与禽白血病病毒p27蛋白相结合的多肽及其应用的制作方法

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及一种与禽白血病病毒p27蛋白结合的多肽及其应用。

背景技术：

禽白血病病毒（avianleukosisvirus,alv）是一种主要通过种鸡的种蛋垂直传播的致肿瘤性病毒。它主要造成感染鸡群生长迟缓、产蛋率和受精率等生产性能降低、肿瘤发生；同时会引起感染鸡的免疫抑制。该病在世界各地均有发生，在我国地方品种鸡呈蔓延趋势，可直接导致种鸡场经营困难。alv是一种基因组为单股rna的反转录病毒，被分为a～j等10个亚群。p27基因是禽白血病病毒不同亚群之间的一段高度保守的基因。p27蛋白是病毒核心外壳的主要成分，其含量高，占病毒总蛋白成分的30%以上，有许多易于检测的病毒抗原位点，是制备群特异性抗体的首选抗原。

然而，禽白血病病毒的培养要求较高，纯化难度极大，因此制备该病毒的抗体非常不易，以其为基础的检测方法也难以得到普及应用。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种能与禽白血病病毒p27蛋白特异性结合的多肽，其结构简单，与p27蛋白的亲和力好，特异性高，人工合成制备容易，可用于对禽白血病病毒抗原进行定量和定性检测，检测成本低廉。

为解决上述技术问题，本发明研究利用噬菌体肽库展示技术，以原核表达纯化的禽白血病病毒p27蛋白为目的蛋白，经过多轮筛选，最终得到一种可特异结合禽白血病病毒p27蛋白的噬菌体，经扩增培养后进行序列测定，其多肽序列为nnsvsmn；人工合成此多肽进行elisa结合实验，结果表明，人工合成的多肽可与禽白血病病毒p27蛋白有良好的结合能力。

所述多肽序列为线性结合多肽。

所述的多肽序列，包括以所述的多肽序列为核心，任何对此多肽序列的延长和修饰，修饰材料包括但不限于荧光材料、生物素、酶类、纳米材料及特定蛋白。

编码所述多肽的多核苷酸，其核苷酸序列为：

（a）如seqidno.2所示；或为

（b）与核苷酸序列（a）互补的序列。

构建一种噬菌体，含有上述多肽或上述多核苷酸。

构建一种遗传工程化的宿主细胞，包含有上述筛选出的噬菌体。

将所述多肽序列用于禽白血病病毒的p27蛋白，其中包括但不局限于酶联免疫反应检测。

所述多肽序列在用于对禽白血病病毒抗原进行定量和定性检测中的应用。也可以上述多肽为基础，制成用于检测禽白血病病毒的试剂盒。

本发明积极有益的技术效果在于：

（1）本发明利用噬菌体肽库筛选技术，通过与原核表达纯化的禽白血病p27蛋白的多轮结合筛选，最终得到可特异结合禽白血病病毒p27蛋白的多肽噬菌体；经扩增培养后进行序列测定，其多肽的核心序列为nnsvsmn；人工合成此多肽进行elisa结合实验，结果表明，此人工合成的多肽可与禽白血病病毒p27蛋白很好结合；本发明多肽与p27蛋白的亲和常数可达到2.91×10⁹l/mol，亲和力较好。

（2）禽白血病病毒的培养要求较高，纯化难度极大，因此制备该病毒的抗体非常不易，本发明设计合成的多肽很好地规避了这一难题，可用人工合成方法快速取得，检测成本也非常低廉。

（3）本发明的人工合成多肽与细胞培养alv、组织分离alv、人工合成p27蛋白均可以结合，而且与其它病毒均不反应，特异性较高。

（4）以本发明多肽为基础的检测方法比以目标蛋白进行免疫获得蛋白抗体的过程简便，更易操作；通过对多肽进行标记，可快速地对禽白血病病毒p27蛋白进行定性和定量检测。

附图说明

图1为利用多肽测定细胞培养禽白血病病毒、原核表达p27蛋白的结果对比图。

图中横坐标上，1为禽白血病病毒接种df-1细胞，2为原核表达禽白血病p27蛋白，3为df-1细胞对照；纵坐标为od值。

图2为利用本发明的多肽与其它病毒交叉反应的结果对比图。

图中横坐标为各种病毒细胞培养物包被elisa板的不同待检病毒；纵坐标为od值。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的生化试剂或原料如无特别说明，均为常规市售产品；所涉及的检测或试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：噬菌体随机肽库的筛选

噬菌体随机肽库是是噬菌体展示技术的一个重要分支。肽库是由大量带有不同肽段的单个噬菌体组成的重组噬菌体库。重组噬菌体在进行子代重新组装时，其多肽序列将展示在噬菌体的表面，该展示多肽具备一定的空间结构和生物活性，可以与相应的目标蛋白进行结合。通过目标蛋白与展示肽库结合后，洗脱未结合的噬菌体，然后将与目标蛋白结合的噬菌体洗脱下来感染宿主菌扩增，经过3到6轮的“吸附-洗脱-扩增”，可富集到与目标蛋白相结合的特异性重组噬菌体；经过测序分析，可得到与目标蛋白特异性结合的多肽结构和序列（如seqidno.1所示）。

在本例中，于无菌条件下，用纯化表达的alvp27蛋白包被聚乙烯板，每孔100μl（100μg/ml），置于4℃条件下，温和振荡过夜，去除包被液，再用5%的bsa液封阻，4℃作用至少8小时。

去除封阻液，用将100μl（约1×10¹¹体量）的噬菌体肽库（ph.d.-7噬菌体展示肽库试剂盒为neb公司产品）加入到相应的孔中，室温条件下，温和摇动60min，每孔加入tbst洗涤液250μl，洗涤5-8次；孔中加入洗脱液200μl，室温温和摇动10min，吸出洗脱液，加入15μl1mtris-hcl（ph9.1）中和至中性。

中和后的洗脱液用于滴度测定和扩增培养；将llb培养后的噬菌体进行沉淀、离心收集，用于下一轮的筛选。

不同筛选轮次的噬菌体富集鉴定见表1，洗脱液的滴度测定结果见表2。

。

。

实例2筛选多肽的鉴定

（1）将接种的禽白血病病毒的df-1细胞（购自上海纪宁生物科技有限公司）进行超声波破碎，然后以2μg/ml（蛋白量）进行elisa包被；以同样方式将原核表达的禽白血病病毒p27蛋白和未接种病毒的df-1做对照进行包被。在进行特异性试验时，将不同病毒蛋白进行包被。

（2）将人工合成的多肽nnsvsmn偶联辣根过氧化物酶，以100ng/ml的量，加入到上述elisa板中，每孔50μl，振荡器上混匀，37℃避光孵育30min；

（3）用酶标板洗板机洗涤3次，用稀释后的缓冲液加满各孔，再甩干，如此重复洗涤3次；

（4）根据所需用量将tmb液加入到相应的孔中，每孔100μl，在振荡器上振荡30s，室温条件充分显色10min；

（5）每孔加入50μl3m的氢氧化钠终止反应，在振荡器上振荡30s，然后用酶标仪读取各孔在450nm处的吸光值，判定结果。

结果表明，人工合成多肽与细胞接种alv、原核表达alvp27蛋白均可以结合（见图1），与其它病毒均不反应，其特异性较高（见图2）。

实例3筛选多肽亲和力鉴定

（1）将接种的禽白血病病毒的df-1细胞培养液进行超声破碎，然后以2μg/ml（蛋白量）进行elisa包被；以同样方式将原核表达的禽白血病病毒p27蛋白和未接种病毒的df-1做对照进行包被。在进行特异性试验时，将不同病毒蛋白进行包被。

（2）将人工合成的多肽nnsvsmn偶联辣根过氧化物酶（采用商品化偶联试剂盒偶联），以100ng/ml的量，加入到上述elisa板中，每孔50μl，振荡器上混匀，37℃避光孵育30min；

（3）用酶标板洗板机洗涤5次，用稀释后的缓冲液加满各孔，再甩干，如此重复洗涤5次；

（4）根据所需用量将tmb液加入到相应的孔中，每孔100μl，在振荡器上振荡30s，室温条件充分显色10min；

（5）每孔加入50μl2m的硫酸终止反应，在振荡器上振荡30s，然后用酶标仪读取各孔在450nm处的吸光值，判定结果。

最终利用scatchard方程分析，不同加入酶标多肽的浓度来计算多肽与病毒的亲和力常数，其中ka=p1/ap2（其中p1是指多肽与抗原相结合的浓度，a是指抗原浓度，p2是指未结合多肽浓度）。通过计算可知本发明所得多肽与p27蛋白的亲和力常数可达3.26×10⁹l/mol，说明其亲和力比较好。

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<120>与禽白血病病毒p27蛋白相结合的多肽及其应用

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