Al18F标记的PSMA靶向抑制剂及其制备方法与应用与流程

本发明涉及核医学领域，具体地说，涉及一种al¹⁸f标记的psma靶向抑制剂及其制备方法与应用。

背景技术：

随着人口老龄化进程的加剧，前列腺癌的发病率已位列我国男性恶性肿瘤发病率的第六位，如何早期地对前列腺癌进行精确检测已成为临床上亟需解决的问题。核医学显像可以在分子和细胞水平无创、可视化、定性/定量监测并参与肿瘤发生、发展过程中的生理和病理过程，已成为临床上肿瘤检测的重要手段。正电子发射计算机断层显像(positronemissiontomography，pet)具有灵敏度和分辨率高的优点，在肿瘤的早期诊疗方面显现出明显的优势。随着pet/ct和pet/mri等融合影像技术的发展，核医学检查可以同时提供解剖学和功能学信息，对提高患者治愈率及生活质量具有重要的意义。

目前临床上使用最广泛的pet示踪剂为¹⁸f-fdg，但其是一种非特异性显像剂，在前列腺癌的诊断方面存在很多不足，因此亟需研发特异性示踪剂对前列腺癌进行显像，以最大限度发挥pet显像的优势。

psma(prostatespecificmembraneantigen，前列腺特异性膜抗原)作为特异性的靶点最初被7e-11所识别并定义，其在前列腺癌细胞中高度表达，在前列腺癌晚期psma呈高表达，在前列腺癌转移灶的细胞中也具有特异性的高度表达，且其表达程度与肿瘤分化程度、转移倾向及激素治疗敏感性等方面均显著性相关。因此靶向psma的特异性前列腺癌分子探针已成为研究的一大热点。目前北京肿瘤医院核医学科正在开展⁶⁸ga-dkfz-psma-617的临床研究工作，已对超过70例患者进行了⁶⁸ga-dkfz-psma-617显像。研究表明其能有有效地对前列腺癌原发及转移病灶进行探测。

尽管⁶⁸ga标记的psma在临床试验中已经取得了一定的成果，但是仍存在改进的空间，这主要是考虑到⁶⁸ga这种核素需要通过⁶⁸ge/⁶⁸ga发生器制备，产量有限，单次制备的⁶⁸ga-dkfz-psma-617最多可供2名患者使用。¹⁸f通过医用加速器制备，我国医用加速器的装机数量远高于⁶⁸ge/⁶⁸ga发生器的数目；加速器单次可生产¹⁸f的量>4000mci，¹⁸f的半衰期较长(109.7分钟)，因此制备的量可供超过10名患者使用，甚至实现局部地区的配送；更重要的是¹⁸f空间分辨率较⁶⁸ga更高。以上因素都表明有必要发展一种更有利于临床推广应用的¹⁸f标记的psma靶向抑制剂用于前列腺癌显像。事实上，美国fda已批准¹⁸f-dcfbc用于复发性前列腺癌的临床ⅱ期研究，¹⁸f-dcfpyl也已经进入临床ⅰ期研究。

al¹⁸f的标记方法是近年来发展起来的一种¹⁸f标记的新方法，具有很多优点，如标记时间更短，能从1-2小时缩短至30分钟以内；标记率更高；稳定性更好，不易出现脱氟现象。noda是一种有效的为双功能螯合剂，其空腔大小适中，恰好能与al¹⁸f螯合。本发明结合肿瘤分子探针的研究热点及¹⁸f标记的新进展，设计了含有noda的前列腺膜抗原抑制剂noda-psma，采用al¹⁸f标记以探求其作为前列腺癌显像剂的潜力，具有非常重要的科学研究和应用开发价值。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于结合前列腺特异性膜抗原(psma)的配体及其应用。

本发明的另一目的是提供一种新型的al¹⁸f标记的psma靶向抑制剂及其制备方法与应用。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种用于结合前列腺特异性膜抗原的新型配体，所述配体是基于前列腺特异性膜抗原的膜外段区域设计的，结构为：glu-urea-lys-gla(nal)-tran，其中，glu为谷氨酸，urea为尿素，lys为赖氨酸，gla(nal)为3-(2-萘基)-d-丙氨酸，tran为氨甲环酸。

本发明还提供一种用于结合前列腺特异性膜抗原的配体缀合物，其结构如下：glu-urea-lys-gla(nal)-tran-noda。其中，noda为双功能螯合剂，参见radiofluorinationusingaluminum-fluoride(al¹⁸f)[j],ejnmmiresearch,2013,3:36。

本发明还提供一种靶向psma的肿瘤显像剂或治疗药物，其含有上述配体缀合物。

本发明还提供所述配体缀合物在制备靶向psma的肿瘤显像剂或治疗药物中的应用。

本发明还提供一种al¹⁸f标记的psma靶向抑制剂，其为al¹⁸f标记的glu-urea-lys-gla(nal)-tran-noda。

本发明还提供所述al¹⁸f标记的psma靶向抑制剂在制备pet/ct分子诊断显像剂中的应用。

本发明al¹⁸f标记的psma靶向抑制剂可以按照如下步骤制备得到：

s1、树脂的溶胀

向1g2-氯三苯甲基氯树脂中加入15mldmf，溶胀30分钟；

s2、反应产物c的制备

①将dmf和dcm按等体积混合，作为溶剂将3e.q.fmoc-2-nal-oh(n-fmoc-3-(2-萘基)-d-丙氨酸)配制成15g/ml的溶液，加入到上述溶胀的树脂中，再加入10e.q.diea(n,n-二异丙基乙胺)，n2保护条件下反应30分钟，甲醇密封30分钟，得到反应液a；

②将反应液a过滤，收集滤渣，向15g滤渣中加入1ml20％的哌啶溶液，以脱去fmoc保护基，分别吹泄反应管底部5分钟和15分钟得到反应产物b；

③监测上述反应，方法如下：取十几粒树脂，用乙醇洗3次后依次加入0.10ml25％的茚三酮乙醇溶液，0.05ml20％的酚醛乙醇溶液和0.05ml吡啶，加热至105℃反应5分钟，变深蓝色为阳性反应；

④按照每克10ml的用量，将反应产物b依次用dcm(二氯甲烷)、meoh(甲醇)和dmf(n,n-二甲基甲酰胺)各洗涤两次；然后向反应产物b中加入3e.q.fmoc-tranexamicacid(fmoc保护的氨甲环酸)的乙醇溶液，3e.q.hbtu(四甲基脲六氟磷酸盐)和2mldiea，加入dmf溶解后，按照每克15ml的量加入dcm，反应30分钟，按照③的方法监测反应，得到反应产物c；按照每克10ml的用量，将反应产物c依次用dcm、meoh和dmf各洗涤两次；

s3、中间体1的制备①将反应产物c过滤，收集滤渣，向15g滤渣中加入1ml20％的哌啶溶液，以脱去fmoc保护基，分别吹泄反应管底部5分钟和15分钟，监测反应得到反应产物d；

按照每克10ml的用量，将反应产物d依次用dcm(二氯甲烷)、meoh(甲醇)和dmf(n,n-二甲基甲酰胺)各洗涤两次；然后向反应产物d中加入3e.q.noda-bis(tbu)ester的乙醇溶液，3e.q.hbtu(四甲基脲六氟磷酸盐)和2mldiea，加入dmf溶解后，按照每克15ml的量加入dcm，反应30分钟，监测反应，得到反应产物e；按照每克10ml的用量，将反应产物e依次用dcm、meoh和dmf各洗涤两次；

②反应结束后将反应产物e从树脂上解离，具体方法为：将负载有反应产物e的树脂溶于三氟乙醇和dcm按3:7体积比混合的溶液中，冰浴下反应120分钟，过滤，收集滤液，旋转蒸发除去溶剂得到中间体1；

s4、中间体2的制备

向50ml1.2e.q.cdi(n,n′-羰基二咪唑)的thf溶液中滴加1e.q.h2n-glu(pmb)-opmb的thf溶液，温度控制在20℃以下，搅拌过夜，反应结束后旋转蒸发除去溶剂；收集残渣，向残渣中加入丙酮和水按5:1体积比混合的溶液中，搅拌30分钟，过滤，干燥滤渣得到中间体2；

s5、中间体3的制备

向1e.q.中间体2的thf溶液中滴加1e.q.h2n-lys(boc)-opmb的thf溶液，混合液在65℃下回流过夜，反应结束后除去溶剂，残渣用乙酸乙酯稀释并分别用水、10％柠檬酸溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥有机相30分钟后，过滤，浓缩得到中间体3；

s6、中间体4的制备

向中间体3的乙醇和乙酸乙酯溶液中加入2e.q.tsoh(对甲苯磺酸)，温度控制在5℃以下，搅拌2小时；反应结束后加入乙酸乙酯稀释，分别用饱和nahco3溶液、10％柠檬酸溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥有机相30分钟，过滤，浓缩得到中间体4；

s7、glu-urea-lys-gla(nal)-tran-noda的制备

向1.0e.q.中间体1、0.2e.q.dmap(4-二甲氨基吡啶)和1.0e.q.中间体4的dcm溶液中加入dcc(二环己基碳二亚胺)的dcm溶液，温度控制在5℃以下，混合液搅拌30分钟后，在室温条件下搅拌过夜，反应结束后，除去溶剂得到中间体5；将中间体5溶于tfa(三氟乙酸)、edt、tis和水的混合液(tfa:edt:tis:h2o＝95:2:2:1)中，搅拌2小时；n2吹干溶剂后用乙醚洗涤5次，干燥得到粗产物；粗产物用hplc纯化，纯化后冷冻干燥，即得glu-urea-lys-gla(nal)-tran-noda。

粗产物用hplc纯化，采用kromasil100-5c18柱，20mm×250mm，10micron，uv＝220nm，流速＝15ml/min，流动相：a：h2o(0.1％tfa)，b：乙腈(0.1％tfa)，b20％-34％(0-40min)，tr＝25.180min。纯化后冷冻干燥得到白色粉末。ms：[m+h]⁺(m/z＝941.8)。

s8、al¹⁸f标记的psma靶向抑制剂的制备(即al¹⁸f标记的glu-urea-lys-gla(nal)-tran-noda)的制备

以0.1mm,ph4.0的醋酸缓冲液为溶剂，配制2mmalcl3溶液；取0.1mm,ph4.0的醋酸缓冲液0.1ml，alcl3溶液6μl，加入50-120mbq¹⁸f^-(0.1ml)室温放置5分钟，再加入5μlglu-urea-lys-gla(nal)-tran-noda溶液，110℃下反应10分钟，得到目标化合物，即al¹⁸f标记的psma靶向抑制剂；其中，glu-urea-lys-gla(nal)-tran-noda溶液的浓度为4mmol/ml，以0.1m,ph4.0的naac缓冲液为溶剂；

s9、用sep-pakc18columnlight分离纯化所述目标化合物，使目标化合物的放射性化学纯度大于99％。

步骤s9中，使用前sep-pakc18columnlight需用无水乙醇和高纯水活化，并用生理盐水洗脱放射性杂质，最后用乙醇洗脱出目标化合物，即al¹⁸f标记的glu-urea-lys-gla(nal)-tran-noda(al¹⁸f-noda-psma)。

al¹⁸f-noda-psma的体外稳定性分析结果显示，其在0.9％nacl溶液中放置2小时后仍能保持良好的稳定性，radio-hplc检测其放化纯度保持在95％以上。在2％人血清白蛋白溶液中放置1小时后仍能保持良好的稳定性，radio-hplc检测其放化纯度保持在95％以上。

脂水分配系数实验结果显示logp＝-2.87±0.01，表明al¹⁸f-noda-psma是一种亲水性物质。

al¹⁸f-noda-psma在正常kunming雌性小鼠体内的生物分布实验结果表明，其在肾脏中迅速富集并主要通过尿路排泄，在非靶组织和器官中摄取低且代谢快。

本发明提供的新型核素标记的前列腺特异性膜抗原靶向抑制剂，性质稳定，显像效果好，对psma有高的亲和力和功能活性，有利于早期前列腺癌的诊断与准确分期，经进一步临床前动物实验研究证实，其有望成为具有良好应用前景的前列腺癌显像剂。

附图说明

图1为本发明实施例2中al¹⁸f-noda-psma的hplc图。

图2为本发明实施例3中al¹⁸f-noda-psma在生理盐水中室温放置2小时后的hplc图。

图3为本发明实施例3中al¹⁸f-noda-psma在has溶液中37℃孵育1小时后的hplc图。

图4为本发明实施例5中lncap模型鼠注射al¹⁸f-noda-psma后90min的micro-pet显像图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1noda-psma(即glu-urea-lys-gla(nal)-tran-noda)的制备

s1、树脂的溶胀

向1g2-氯三苯甲基氯树脂中加入15mldmf，溶胀30分钟。

s2、反应产物c的制备

①将dmf和dcm按等体积混合，作为溶剂将3e.q.fmoc-2-nal-oh(n-fmoc-3-(2-萘基)-d-丙氨酸)配制成15g/ml的溶液，加入到上述溶胀的树脂中，再加入10e.q.diea(n,n-二异丙基乙胺)，n2保护条件下反应30分钟，甲醇密封30分钟，得到反应液a；

②将反应液a过滤，收集滤渣，向15g滤渣中加入1ml20％的哌啶溶液，以脱去fmoc保护基，分别吹泄反应管底部5分钟和15分钟得到反应产物b；

③监测上述反应，方法如下：取十几粒树脂，用乙醇洗3次后依次加入0.10ml25％的茚三酮乙醇溶液，0.05ml20％的酚醛乙醇溶液和0.05ml吡啶，加热至105℃反应5分钟，变深蓝色为阳性反应；

④按照每克10ml的用量，将反应产物b依次用dcm(二氯甲烷)、meoh(甲醇)和dmf(n,n-二甲基甲酰胺)各洗涤两次；然后向反应产物b中加入3e.q.fmoc-tranexamicacid(fmoc保护的氨甲环酸)的乙醇溶液，3e.q.hbtu(四甲基脲六氟磷酸盐)和2mldiea，加入dmf溶解后，按照每克15ml的量加入dcm，反应30分钟，按照③的方法监测反应，得到反应产物c；按照每克10ml的用量，将反应产物c依次用dcm、meoh和dmf各洗涤两次。

s3、中间体1的制备

①将反应产物c过滤，收集滤渣，向15g滤渣中加入1ml20％的哌啶溶液，以脱去fmoc保护基，分别吹泄反应管5分钟和15分钟，监测反应得到反应产物d；

按照每克10ml的用量，将反应产物d依次用dcm(二氯甲烷)、meoh(甲醇)和dmf(n,n-二甲基甲酰胺)各洗涤两次；然后向反应产物d中加入3e.q.noda-bis(tbu)ester的乙醇溶液，3e.q.hbtu(四甲基脲六氟磷酸盐)和2mldiea，加入dmf溶解后，按照每克15ml的量加入dcm，反应30分钟，监测反应，得到反应产物e；按照每克10ml的用量，将反应产物e依次用dcm、meoh和dmf各洗涤两次；

②反应结束后将反应产物e从树脂上解离，具体方法为：将负载有反应产物e的树脂溶于三氟乙醇和dcm按3:7体积比混合的溶液中，冰浴下反应120分钟，过滤，收集滤液，旋转蒸发除去溶剂得到中间体1。

s4、中间体2的制备

向50ml1.2e.q.cdi(n,n′-羰基二咪唑)的thf溶液中滴加1e.q.h2n-glu(pmb)-opmb的thf溶液，温度控制在20℃以下，搅拌过夜，反应结束后旋转蒸发除去溶剂；收集残渣，向残渣中加入丙酮和水按5:1体积比混合的溶液中，搅拌30分钟，过滤，干燥滤渣得到中间体2。

s5、中间体3的制备

向1e.q.中间体2的thf溶液中滴加1e.q.h2n-lys(boc)-opmb的thf溶液，混合液在65℃下回流过夜，反应结束后除去溶剂，残渣用乙酸乙酯稀释并分别用水、10％柠檬酸溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥有机相30分钟后，过滤，浓缩得到中间体3。

s6、中间体4的制备

向中间体3的乙醇和乙酸乙酯溶液中加入2e.q.tsoh(对甲苯磺酸)，温度控制在5℃以下，搅拌2小时；反应结束后加入乙酸乙酯稀释，分别用饱和nahco3溶液、10％柠檬酸溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥有机相30分钟，过滤，浓缩得到中间体4。

s7、glu-urea-lys-gla(nal)-tran-noda的制备

向1.0e.q.中间体1、0.2e.q.dmap(4-二甲氨基吡啶)和1.0e.q.中间体4的dcm溶液中加入dcc(二环己基碳二亚胺)的dcm溶液，温度控制在5℃以下，混合液搅拌30分钟后，在室温条件下搅拌过夜，反应结束后，除去溶剂得到中间体5；将中间体5溶于tfa(三氟乙酸)、edt、tis和水的混合液(tfa:edt:tis:h2o＝95:2:2:1)中，搅拌2小时；n2吹干溶剂后用乙醚洗涤5次，干燥得到粗产物；粗产物用hplc纯化，纯化后冷冻干燥，即得glu-urea-lys-gla(nal)-tran-noda。

粗产物用hplc纯化，采用kromasil100-5c18柱，20mm×250mm，10micron，uv＝220nm，流速＝15ml/min，流动相：a：h2o(0.1％tfa)，b：乙腈(0.1％tfa)，b:20％-34％(0-40min)，tr＝25.180min。纯化后冷冻干燥得到白色粉末。ms：[m+h]⁺(m/z＝941.8)。

实施例2al¹⁸f标记的psma靶向抑制剂(即al¹⁸f-noda-psma)的制备

以0.1mm,ph4.0的醋酸缓冲液为溶剂，配制2mmalcl3溶液；取0.1mm,ph4.0的醋酸缓冲液0.1ml，alcl3溶液6μl，加入50-120mbq¹⁸f-(0.1ml)室温放置5分钟，再加入5μlglu-urea-lys-gla(nal)-tran-noda溶液，110℃下反应10分钟，得到目标化合物。用sep-pakc18columnlight分离纯化所述目标化合物，使目标化合物的放射性化学纯度大于99％。使用前sep-pak柱需用10ml无水乙醇和10ml高纯水活化，并用3ml生理盐水洗脱出放射性杂质，然后再用0.5ml乙醇洗脱出目标化合物al¹⁸f-noda-psma，95℃条件下n2吹干待用。

用radio-hplc测定标记率及放射化学纯度。分析条件：ymc-packods-acolumn，1.0ml/min；0.1％tfawater(a)，0.1％tfaacetontrile(b)；0-10min(b)：15％-60％。图1结果显示经sep-pakc18light柱纯化后al¹⁸f-noda-psma放射化学纯度大于99％。

实施例3al¹⁸f-noda-psma标记化合物的体外稳定性分析

取20μl(1.3mbq)分离样品al¹⁸f-noda-psma加入到1ml生理盐水中，室温孵育5分钟、30分钟、1小时和2小时后取出适量溶液进行radio-hplc检测。结果表明al¹⁸f-noda-psma在室温中放置2小时后仍具有较高的放射化学纯度，孵育2小时后的hplc检测结果见图2。

取20μl(1.3mbq)分离样品al¹⁸f-noda-psma加入到1ml2％的人血清白蛋白(has)溶液中，于37℃孵育5分钟、30分钟和1小时后取出适量溶液进行radio-hplc检测。结果表明，al¹⁸f-noda-psma在hsa中37℃条件下孵育1小时后仍具有较高的放射化学纯度，孵育1小时后的hplc结果见图3。

实施例4al¹⁸f-noda-psma在正常小鼠体内的生物分布实验

取12只正常的kunming雌性小鼠，分别通过尾静脉注射0.2mlal¹⁸f-noda-psma(18.5mbq)，分别于注射后50分钟、30分钟、60分钟和120分钟后断颈处死，取其心、肝、肺、肾、脾、胃、肌肉、骨、血、大肠、小肠等有关组织和器官，擦净后称重，并用γ-counter测其放射性计数，每个时相3只小鼠。计算各组织的每克百分注射剂量(％id/g)，结果见表1。

表1al¹⁸f-noda-psma在正常小鼠体内的生物分布(id％/g,x±sd,n＝3)

结果表明，al¹⁸f-noda-psma在血液中快速清除，迅速经肾脏通过尿路代谢出体内，在其他非靶器官如肝、肺、骨、肠等中的摄取较低且代谢快，具有良好的代谢性质。

实施例5al¹⁸f-noda-psma在肿瘤小鼠体内的micro-pet显像实验

取右上肢腋下种植人psma高表达的lncap细胞的scid裸鼠(十周龄)，肿瘤直径约1.0cm，通过尾静脉注射0.2mlal¹⁸f-noda-psma标记化合物(约18.5mbq)，于注射后90分钟进行micro-pet显像。显像前将裸鼠在summitas-1-000-7小动物麻醉系统中用混有3％(体积分数)异氟烷的氧气麻醉，显像过程中维持含1％(体积分数)异氟烷的氧气麻醉，显像时间为25分钟。结果见图4。

可见，在lncap模型鼠中，肿瘤部位有明显的放射性浓集，而且除肾脏和膀胱外，其他器官并没有明显的药物摄取。其在体内的代谢情况与在正常小鼠体内的生物分布结果一致。

本发明提供的新型前列腺特异性膜抗原靶向抑制剂，为正电子核素¹⁸f标记的放射性示踪剂al¹⁸f-noda-psma，可将其作为前列腺癌pet分子探针，稳定性好，显像效果好，有利于早期前列腺癌的诊断与准确分期，并可以为前列腺癌的复发、局部及远处转移进行诊断。经进一步临床前动物水平研究证实，其有望应用于临床，成为理想的前列腺癌pet分子探针。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。