褐飞虱沃尔巴克氏体的检测引物、试剂盒和检测方法与流程

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种褐飞虱沃尔巴克氏体的检测引物及其检测方法和检测试剂盒。

背景技术：

沃尔巴克氏体作为一种母系遗传的专性胞内共生菌，广泛存在于大量的节肢动物体内。已有的研究表明，在全世界范围内，理论上约有60％的昆虫感染了沃尔巴克氏体。沃尔巴克氏体不仅可以在寄主体内诱导胞质不亲和(cytoplasmicincompatibility，ci)表型达到种群压制效果，同时也能通过其所推动的种群替换达到阻断虫媒病毒的作用。ci是指当感染一种沃尔巴克氏体的雄虫与不感染沃尔巴克氏体的雌虫或感染不同株系沃尔巴克氏体的雌虫交配时所产后代胚胎的死亡，从而表现为成虫的不育。

在防治目标区域内，持续地释放经人工转染的沃尔巴克氏体所修饰而具有诱导ci能力的白纹伊蚊aedesalbopictus雄虫与野外的雌虫交配，可以达到快速压制野生种群效果。与此同时，与传统农药相比，基于沃尔巴克氏体的防治策略具有靶标专一性的优势，大大减少了对生态系统中其他生物群落的影响，对环境的破坏程度也大大降低。

通过人工转染的方式，将这样一种垂直传播的共生菌水平地从原始寄主转入一个新寄主体内，并使其稳定遗传下去，从而建立一个新的感染品系，作为防治其野生种群的供体的过程，是沃尔巴克氏体应用研究中最为关键的一部分。大量的研究表明，在实验室条件下利用显微注射技术能够成功地实现沃尔巴克氏体在不同寄主之间的水平转染。一旦进入新的寄主，wolbachia往往可以不同程度地影响寄主的表型，比如表达ci、提高寄主的抗病毒能力以及缩短寄主寿命等等。已经有研究表明综合利用沃尔巴克氏体所诱导的表型，可以成功通过种群替换的方式阻断登革病毒的传播。

稻飞虱作为一种重要的农业害虫，对我国首要的粮食作物——水稻的生产造成了极大的危害。除了造成水稻的减产甚至部分田块的绝收，每年由于对其防治造成的经济损失也十分惊人。其中，褐飞虱nilaparvatalugens作为一种单食性(仅取食水稻和野生稻)长距离迁飞害虫，凭借其刺吸、产卵以及传毒等为害方式，每年都可以在我国造成百万吨计的产量损失。考虑到化学杀虫剂的长期使用带来的抗性会无法避免地降低其对稻飞虱的防治效果，新的防治手段的研究与开发一直是科学家们所关注的热点问题，也符合有害昆虫综合治理(ipm)的总体方针。

我国危害水稻的稻飞虱主要有三种：褐飞虱和灰飞虱和白背飞虱三种，其中以褐飞虱发生和为害最重。目前针对飞虱沃尔巴克氏体的检测是通过pcr来完成的。而且只能检测出飞虱通用类型的沃尔巴克氏体，由于不同飞虱携带不同类型的沃尔巴克氏体，所以找到特异性的检测引物和检测方法显得尤为重要。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种专一性强、特异性高和灵敏度高的褐飞虱沃尔巴克氏体的检测引物。

实现上述目的的技术方案如下。

本发明的褐飞虱沃尔巴克氏体的检测引物，其上游引物和下游引物分别如seqidno.1和seqidno.2所示。

本发明的另一目的是提供一种褐飞虱沃尔巴克氏体的检测方法。

实现该目的的技术方案如下。

一种褐飞虱沃尔巴克氏体的检测方法，包括以下步骤：

(1)先把褐飞虱在无水酒精里浸泡，提取样品dna；

(2)加入样品dna稀释10倍为模板，以seqidno.1和seqidno.2作为pcr引物，进行pcr扩增。

优选地，扩增时加入的样品dna的浓度为是50×10^-1-30×10^-4ng/μl。

所述的进行pcr扩增，其反应条件优选为：94℃预变性5分钟；95℃变性5秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒，30个循环；72℃最后延伸5分钟。

本发明的另一目的是提供一种褐飞虱沃尔巴克氏体的检测试剂盒。

一种褐飞虱沃尔巴克氏体的检测试剂盒，包括检测引物和pcr试剂，所述的检测引物为：

wlugf：5’-ggctgataatccagcaattgc-3’；

wlugr：5’-aaaaattaaacgctactcca-3’。

优选地，还包括有褐飞虱的dna提取试剂，dna提取试剂包括有稀释缓冲液和dnarelease。

优选地，所述稀释缓冲液为：30mmnaoh、0.25mmedta、15mmtris-hcl，溶剂为

水；每20μl稀释缓冲液中加入0.5μldnarelease。

本发明的另一目的是提供一种褐飞虱沃尔巴克氏体dna的提取方法。

一种褐飞虱沃尔巴克氏体dna的提取方法，包括以下步骤：

先把褐飞虱在无水酒精里浸泡2±0.2分钟，然后把褐飞虱放入稀释缓冲液和dnarelease中；

瞬时离心后，放入pcr仪中进行dna提取；

dna提取程序：55℃，5min；98℃，5min；30℃，10s，即得。

由于褐飞虱整虫比灰飞虱大很多，脂肪和蛋白质含量较多，普通的磁珠法提取出的dna，不能有效的去除这些脂肪和蛋白质，会导致pcr扩增结果不稳定，有些褐飞虱体内的沃尔巴克氏体扩增不出来条带；而使用本发明的dna提取液，因含有专门的dnarelease，可以有效的去除多余的脂肪和蛋白质，提取出褐飞虱体内的dna，利于后续的pcr扩增。通过图6，很明显的看出用本发明的dna提取液，扩增准确性和扩增效率都很高。

利用本发明的检测引物按照本发明的检测方法能够快速高效专一的检测出褐飞虱沃尔巴克氏体，具有专一性强，特异性高(只检测出褐飞虱沃尔巴克氏体，而灰飞虱沃尔巴克氏体不发生扩增)，灵敏度高，其最低检测限为30×10^-4ng/μl。

因此，本发明所述褐飞虱沃尔巴克氏体的检测引物和试剂盒具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便等优点。

附图说明

图1是实施例2中特异性实验结果，其中m为marker，1-3为广州褐飞虱的沃尔巴克氏体，4-6为广州灰飞虱的沃尔巴克氏体。

图2，图3，图4是实施例3中灵敏度实验结果，其中m为marker，1为稀释10倍的dna样品，2、3、4、5、6分别是10、100、1000、10000、100000、1000000倍稀释的dna样品。

图5是实施例4中引物对比实验结果，其中m为marker，1-6为通用引物，其中1-3为褐飞虱基因组dna，4-6为灰飞虱基因组dna；7-12为本发明所述的褐飞虱特异性引物(seqidno.1和seqidno.2)，其中7-9为褐飞虱基因组dna，10-12为灰飞虱基因组dna。图6是实施例5中的实验结果示意图，1-5是普通dna提取液提取的dna进行扩增的结果，6-10是本发明dna提取液提取的dna进行扩增的结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1

本实施例所述一种褐飞虱沃尔巴克氏体的检测试剂盒，包括检测引物和pcr试剂，所

述的检测引物如下所示。

wlugf：5’-ggctgataatccagcaattgc-3’；seqidno.1

wlugr：5’-aaaaattaaacgctactcca-3’seqidno.2。

dna提取试剂：所述稀释缓冲液为：30mmnaoh、0.25mmedta、15mmtris-hcl，溶剂为水；每20μl稀释缓冲液中加入0.5μldnarelease。

实施例2：特异性

1、取6个分别装有20μl稀释缓冲液和0.5μldnarelease(稀释缓冲液的配方为：30mmnaoh、0.25mmedta、15mmtris-hcl，溶剂为水)的0.2mlep管；

2、三只广州褐飞虱(确定含有褐飞虱沃尔巴克氏体)和三只灰飞虱(确定含有灰飞虱沃尔巴克氏体)在无水乙醇里浸泡2分钟后，取出整只飞虱分别放入上述6个ep管中；

3、瞬时离心后，放入pcr仪中进行dna提取；

4、dna提取程序：55℃，5min；98℃，5min；30℃，10s。

5、瞬时离心后，得到dna抽提液，稀释10倍后，-20℃保存，即分别获得六只飞虱的沃尔巴克氏体的基因组dna(具体为：三份广州褐飞虱沃尔巴克氏体的基因组dna，三份灰飞虱沃尔巴克氏体的基因组dna)，分别以六只稻飞虱的沃尔巴克氏体的基因组dna为模板进行pcr反应。

5、pcr扩增体系：

6、混匀离心后进行pcr扩增；

7、pcr反应条件：

94℃5min

/2℃5min。

8.扩增结束后进行琼脂糖电泳，目标条带大小为362bp。

具体结果如图1所示，图1中泳道1-3为广州褐飞虱(褐飞虱沃尔巴克氏体)，4-6为灰飞虱(灰飞虱沃尔巴克氏体)，从图1中可以看出，只有褐飞虱沃尔巴克氏体能够扩增出，而灰飞虱沃尔巴克氏体不能扩增出来，由此说明，本发明的扩增引物特异性强。

实施例3：灵敏度

取实施例2的三份褐飞虱沃尔巴克氏体的基因组dna，测定其基因组dna浓度为50ng/μl、42ng/μl和30ng/μl，然后对基因组dna进行10、100、1000、10000、100000、1000000倍梯度稀释，再以稀释后的稀释液为模板dna，按照实施例2的pcr方法进行扩增，具体结果如图2所示(只给出一份dna样本的检查结果，其他的样本检测结果基本相同)，稀释10000倍后的稀释液都能扩增出pcr产物，再进行浓度计算，由此得到最后检测限是30×10^-4ng/μl(即10000倍稀释液中褐飞虱沃尔巴克氏体的基因组dna的浓度)。

实施例4对比例

取三份灰飞虱和三分褐飞虱的沃尔巴克氏体基因组稀释10倍，按照实施例2的操作和条件扩增，使用褐飞虱的通用引物(81f：5’-tggtccaataagtgatgaagaaacseqidno.3；691r：5’-aaaaattaaacgctactccaseqidno.4)和特异性引物对褐飞虱和灰飞虱进行扩增。通用引物目标条带大小610bp，特异性引物目标条带大小367bp。

具体结果如图5所示，泳道1-6为通用引物，其中1-3为褐飞虱基因组dna，4-6为灰飞虱基因组dna；7-12为本发明所述的褐飞虱特异性引物(seqidno.1和seqidno.2)，其中7-9为褐飞虱基因组dna，10-12为灰飞虱基因组dna；从图5中可以看出，通用引物能够把灰飞虱和褐飞虱沃尔巴克氏体都能够扩增出，而本发明所述特异性引物只能把褐飞虱沃尔巴克氏体扩增出来，而灰飞虱不能扩增出来，由此说明，本发明的褐飞虱特异性引物比通用性的特异性好。

实施例5

随机挑选10只褐飞虱，每5只分为一组，共2组。一组(1-5)用普通的dna提取液进行dna提取(购买于广州东盛生物科技有限公司)，另一组(6-10)用本发明的dna提取液进行dna提取(dnarelease购买于赛默飞世尔公司)，分别提取完dna以后，10个褐飞虱样本均按实施例2进行pcr扩增后跑电泳。由图6可以看出，1-5是普通dna提取液提取的dna进行扩增的结果，5只中有2只没扩增出条带，而6-10是本发明dna提取液提取的dna，5只全部扩增出条带，而且条带的亮度也高于1-5.由此说明本发明的dna提取液搭配国产的pcr扩增缓冲液才能最有效的扩增出褐飞虱体内的沃尔巴克氏体。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

序列表

<110>广州威佰昆生物科技有限公司

<120>褐飞虱沃尔巴克氏体的检测引物、试剂盒和检测方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ggctgataatccagcaattgc21

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aaaaattaaacgctactcca20

<210>3

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tggtccaataagtgatgaagaaac24

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

aaaaattaaacgctactcca20