与黄瓜果实软刺基因Ts共分离的InDel‑Ts2分子标记及其应用的制作方法

文档序号：13440309阅读：144来源：国知局

本发明涉及基因工程技术领域的分子标记，特别涉及一种与黄瓜果实软刺基因ts共分离的indel-ts2分子标记。

背景技术：

黄瓜(cucumissativusl.)是葫芦科(cucurbitaceae)甜瓜属(cucumis)一年蔓生的草本植物，黄瓜作为世界十大重要的蔬菜作物之一，也是我国主栽蔬菜作物之一。

果实是黄瓜经济性状最重要的部分，黄瓜果实属于瓠果，由子房和花托共同发育而成。在黄瓜果实上有一个重要的性状是果刺，果刺是黄瓜特化的表皮毛。到目前为止，黄瓜表皮毛基因的研究相对较少。2015年，zhaojl等利用mict微毛突变体和野生型杂交获得的7936株f2群体，利用bsa法将mict基因定位在黄瓜第3号染色体遗传距离为71.13kb的区间内。详细结果请参看：zhaojl等在《journalofintegrativeplantbiology》(植物生理学报)2015年第57卷925-935页发表的题为《micro-trichomeasaclassihomeodomain-leucinezippergeneregulatesmulticellulartrichomedevelopmentincucumissativus.》(微毛基因作为i型亮氨酸同源拉链基因调控黄瓜多细胞表皮毛发育)一文。同年，wangyl等利用tril无毛突变体和野生型杂交获得的1058株f2群体，通过bsa法将控制表皮毛起始发育的tril基因定位在黄瓜6号染色体uw007183和uw007211标记之间，遗传距离为37.4kb，详细结果请参看：wangyl等在《theoreticalandappliedgenetics》(理论应用遗传学)2015年第129卷305-316页发表的题为《identificationandmappingoftril,ahomeodomain-leucinezippergeneinvolvedinmulticellulartrichomeinitiationincucumissativus》一文。

mict基因(micro-trichomes)和tril基因(trichome-less)分别控制黄瓜微毛性状和无毛性状，由于果刺是表皮毛的特化，因此mict突变体的果刺性状特点是小果刺，tril突变体的果刺性状特点是无果刺。tril基因隐性上位于mict基因。csttg1基因平行并直接作用于tril基因，来调控黄瓜表皮毛的形成。因此，黄瓜果实软刺基因ts的研究将为其他作物及黄瓜的表皮毛发育机制的研究奠定基础。

随着人们生活水平的提高，品质育种已提到重要位置。黄瓜果刺性状属于感观品质范畴。欧美温室类型的黄瓜为无果瘤、少刺的果皮，称其为水果黄瓜，其市场价格为普通黄瓜的2-3倍。外观光滑黄瓜污染少，清洗方便，食用卫生，是无公害蔬菜的理想品种。经检测表明：无瘤少刺黄瓜果肉农药残留量比有刺黄瓜低27％，果皮农药残留量低18％。黄瓜软刺柔软不刺激，易脱落，增强了植株的抗逆性，是消费者的更佳选择。基因ts控制软刺的形成，它的研究将会推动品质育种进程。用与目的性状紧密连锁的分子标记进行标记辅助选择在黄瓜遗传育种中是十分有效的方法，分子标记是在dna水平上对目标性状进行选择，具有高效、快速、不受环境条件限制等优点，可在苗期进行选择，加快育种的进程。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种与黄瓜果实软刺基因ts共分离的indel-ts2分子标记及其应用。本发明利用分子标记和bsa(bulkedsegregantanalysis)法，提供了与黄瓜软刺基因ts共分离的分子标记。本发明的分子标记可简便、快速、高通量地应用于育种实践。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种与黄瓜果实软刺基因ts共分离的indel-ts2分子标记，该分子标记具有序列表seqidno.1所示的107个核苷酸序列，以及序列表seqidno.2所示的105个核苷酸序列，其中seqidno.1中的核苷酸序列与软刺基因共分离，seqidno.2中的核苷酸序列与硬刺基因共分离。该分子标记的特征在于与软刺基因共分离，该分子标记具有高稳定性，可以简便、快速、高通量地应用于世界各地黄瓜硬刺/软刺类型的筛选。

所述分子标记由me5所示的上游引物和em6所示的下游引物扩增得到，引物由上海华津生物科技有限公司合成。

所述引物me5序列，具体为：me5：5’-ggttgaaggttgattgga-3’，

所述引物em6序列，具体为：em6：5’-ctcataacgtcatccctaaa-3’。

本发明利用多种硬刺亲本和软刺亲本杂交获得f1，f1单株均为硬刺；f1再自交获得多种f2分离群体，通过对f2分离群体中硬刺、软刺进行遗传学分析，确定黄瓜软刺性状属于单基因隐性遗传性状。从f2群体中随机各挑取10株硬刺单株和10株软刺单株，并构建硬刺池和软刺池。采用ssr分子标记结合bsa方法，筛选黄瓜软刺连锁分子标记，最终将软刺基因ts定位在109.7kb区间内。在该109.7kb开发300对indel标记，结合bsa法进一步筛选连锁标记，最终其中indel分子标记indel-ts2在亲本间表现出多态性，并且与ts基因共分离。

与黄瓜果实软刺基因ts共分离的indel-ts2分子标记的获得方法，所述分子标记由me5所示的上游引物和em6所示的下游引物扩增得到，

所述引物me5序列，具体为：me5：5’-ggttgaaggttgattgga-3’，

所述引物em6序列，具体为：em6：5’-ctcataacgtcatccctaaa-3’。

反应体系为基因组dna30ng，引物0.5μmol/l，200μmol/ldntps，2mmol/lmgcl2，1μl10×pcrreactionsbuffer，0.6utaqdna聚合酶，总反应体系为10μl，引物为me5所示上游引物及em6所示下游引物。

pcr扩增程序为：94℃5min，94℃25s，55℃25s，72℃25s，32个循环，扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳缓冲液为0.5×tbe，160w恒功率，电泳3h。

与黄瓜果实软刺基因ts共分离的分子标记与黄瓜软刺性状共分离，所有世界各地的黄瓜品种均可以用这个分子标记筛选硬刺/软刺品种(除无刺无瘤黄瓜品种gl)。

传统的育种方法是根据植物的形态来进行选择，由于黄瓜软刺性状需要植株结瓜时才能确定，耗费时间较长，本发明的分子标记可在植物种子期间或子叶长出的早期阶段就可鉴定，既省时又准确，所以可用于黄瓜分子标记辅助育种，加速黄瓜品质育种的进程。

与现有技术相比，本发明分子标记具有高稳定性，可以简便、快速、高通量地应用于世界各地黄瓜硬刺/软刺类型的筛选。

附图说明

图1为分子标记indel-ts2的pcr扩增效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

遗传分离群体的构建与黄瓜软刺基因的鉴定

1.多种f2群体的构建

构建f2群体所用到的软刺品种为：nc073。硬刺品种有：s77，sa419-2。

nc073是通过已知的nc072得到，其中nc072，即csa1g056960-072的gdna序列如序列表seqidno.6所示。csa1g056960-072的cds序列如序列表seqidno.7所示。

其中软刺品种nc073生物学特征为：nc073果刺柔软有弹性，碰触就会脱落，不会有刺痛感。与野生型黄瓜sa419-2相比，生物学结构最大的区别在于基细胞。nc073果刺的基细胞由多细胞不规则排列并呈伸长棒球状结构，而sa419-2的果刺脆而硬，碰触容易折断，有刺痛感，基细胞则由多细胞排列形成的球状结构。

遗传学分析表明，nc073基因组dna在第二个内含子剪接位点gt突变为gc，导致cdna第二个外显子缺失。

其中，sa419-2(csa1g056960-sa419-2)gdna序列如序列表seqidno.3所示。nc073(csa1g056960-nc073)gdna序列如序列表seqidno.4所示。nc073(csa1g056960-nc073)cds序列如序列表seqidno.5所示。根据nc073gdna序列、以及nc073cds序列，采用普通生物学方法可以得到软刺品种nc073。

硬刺品种s77、sa419-2为已知的市售产品。

本实施例利用这3个亲本配制了杂交组合，得到f1代，f1代均为硬刺单株；f1代自交、回交产生f2代群体和bc1群体。在f2和bc1群体中出现硬刺和软刺性状分离现象，鉴定并统计硬刺/软刺表型，分析硬刺和软刺在f2和bc1中的分离比，利用卡方分析法进行验证，最后得出黄瓜软刺性状属于细胞核单基因控制的隐性性状。

2.ts基因紧密连锁ssr标记和indel标记的筛选

2.1黄瓜基因组dna的提取

用ctab法提取亲本、bc1及f2分离群体的叶片总dna。方法为：取单株幼叶放于2ml离心管中，加入两粒钢珠，750ulctab提取缓冲溶液(60℃预热)，研磨机60hz/90s研磨，60℃放置0.5-1h，中间缓慢摇匀1次。加等体积的氯仿，缓慢摇晃5min，12000r/min离心10min，吸取500ul上清，加入两倍体积无水乙醇，-20℃放置30min，离心去上清，70％酒精洗两次。晾干，1×te溶解。加入10ug/ml的rna酶。0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，核酸仪检测其浓度。最终稀释成50ng/ul的浓度，-20℃储存备用。

2.2硬刺/软刺基因池的建立

bsa法从f2分离群体中分别随机选取硬刺株和软刺株个体各10株，建立硬刺和软刺黄瓜的基因池。

2.3标记的筛选

用551对ssr引物组合和300对indel标记对两个亲本及两个基因池进行筛选。反应体系为基因组dna30ng，引物0.5μmol/l，200μmol/ldntps，2mmol/lmgcl2，1μl10×pcrreactionsbuffer，0.6utaqdna聚合酶，总反应体系为10μl。pcr扩增程序为：94℃5min，94℃25s，55℃25s，72℃25s，32个循环。扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳缓冲液为0.5×tbe，160w恒功率，电泳3h。

所述分子标记由me5所示的上游引物和em6所示的下游引物扩增得到，引物由上海华津生物科技有限公司合成。

所述引物me5序列，具体为：me5：5’-ggttgaaggttgattgga-3’，

所述引物em6序列，具体为：em6：5’-ctcataacgtcatccctaaa-3’。

电泳后进行银染。银染方法为：将带胶的玻璃板放入固定液中，在摇床上轻轻摇动至指示剂颜色褪去，其中固定液的组成为：冰醋酸、无水乙醇、蒸馏水的体积比为1:10:100；用超纯水洗1min-3min；将冲洗后的胶板放入染色液中摇动半小时，其中染色液的组分为2g/l硝酸银；将染色后的胶板放入超纯水中漂洗后放入装有显色液的塑料盒中，轻轻摇动至条带清晰，放入自来水中冲洗，统计结果并拍照。其中显影液组分为：1l蒸馏水中加入30gnaoh和4ml甲醛混匀得到的。

在硬刺、软刺两个亲本间和硬刺池、软刺池之间表现出相同的多态性条带，如图1所示，分子标记indel的pcr扩增效果：m代表markerdl500，sa419-2为黄瓜果实硬刺亲本；nc073为黄瓜果实软刺亲本；f1代表两亲本杂交后代；f2软刺单株和f2硬刺单株分别代表在f2群体中随机挑选的10株软刺和10株硬刺植株。即硬刺亲本sa419-2和硬刺基因池中的条带一致，软刺亲本nc073和软刺基因池条带一致；而硬刺亲本sa419-2和硬刺基因池中的条带与软刺亲本nc073和软刺基因池条带不同。通过721株群体进行遗传连锁分析，将与软刺亲本nc073的带型一致的个体记为a，将与硬刺亲本sa419-2带型一致的个体记为b，杂合带型记为h。结果这个多态性位点与ts基因共分离。根据9930黄瓜基因组网站(http://www.icugi.org/cgi-bin/gb2/gbrowse/cucumber_v2/)显示该indel标记距离黄瓜软刺基因ts的物理距离为14322bp。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>上海交通大学

<120>与黄瓜果实软刺基因ts共分离的indel-ts2分子标记及其应用

<130>173984-1

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>107

<212>dna

<213>黄瓜(cucumissativusl.)

<400>1

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<210>2

<211>105

<212>dna

<213>黄瓜(cucumissativusl.)

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<211>2425

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<213>黄瓜(cucumissativusl.)

<400>3

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<213>黄瓜(cucumissativusl.)

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