一种用于烟草白粉病抗性资源快速鉴定筛选的分子标记的制作方法

本发明涉及一种用于烟草白粉病抗性资源快速鉴定筛选的分子标记，属于分子遗传学领域。

背景技术：

烟草白粉病俗称“上灰”、“下霜”、“上硝”，该病多为害成熟老叶，由下向上发展。叶片发病，初为近圆形的黄褐色小斑，后斑上现白色粉状小点，使病斑呈毯状，斑块扩大，白粉布满整个叶片，病叶先褪绿变褐，后枯死。严重时为害嫩茎，病茎上也布满白粉。病叶烘烤后薄如纸，色暗锈褐色，丧失经济价值。白粉病在中国各烟区均有发生，其中以华南、西南和华中烟区最为普遍，危害也较重。目前烟草白粉病的防治主要以化学防治为主，极易造成农药残留，是当前烟叶农残超标的主要因素。

种植烟草抗白粉病品种是防治该病最经济、安全和有效的方法，优异的烟草白粉病抗源是培育抗病品种的基础。

目前烟草白粉病抗性资源筛选主要依赖于田间自然发病调查和人工接种鉴定，存在鉴定周期长、易受环境影响、重复性差等缺点。在传统抗病资源筛选方法中，首先要有大量的烟草植株和白粉病菌源进行接种，其次要有很大的空间，操作非常复杂，同时还受环境的影响。若不能有效地处理好白粉病菌源、烟苗以及环境之间的关系，抗/感白粉病的表型鉴定结果可靠性就很低，因此，抗白粉病资源筛选不仅费时,而且难度大，成本高。分子标记是一种快速、简便、成本、低廉并可在烟草生长早期进行无损检测的一种技术,目前还没有快速鉴定白粉病抗性资源相关分子标记的报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是：提供一种用于烟草白粉病抗性资源快速鉴定筛选的分子标记，用于快速鉴定由于烟草基因突变形成的白粉病广谱抗性资源，如果两对引物能同时扩增出相应大小的特异片段，则此材料即为抗白粉病资源，对此标记鉴定出的抗性资源进行白粉病接种和鉴定，结果都表现出抗病性，吻合率达100％。

本发明的技术方案是：一种用于烟草白粉病抗性资源快速鉴定筛选的分子标记，所述的分子标记序列为seqidno.1和seqidno.2。

扩增所述的用于烟草白粉病抗性资源快速鉴定筛选的分子标记的引物对，所述的引物对为m1-f1/m1-r和m2-f1/m2-r，其中m1-f1的序列为：5’-aattaactttggtccaaactta-3’，m1-r的序列为：5’-ttagatgtgtgatagggtcagttag-3’，m2-f1的序列为：5’-ggtgctgctctggatagtctc-3’，m2-r的序列为：5’-acaatctaaaagtgtagtttggtgg-3’。

一种用于烟草白粉病抗性资源快速鉴定筛选的分子标记，所述的分子标记是由上述的引物对以烟草白粉病抗性烟草基因组dna为模板经pcr扩增得到。

所述的分子标记为seqidno.1和seqidno.2。

一种载体含有上述的分子标记。

一种重组细胞含有上述载体。

一种用于烟草白粉病抗性资源快速鉴定筛选的分子标记的检测方法，根据所述的的分子标记的核苷酸序列设计引物，以被检测烟草基因组dna为模板进行扩增，并判断扩增产物中是否存在该分子标记。

所述的引物为上述引物对。

结果鉴定：标记seqidno.1和seqidno.2都没有扩增条带或者只有一个标记有条带的为感病材料，同时出现seqidno.1和seqidno.2扩增条带，该烟草材料具有白粉病抗病性。

本发明的有益效果：使用本发明提供的两对引物能同时扩增出相应大小的特异片段，即本发明的分子标记，则此材料即为抗白粉病资源，对此标记鉴定出的抗性资源进行白粉病接种和鉴定，结果都表现出抗病性，吻合率达100％。本发明公开的分子标记只需对烟草种质资源dna进行pcr扩增即可鉴定出此类白粉病抗性，不需接种白粉病，即节省了大量工作，又保证植株正常生长。

1、准确性高，重复性好。与传统的利用接种不同的白粉病生理小种鉴定白粉病抗性方法不同，本发明利用目标基因内snp位点开发出仅利用pcr电泳技术即可鉴定和筛选白粉病抗性资源，标记鉴定结果与抗性吻合度达100％。有效解决了人工接种和田间自然发病调查易受环境影响、重复性差等缺点。

2、鉴定周期短，工作量小。本发明可以在幼苗期筛选鉴定，大大缩短鉴定周期和减少了工作量，节约了成本。

3、有助于发现新的烟草白粉病抗源。通过本发明提供的分子标记可简单快速的划分烟草白粉病抗性类型，有助于发现新的烟草白粉病抗源。

附图说明

图1为不同引物对扩增抗病和感病材料dna结果；

图2为两个分子标记对不同烟草种质资源进行筛选，其中s1、s3材料只有m1标记有条带，m2标记无条带；s2材料只有m2标记有条带，m1标记无条带；s4-s12两个分子标记均没有扩增条带，因此s1-s12为感病材料，r1-r4材料两个分子标记均有条带，为抗病材料；

图3为烟草s1-s12和r1-r4材料接种白粉病后进行抗性鉴定的结果，由图可以看出，s1-s12为感病材料，r1-r4为抗病材料。

具体实施方式

一种用于烟草白粉病抗性资源快速鉴定筛选的分子标记，烟草白粉病抗病基因的标记引物m1和m2的脱氧核糖核苷酸序列：

一、分子标记引物设计

根据抗病材料中白粉病相关序列差异位点设计引物m1和m2，反向引物固定为m1-r和m2-r，正向引物分别为m1-f1、f2、f3和m2-f1、f2、f3，引物的脱氧核糖核苷酸序列、退火温度及扩增片段长度见下表：

二、烟草dna提取

用常规ctab法分别提取烟草基因组dna,方法为:

(1)称取烟草叶片100mg左右置于2ml离心管中,加液氮用特制研棒研磨至粉末状；

(2)加入900μl预热到65℃的2×ctab缓冲液(2％ctab，100mmtris-hclph8.0，20mmedtaph8.0,1.4mnacl),65℃水浴20分钟后取出冷却；

(3)加入200μl氯仿-异戊醇混合液(24:1)摇匀，4℃，7500rpm离心10min后转移上清至1.5mlep管；

(4)再次加入200μl氯仿-异戊醇混合液(24:1)摇匀，4℃，7500rpm离心10min；

(5)取出上清置于新的ep管中,加入1/10体积3mph5.2醋酸钠和等体积异丙醇,摇匀后4℃离心20min(12000rpm)；

(6)弃上清,用75％乙醇洗涤两次后,置于超净工作台中干燥,用含rnase的te缓冲液融解,放置-20℃保存备用。

(7)取2μldna样品在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，120v电压电泳20分钟，检测dna的质量；取1μl样品用nanodrop检测dna浓度和od值。

三、pcr扩增

pcr反应体系20ul：

pcr反应循环程序为：

(4)pcr产物用2％的琼脂糖凝胶，在120v电压下电泳25min，并在凝胶电泳成像系统下观察条带的情况。

四、分子标记pcr扩增及片段测序

对上述扩增到的320bp的片段和354bp的片段，分别连接到puc18载体中，获得重组载体。将该重组载体转化到大肠杆菌dh5α中，挑单克隆，培养获得重组细胞。从重组细胞中提取质粒，所述质粒即重组载体，采用m13通用引物对克隆片段进行测序，结果显示，m1-f1/m1-r标记在抗病材料中扩增到的序列为(seqidno.1)，m2-f1/m2-r标记在抗病材料中扩增到的序列为(seqidno.2)。上述克隆、转化、培养、质粒提取等步骤参考《分子克隆实验指南第三版》，黄培堂等译，科学出版社2002年9月出版。

引物筛选实验

分别以抗病材料tt7(台烟7号)和感病材料k326的dna为模板，以不同的正向引物和反向引物组合(下表)，进行pcr扩增，结果如下表、图1，m1为100bpladdermarker，m2为dl2000marker。

资源筛选实验

使用m1-f1/m1-r，m2-f1/m2-r引物对不同烟草材料的dna进行pcr扩增，同时对烟草植株进行苗期白粉病接种鉴定，结果如图3，可以看出，两对引物同时出现扩增条带的材料(r1-r4)表现出抗病性，都没有条带(s4-s12)或者只有一对引物出现扩增条带(s1-s3)的材料表现出感病性。电泳图上图使用m1-f1/m1-r引物对，下图使用m2-f1/m2-r引物对marker为dl2000。

<110>贵州省烟草科学研究院

<120>一种用于烟草白粉病抗性资源快速鉴定筛选的分子标记

<160>25

<210>1

<211>320

<212>dna

<213>烟草(nicotianatabacuml.)

<400>1

aattaactttggtccaaacctagcacatttaactccacagaatcaggaaaattttgattt60

ccagatatacatcaatagagcagttgaaaaagacttcaaatttgttgtggaaataaggtg120

tacatgcatcttctctctctctctctctctctttgtttttgttttctctaacacttttca180

gaaactttttaccaatactgtcattactaaatataacctcatttattgtgtgcagtccag240

cattatggctcttcacagtactatattttctaaccactaccaatggtaagactatctaac300

tgaccctatcacacatctaa320

<210>2

<211>352

<212>dna

<213>烟草(nicotianatabacuml.)

<400>2

ggtgctgctctggatagtctcctctccccctctctatctctccagcttttttttagcccg60

tttggacataagaatttttattttattctttttctaaaaaaatcacttttttttcgaaat120

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aaaaaactctaaaagattgtttttcaaaattttcactcatatcacaaccagtggcggagg240

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ccttatgtagattttgaacccccttgaccaccaaactacacttttagattgt352

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工合成

<400>3

aattaactttggtccaaactta22

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工合成

<400>4

aattaactttggtccaaacgta22

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工合成

<400>5

aattaactttggtccaaaccta22

<210>6

<211>25

<212>dna

<213>人工合成

<400>6

ttagatgtgtgatagggtcagttag25

<210>7

<211>21

<212>dna

<213>人工合成

<400>7

ggtgctgctctggatagtctc21

<210>8

<211>22

<212>dna

<213>人工合成

<400>8

cggtgctgctctggatagtatc22

<210>9

<211>21

<212>dna

<213>人工合成

<400>9

ggtgctgctctggatagtttc21

<210>10

<211>25

<212>dna

<213>人工合成

<400>10

acaatctaaaagtgtagtttggtgg25