一种三萜类成分和制备方法以及在缺血性心脏病治疗的应用与流程

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种三萜类成分和制备方法以及在缺血性心脏病治疗的应用。

背景技术：

随着我国人口老龄化速度与工作节奏加快，冠心病、心绞痛、急性心肌梗死及心律失常等缺血性心脏病已成为严重危害老年人群与亚健康工作人群的一类高发病。在这些缺血性心脏病发展过程中多伴有心肌细胞损伤，进而发生细胞凋亡、钙超载等，引起心血管功能紊乱。本发明前期从阔叶黄檀(dalbergialatifolia)中首次分离得到三萜类化学成分3-o-α-l-吡喃阿拉伯糖基-28-o-β-d-吡喃葡萄糖基坡摸酸酯的基础上，证明其可通过减少自由基对细胞损伤从而保护心肌，达到治疗缺血性心脏病的目的。然而，到目前为止，该植物三萜类化学成分研究，仅有β-谷甾醇和乙酰齐墩果酸两个成分报道，加之，该类成分在抗缺血性心脏病相关药理学研究方面尚未见报道。本发明可为今后开发抗缺血性心脏病药物及阔叶黄檀植物资源的综合利用提供依据。

技术实现要素：

针对上述技术现状和存在问题，本发明的目的是提供一种三萜类成分和制备方法以及在缺血性心脏病治疗的应用以及在缺血性心脏病治疗的应用，为阔叶黄檀植物资源高效利用与该成分抗缺血性心脏病的应用提供支持。

为达到上述发明目的，本发明的技术方案是：

一种三萜类成分，其特征是，其成分为：3-o-α-l-吡喃阿拉伯糖基-28-o-β-d-吡喃葡萄糖基坡摸酸酯；其化学式为：

上述的三萜类成分的制备方法，其特征是，其制备方法及步骤为：

(1)取阔叶黄檀心材，粉碎，用50％～70％乙醇加热回流提取1～5次，每次1～5h，合并提取液，回收溶剂，浓缩至无醇味，得浸膏；

(2)加适量水于浸膏中分散，得到混悬液，用石油醚萃取，回收溶剂，分别得到石油醚萃取部位；

(3)石油醚萃取部位经硅胶柱色谱，用石油醚–乙酸乙酯梯度洗脱，得到12个流分，即frs.1-12；

(4)fr.9经凝胶柱色谱，二氯甲烷-甲醇洗脱，得到5个流分，即fr.9.a-e；

(5)将fr.9.b流分经凝胶柱色谱纯化得到化合物:3-o-α-l-吡喃阿拉伯糖基-28-o-β-d-吡喃葡萄糖基坡摸酸酯。

其核磁数据如下：

化合物黄色粉末，esi-msm/z:734.20[m+h]+。¹h-nmr(600mhz，cdcl3)δ3.13(1h，dd，j＝11.5，4.1hz，h-3)，1.98(2h，m，h-11)，5.30(1h，t，j＝5.9hz，h-12)，2.58(1h，dd，j＝13.3，9.3hz，h-16a)，0.97(3h，s，h-23)，0.77(3h，s，h-24)，1.03(3h，s，h-25)，0.83(3hs，h-26)，1.31(3h，s，h-27)，1.19(3h，s，h-29)，0.93(3h，d，j＝5.3hz，h-31)，4.27(1h，d，j＝6.7hz，h-arabinose-1')，3.52(1h，dd，j＝9.4，4.4hz，h-arabinose-3')，3.81(1h，dd，j＝19.2，6.9hz，h-arabinose-5'a)，3.52(1h，dd，j＝9.4，4.4hz，h-arabinose-5'b)，5.33(1h，d，j＝8.1hz，h-glucose-1')，3.33(1h，ddd，j＝11.8，5.2，4.4hz，h-glucose-5')，3.81(1h，dd，j＝19.2，6.9hz，h-glucose-6'a)，3.66(1h，dd，j＝12.0，3.8hz，h-glucose-6'b)；

¹³c-nmr(151mhz，cdcl3)δ38.76(c-1)，5.64(c-2)，89.40(c-3)，39.82(c-4)，55.57(c-5)，18.03(c-6)，32.70(c-7)，41.17(c-8)，36.42(c-10)，23.25(c-11)，128.31(c-12)，138.10(c-13)，41.49(c-14)，28.24(c-15)，25.62(c-16)，53.50(c-18)，71.37(c-19)，41.49(c-20)，25.64(c-21)，38.42(c-22)，27.15(c-23)，15.57(c-24)，14.57(c-25)，16.17(c-26)，23.29(c-27)，177.21(c-28)，25.77(c-29)，15.20(c-30)，105.72(3-arabinose，c-1')，72.25(c-2`)，72.87(c-3')，68.11(c-4')，65.00(c-5')，94.33(28-glucose，c-1')，72.39(c-2')，76.79(c-3')，69.63(c-4')，77.13(c-5')，60.94(c-6')。

进一步地，本发明还特别对上述的三萜类成分在治疗缺血性心脏病的应用进行了研究和实验验证，主要通过该成分对结扎左冠状动脉所致心肌缺血大鼠的影响的实验验证，证明该成分对心肌缺血损伤心肌具有显著的保护作用，治疗缺血性心脏病应用效果明显。

具体药效试验如下：

(一)对大鼠h9c2心肌细胞缺氧损伤的影响

1.实验方法

1.1细胞培养

体外培养h9c2心肌细胞，培养液为dmem(高糖)+10％fbs+0.1％双抗。取对数生长期的细胞置于96孔细胞培养板上，恒温培养36h后，分组处理。

1.2缺氧模型制备

取培养72h的h9c2心肌细胞去掉原培养基，换用无糖无血清dmem培养基后放入缺氧箱，充入混合气体(5％co2+95％n2)，调节氧浓度为0以达到缺氧，将缺氧箱放入37℃培养箱中培养。

1.3分组处理

①正常组:培养板用pbs冲洗2次后换用高糖无胎牛血清的dmem培养液，置于37℃5％co2培养箱中持续培养16h。

②缺氧模型组：用pbs冲洗2次后换用无糖无胎牛血清的dmem培养液，放入缺氧箱中充入混合气体(5％co2+95％n2)，调节氧浓度为0以达到缺氧，将缺氧箱放入37℃培养箱中密闭培养16h。

③给药组：将含该成分的培养基(终浓度为50、10、2g·ml^-1)作用2h，用pbs冲洗2次后换用无糖无胎牛血清的dmem培养液配制的不同浓度的药物及阳性药n-乙酰半胱氨酸(0.08g·ml^-1)，放入缺氧箱中充入混合气体(5％co2+95％n2)，调节氧浓度为0以达到缺氧，将缺氧箱放入37℃培养箱中密闭培养16h。

1.4指标测定

①采用mts法测定细胞活力

②乳酸脱氢酶(ldh)活力测定：取各组样本细胞培养液上清液，按照试剂盒操作说明书，在490nm处测定乳酸脱氢酶(ldh)的活性。

2.实验结果

如表1-1，1-2所示，细胞缺氧16h后，与正常组比较，缺氧模型组存活率明显降低，ldh漏出量明显升高；药物的2、10、50g·ml^-1提高了细胞存活率，有显著差异，其余浓度没有统计学意义。以上结果提示该药物对细胞缺氧损伤具有保护作用。

表1-1对缺氧导致h9c2心肌细胞存活率的影响

表1-2对缺氧导致h9c2心肌细胞ldh活性的影响

注：与模型组比较，^**p<0.01,^***p<0.001

(二)对结扎左冠状动脉所致心肌缺血大鼠的影响

1.实验方法

1.1分组

sd大鼠随机分为空白组、模型组、药物低剂量(10mg·kg^-1)组、中剂量(20mg·kg^-1)组、高剂量(40mg·kg^-1)组，每组6只，各组实验当天各给一次药，空白组和模型组腹腔注射等容量的生理盐水。

1.2模型建立

给药前大鼠禁食12h，不禁水。给药15min后，用20％乌拉坦(0.6ml/100g)对大鼠进行麻醉后，固定于恒温(37℃)鼠解剖台上。将针状电极插入四肢皮下后导入power-lab多通道生理记录仪描记心电图。于环状软骨下1-2mm处剪开气管，接动物呼吸机(频率：90次·min^-1,吸呼比为1：1.5)；剪断第3～5肋，撑开胸腔，镊子撕开心包膜，充分暴露心脏并稳定5min；用穿有5/0缝合线的小圆针从左心耳下缘2mm出进针，垂直于左前降支由肺动脉锥旁出针，进针深度控制在1.5mm左右，宽度为1.5～2mm，结扎左冠状动脉前降支后迅速关闭胸腔，空白组只穿线不结扎。冠状动脉结扎成功标志:结扎线远端心肌颜色发绀，心电图表现为s-t段抬高和(或)t波高耸。造模3h,由腹腔取血，测定血清酶的含量。缺血后，迅速开胸取心脏并染色。

1.3观察指标

(1)心肌梗死面积：3h后迅速开胸取心脏，用冷pbs溶液冲洗余血，保鲜膜包裹于-80℃冷冻15min，将心脏平行切成2mm厚切片；心脏切片放入1％ttc溶液中，置于37℃水浴中避光染色15min，将染色后的心脏切片于10％福尔马林溶液中固定24h；滤纸吸干心脏切片表面福尔马林溶液，按顺序称重，计算心肌梗死范围。

(2)血清酶的检测：3h后腹主动脉取血，分离血清。用相应的试剂盒分别测定测定乳酸脱氢酶(ldh)含量、肌酸激酶(ck)含量和谷草转氨酶(ast)含量。

2.实验结果

2.1心肌梗死面积测定结果

与空白组比较，模型组心肌梗死面积具有极显著差异(p<0.001)。与模型组比较，给药高剂量组可明显减少了心肌缺血大鼠心肌梗死面积(p<0.05)，结果表明：该药物对心肌缺血损伤大鼠心肌具有显著的保护作用。

表1-3对心肌缺血梗死范围的影响

注：与空白组比较，^###p<0.001,与模型组比较，^*p<0.05

2.2乳酸脱氢酶(ldh)、肌酸激酶(ck)和谷草转氨酶(ast)含量的测定结果

与空白组比较，模型组ldh，ck及ast均显著升高。与模型组比较，给药高剂量组均可减少ldh漏出(p<0.05)、ck含量(p<0.05)及ast的含量(p<0.05)，结果表明：该药物对心肌缺血损伤大鼠心肌具有显著的保护作用。

表1-4对心肌缺血损伤大鼠ldh、ck和ast含量的影响

注：与空白组比较，^#p<0.05,^##p<0.01,^###p<0.001；与模型组比较，^*p<0.05。

本发明的有益效果是：本发明的三萜类成分和制备方法具有成分富集效率高，节约药材，方法明晰简单等特点，同时该成分对于治疗缺血性心脏病有显著效果。

附图说明

图1为3-o-α-l-吡喃阿拉伯糖基-28-o-β-d-吡喃葡萄糖基坡摸酸酯核磁共振氢谱。

图2为3-o-α-l-吡喃阿拉伯糖基-28-o-β-d-吡喃葡萄糖基坡摸酸酯核磁共振碳谱。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

一种三萜类成分，其成分为：3-o-α-l-吡喃阿拉伯糖基-28-o-β-d-吡喃葡萄糖基坡摸酸酯；其化学式为：

上述的三萜类成分的制备方法，其制备方法及步骤为：

(1)取阔叶黄檀心材50.0kg，粉碎，用50％～70％乙醇加热回流提取1～5次，每次1～5h，合并提取液，回收溶剂，浓缩至无醇味，得浸膏4.5kg；

(2)加适量水于浸膏中分散，得到混悬液，用石油醚萃取，回收溶剂，分别得到石油醚萃取部位；

(3)石油醚萃取部位经硅胶柱色谱，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得到12个流分，即frs.1-12；

(4)fr.9经凝胶柱色谱，二氯甲烷-甲醇洗脱，得到5个流分，即fr.9.a-e；

(5)将fr.9.b流分经凝胶柱色谱纯化得到化合物:3-o-α-l-吡喃阿拉伯糖基-28-o-β-d-吡喃葡萄糖基坡摸酸酯。

以上仅仅是本发明的较佳实施方式，根据本发明的上述构思，本领域的熟练人员对此发明作出的各种修改和改变均属于本发明的实质。