本发明涉及分子生物学和作物育种技术领域，具体地说，涉及用于鉴定豌豆品种和纯度的核心ssr引物及试剂盒。
背景技术：
豌豆是世界上第四大食用豆类作物，也是我国主要的杂粮作物之一。豌豆具有高蛋白质含量、维生素丰富、易消化吸收，粮、菜、饲、肥兼用等诸多特点。豌豆种子质量直接影响产量，豌豆种子纯度是衡量种子质量好坏的重要指标。随着我国种业市场的不断壮大，市场上出现了一些以次充好、掺假造假等违规现象，严重影响了种植户的利益和种业市场的健康发展。因此，建立一套高效、精准、高通量、自动化的豌豆品种纯度检测体系显得尤为重要。
目前我国对豌豆品种纯度鉴定主要依据ny/t2436-2013《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南豌豆》，该方法简便、经济，但受限于许多形态学性状鉴定周期长、易受环境影响等因素。近年来，随着生物技术的飞速发展，dna分子标记技术已经成为鉴定作物品种纯度、解决品种争议和新品种授权和保护的重要依据，也是促进农作物产业体系健康发展的有效手段。简单重复序列(simplesequencerepeat，ssr)，是第二代基于pcr技术的分子标记技术，具有多态性丰富、遗传信息多、操作便利、共显性、高度可重复性等优点，已被广泛应用于植物资源遗传研究和分子辅助育种实践中。ssr分子标记能够从dna水平上鉴定出品种间或品种内的遗传差异，在品种纯度及真实性鉴定、种子质量标准化、品种审定及产权登记保护、品种纠纷等方面具有重要应用价值。
豌豆品种科豌6号是辽宁省经济作物研究所于2005年以韩国超级甜豌豆为母本，辽豌4号为父本定向筛选育成，具有早熟、优质和增产优势显著等特点。豌豆品种中秦1号是中国农科院农作物研究所与秦皇岛市经济作物管理总站合作，于2011年以豌豆种质资源“早绿”为亲本，经ems化学诱变处理，定向筛选育成，具有抗逆性强、早熟、高产、食味鲜美，尤适菜用等特点。
技术实现要素：
本发明的目的是提供用于鉴定豌豆品种和纯度的核心ssr引物及试剂盒。
本发明的另一目的是提供上述核心ssr引物及试剂盒在快速鉴定豌豆品种和纯度中的应用。
为了实现本发明目的，本发明提供的用于鉴定豌豆品种和纯度的核心ssr引物，包括12对核心ssr引物，分别对应于表1中pea-1～pea-12，引物信息如下(seqidno:1-24)：
表112对核心ssr引物信息
本发明还提供含有所述12对核心ssr引物的检测试剂或试剂盒。
本发明还提供一种鉴定豌豆品种的方法，利用上述核心ssr引物，或检测试剂或试剂盒进行检测。
所述方法包括以下步骤：
1)提取待测豌豆的基因组dna；
2)以提取的dna为模板，分别利用每对核心ssr引物进行pcr扩增；
3)分析pcr扩增产物。
前述的方法，进行pcr扩增前，还包括对每对核心ssr引物进行荧光标记的步骤，例如，在引物对pea-1～pea-5、pea-7的上游引物5′端标记fam荧光基团，在pea-8～pea-12、pea-6的上游引物5′端标记hex荧光基团。
pcr反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性35s，54℃退火40s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸5min，10℃保温5min。
pcr扩增体系为：2×taqpcrmastermix5μl，2μm/μl上、下游引物各1μl，dna模板1.5μl，ddh2o2.5μl。
前述的方法，对pcr扩增产物进行荧光毛细管电泳检测，获得待测豌豆的ssr指纹图谱，与采用相同方法获得的已知豌豆品种的ssr指纹图谱进行比较，若指纹图谱完全一致，则判定该待测豌豆属于已知豌豆品种，若指纹图谱不一致，则判定该待测豌豆不同于已知豌豆品种。
本发明的豌豆品种包括但不限于科豌6号、中秦1号。
本发明还提供上述方法在鉴定豌豆品种纯度中的应用。
本发明进一步提供所述核心ssr引物，或所述检测试剂或试剂盒在豌豆分子标记辅助育种中的应用。
利用本发明的12对核心ssr引物，进行pcr扩增，并结合荧光pcr毛细管电泳检测技术，可在短时间内完成豌豆品种纯度鉴定工作，具有高效、准确、方便、鉴定结果不易受环境影响等优点。本发明可以从dna水平对豌豆品种纯度进行有效监控、保护作物品种，防止假冒伪劣品种进入市场，具有良好的应用前景。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例112对核心ssr引物的获得
从发明人自行构建的高质量豌豆遗传连锁图谱上选取504对ssr分子标记对全国代表性81份豌豆品种(品系)进行全基因组扫描，获得103对扩增效果好、多态性高、重复性好、稳定性强的ssr核心分子标记。以科豌6号豌豆品种的基因组为模板，对由发明人自主开发的103对豌豆荧光ssr核心标记进行筛选，获得12对重复性好、稳定性强的微核心ssr引物(表2)。
表212对微核心ssr标记信息
1、豌豆品种基因组dna提取
采用改良ctab法提取供试样品dna：取2g左右的新鲜幼嫩叶片，在液氮中研磨成粉末状装入2.0ml离心管中，放入-80℃冰箱保存待用；将预热到65℃的2×ctab提取液，按占溶液容量的1％的比例加入β-巯基乙醇，充分混匀；取出研磨好的叶片组织，每份样品中加入800μl预热后的ctab提取液，涡旋1-2min，65℃水浴1h(每15min上下颠倒轻翻一次，充分混匀)；水浴加热结束后，加入800μl氯仿/异戊醇(24：1)溶液于离心管中，混合15-20min，之后10000rpm离心15min；吸取600μl左右上清液移至新离心管(量可适当减少，但切不可接触蛋白质层)，后加入95％等体积乙醇，摇匀后于-20℃冰箱放置2h或者4℃冰箱过夜，保证充分沉淀；12000rpm离心10min，倒掉上清，保留沉淀；用90％乙醇500μl清洗白色沉淀，10000rpm离心5min，小心倒掉上清；室温风干，加入100μlddh2o充分溶解沉淀。利用nanodrop2000/2000c仪器检测样品dna浓度，将dna浓度稀释到50ng/μl，4℃保存备用。
2、以103对特异性荧光ssr分子标记分别对科豌6号品种的48份随机单株的基因组dna进行pcr扩增，反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性35s，54℃退火40s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸5min，10℃保温5min；
10μl扩增体系为：2×taqpcrmastermix5μl，2μm/μl的上、下游引物各1μl，dna模板1.5μl，ddh2o2.5μl。
3、pcr扩增产物进行荧光毛细管电泳检测，具体如下：
pcr产物样品准备及电泳分析结果
将fam(蓝色)和hex(绿色)荧光标记的pcr产物用超纯水稀释25倍，分别取等体积的上述2种稀释后溶液混合形成混合液，吸取1μl混合液、0.1μlliz500分子量内标和8.9μl去离子甲酰胺分别加入到dna分析仪专用深孔板孔中；然后将其在pcr仪上95℃变性5min，取出后立即置于碎冰上，冷却15min左右；瞬时离心10s，进行毛细管电泳检测，用genemapper进行图像分析和数据采集。以dnamarkeri为dna分子量标准，纯合位点的等位变异大小数据记录为x/x，其中x为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异数据记录为x/y，其中x、y为该位点上两个不同的等位变异；无效等位变异的大小记录为0/0(注：小片段在前，大片段在后)。通过对多个位点的数据整合及初步分析评价，获得12对特异性较好的微核心ssr标记，形成科豌6号品种不同单株间的ssr指纹图谱(表3)。
4、纯度分析
纯度结果通过统计，用具有本品种特异带型的种子粒数占检测样品种子粒数的百分率表示。
纯度％＝具有本品种特异带型的种子粒数/检测样品种子总粒数×100％
5、纯度结果
利用12对微核心ssr标记共检测出具有本品种特异带型的种子粒数为45，异带型株分别为科豌6号-34、科豌6号-41、科豌6号-48，按公式计算，科豌6号样品品种纯度为：45/48×100％＝93.75％
实施例2鉴定中秦1号豌豆品种纯度的方法
提取中秦1号品种48份随机单株的基因组dna，以实施例1筛选得到的12微核心ssr标记分子标记组合对待检豌豆品种的dna进行pcr扩增；参照实施例1的pcr反应体系，pcr反应程序，荧光毛细管电泳检测技术和变异位点记录方法，建立中秦1号48份随机单株的ssr指纹图谱(表4)，以验证本发明建立的鉴定方法可靠性。
纯度结果：利用12对微核心ssr标记共检测出具有本品种特异带型的种子粒数为46，异带型株分别为中秦1号-5、中秦1号-30，按公式计算，中秦1号样品品种纯度为：46/48×100％＝95.83％
结果表明，利用本发明的12微核心ssr标记组合对豌豆中秦1号品种48份随机单株基因组dna进行pcr扩增，测得纯度为95.83％。表明本发明筛选得到的12对引物组合同样可以用于中秦1号豌豆品种纯度鉴定。应用本发明提供的鉴别豌豆品种纯度的方法准确性较高，适合推广使用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>中国农业科学院作物科学研究所
<120>用于鉴定豌豆品种和纯度的核心ssr引物及试剂盒
<130>khp171115685.5
<160>24
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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<210>2
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