgggtacggcaaggtgggcttcctcgaggag540

gcgctggacctgtactacaggatgctgtgggcagggatgaggccggatgtctacacgttc600

ccctgcgtgctgcgtacctgcgggggcatccctgactggaggatggggagggaggtgcat660

gctcatgtgcttcgatttggttttggagacgaggtcgatgtattgaatgctctggtgacc720

atgtatgcaaaatgtggggatattgtggcggcgaggaaggtgtttgatggaatggccgtg780

acagactgcatatcatggaatgcgatgatagctgggcattttgagaatcatgagtgtgag840

gcagggttggagttgtttctcaccatgctggagaatgaggtacaaccgaatctcatgaca900

ataaccagtgtgactgttgcatctggaatgttgtctgaagtgggttttgcaaaagaaatg960

catgggtttgctgtaaagagaggtttcgccattgatgttgcattctgtaactcgttgatt1020

cagatgtacaccagtctcgggaggatgggggatgcaggtaaaatattctcaagaatggaa1080

actaaagatgccatgtcatggactgcaatgatatcggggtatgagaaaaatggtttccca1140

gataaagcccttgaagtttatgcactgatggaattgcataatgtaagtcctgatgatgtt1200

acaattgcaagtgcccttgctgcttgtgcctgcttggggaggttagatgtaggcatcaaa1260

ttgcatgagcttgctcagaacaagggattcatcaggtatgttgtcgttgctaatgcgctc1320

cttgaaatgtatgctaaatccaagcacattgataaggctattgaagtatttaagttcatg1380

gctgagaaggatgtggtatcatggagttcaatgattgctggattttgctttaaccacagg1440

agttttgaggctttgtactatttccggtatatgctaggacatgtaaaacccaattctgtt1500

acatttatagctgctctaagtgcttgtgctgctactggggctttgagatctggtaaggaa1560

atccatgcatatgttttaaggtgtggtattggatctgaaggttatgtacccaatgctctt1620

ctagacttgtatgtgaaatgtggccagacaagctatgcttgggcacaattcagcgtgcat1680

agtgaaaaggatgttgtctcttggaatataatgctttctggttttgtagctcatgggctt1740

ggagatattgctttatcactctttaaccaaatggtagaaatgggagagcatccggatgaa1800

gttacatttgttgctttattgtgtgcttgtagtagggctggaatggttattcaaggctgg1860

gagctttttcacatgatgactgagaaattttcaatagttccaaatctcaagcactatgca1920

tgtatggtagatctattgagtcgtgttgggaaattaacagaagcttacaacctcataaat1980

cgaatgcctatcaaacctgatgctgcagtgtggggagccttgttgaatggatgccggatc2040

caccgacatgttgaacttggcgagcttgctgcaaaagttatccttgagttggaacctaat2100

gatgttgcatatcatgttcttctgtgtgatttatatactgatgctggcaaatgggctcaa2160

gtggctagagtgagaaaaaccatgcgagagaagggattggagcaagataatggatgtagc2220

tgggttgaggttaagggagtaactcacgcatttcttacagatgatgaatcacatccacag2280

ataaaagaaataaatgttgttctacatggcatatatgagcgaatgaaagcatgtggtttt2340

gctcctgttgagtccttagaagataaagaagtatccgaggacgacatcttgtgcggtcac2400

agtgaaagattagctgtagcttttggtttgatcaatactacacctggtaccactatttct2460

gtcacaaagaaccgatacacttgccagagttgtcatgtgatattcaaggcaatttctgaa2520

attgttcgaagagagataactgttagagacactaagcaattacactgctttaaggatgga2580

gattgttcatgtggagatataggatatggatga2613

<210>2

<211>870

<212>prt

<213>稻属水稻(oryzasativa)

<400>2

metproproproproalaargthrhisproasnproproleuleuhis

151015

leuleualaserhisargalaproglnproleuproleuthrproala

202530

hisglyhisleuproproarglysargproargglyvalglyserala

354045

alaalaproproproproargalaalaalaseralaglualathrtyr

505560

seraspargseralaalaleuargalaleucysserhisglyglnleu

65707580

alaglnalaleutrpleuleugluserserprogluproproaspglu

859095

glyalatyrvalalaleupheargleucysglutrpargargalaval

100105110

aspalaglymetargalacysalaargalaaspalagluhisproser

115120125

pheglyleuargleuglyasnalametleusermetleuvalargphe

130135140

glygluiletrphisalatrpargvalphealalysmetprogluarg

145150155160

aspvalphesertrpasnvalmetvalglyglytyrglylysvalgly

165170175

pheleugluglualaleuaspleutyrtyrargmetleutrpalagly

180185190

metargproaspvaltyrthrpheprocysvalleuargthrcysgly

195200205

glyileproasptrpargmetglyarggluvalhisalahisvalleu

210215220

argpheglypheglyaspgluvalaspvalleuasnalaleuvalthr

225230235240

mettyralalyscysglyaspilevalalaalaarglysvalpheasp

245250255

glymetalavalthraspcysilesertrpasnalametilealagly

260265270

hisphegluasnhisglucysglualaglyleugluleupheleuthr

275280285

metleugluasngluvalglnproasnleumetthrilethrserval

290295300

thrvalalaserglymetleusergluvalglyphealalysglumet

305310315320

hisglyphealavallysargglyphealaileaspvalalaphecys

325330335

asnserleuileglnmettyrthrserleuglyargmetglyaspala

340345350

glylysilepheserargmetgluthrlysaspalametsertrpthr

355360365

alametileserglytyrglulysasnglypheproasplysalaleu

370375380

gluvaltyralaleumetgluleuhisasnvalserproaspaspval

385390395400

thrilealaseralaleualaalacysalacysleuglyargleuasp

405410415

valglyilelysleuhisgluleualaglnasnlysglypheilearg

420425430

tyrvalvalvalalaasnalaleuleuglumettyralalysserlys

435440445

hisileasplysalailegluvalphelysphemetalaglulysasp

450455460

valvalsertrpsersermetilealaglyphecyspheasnhisarg

465470475480

serpheglualaleutyrtyrpheargtyrmetleuglyhisvallys

485490495

proasnservalthrpheilealaalaleuseralacysalaalathr

500505510

glyalaleuargserglylysgluilehisalatyrvalleuargcys

515520525

glyileglysergluglytyrvalproasnalaleuleuaspleutyr

530535540

vallyscysglyglnthrsertyralatrpalaglnpheservalhis

545550555560

serglulysaspvalvalsertrpasnilemetleuserglypheval

565570575

alahisglyleuglyaspilealaleuserleupheasnglnmetval

580585590

glumetglygluhisproaspgluvalthrphevalalaleuleucys

595600605

alacysserargalaglymetvalileglnglytrpgluleuphehis

610615620

metmetthrglulyspheserilevalproasnleulyshistyrala

625630635640

cysmetvalaspleuleuserargvalglylysleuthrglualatyr

645650655

asnleuileasnargmetproilelysproaspalaalavaltrpgly

660665670

alaleuleuasnglycysargilehisarghisvalgluleuglyglu

675680685

leualaalalysvalileleugluleugluproasnaspvalalatyr

690695700

hisvalleuleucysaspleutyrthraspalaglylystrpalagln

705710715720

valalaargvalarglysthrmetargglulysglyleugluglnasp

725730735

asnglycyssertrpvalgluvallysglyvalthrhisalapheleu

740745750

thraspaspgluserhisproglnilelysgluileasnvalvalleu

755760765

hisglyiletyrgluargmetlysalacysglyphealaprovalglu

770775780

serleugluasplysgluvalsergluaspaspileleucysglyhis

785790795800

sergluargleualavalalapheglyleuileasnthrthrprogly

805810815

thrthrileservalthrlysasnargtyrthrcysglnsercyshis

820825830

valilephelysalailesergluilevalargarggluilethrval

835840845

argaspthrlysglnleuhiscysphelysaspglyaspcyssercys

850855860

glyaspileglytyrgly

865870

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(5-11f)

<400>3

gctctcctgtgggttttcag20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(5-11r)

<400>4

catggtgctcctactggttg20

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(a5-9f)

<400>5

acttacatctgaggtgcata20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(a5-9r)

<400>6

gcattgcagattacagatac20

<210>7

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(k5-13f)

<400>7

tcgtcgcacgcgagatttt19

<210>8

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(k5-13r)

<400>8

acaccgaactggggctgt18

<210>9

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(k5-27f)

<400>9

gcgtctcacctagcactat19

<210>10

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(k5-27r)

<400>10

cgtcgctctatttatcacag20

<210>11

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(k5-29f)

<400>11

cgattttgatgaaccagat19

<210>12

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(k5-29r)

<400>12

tgctctctcagactaaatg19

<210>13

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(p1f)

<400>13

cggaattcactccgatttccgtctctt27

<210>14

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(p1r)

<400>14

tgcctgcagggcagaaacgataagcacata30