一种结构可控的多孔聚合物微球制备方法及其应用与流程

本发明涉及高分子材料技术与生物医用材料领域，具体涉及一种结构可控的多孔聚合物微球制备方法及其应用。

背景技术：

生物分子在临床治疗中的应用是近年来的一大研究热点。然而，大多数生物分子血浆半衰期短且生物利用度低，这使它难以被有效地用于临床。制备微米级或纳米级的聚合物微球作为生物分子载体，能实现生物分子的高效利用。载体可实现生物分子的可控释放，并能对不稳定的生物活性分子起到保护作用，避免其降解。可降解的天然高分子和合成高分子在药物控释领域都被广泛研究。在众多高分子中，聚乳酸-羟基乙酸(plga)具有良好的生物相容性且可自发地生物降解，因此它用于药物控释具有明显的优势。

单组分微球可以实现一类单个或多个生物分子的传递，并能对生物分子实现长效的控制释放，但是其对生物分子的释放曲线是类似的。这限制了其应用，因为组织和器官的再生通常是由不同的生物分子在不同生长期和成熟阶段对细胞的协同作用所驱动的。因此，为了使受损的、病变的及被移除的组织再生，需要设计并结合具有不同释放性能的微球实现不同生物分子的传递。改变聚合物的聚合度是调节微球释放曲线的最常用方法。控制聚合度不但需要精巧的合成技术，而且难以较为明显地改变释放速率。

近年来，各种乳液法制备的多孔聚合物微球在医疗保健领域有非常广泛的应用。这些方法可以制备出孔结构为开孔(快速释放)和闭合孔(缓慢释放)的聚合物微球，进而能有效地调节生物分子的释放速率。由于这两种不同孔结构的微球的释放性能是互补的，那么将两者结合起来实现不同生物分子的依次释放就是使组织器官再生的一种有效方法。然而，形成多孔结构的传统方法需要在制备乳化液过程中，嵌入和去除硬(软)模板(致孔剂)。这不仅使合成工艺变得复杂化，而且会破坏聚合物基质。除此之外，由于乳化液内部水与外部水的迅速聚集，很难直接制备闭合孔结构的多孔微球。因此，通常需要对开孔结构的多孔微球进行热处理或溶剂处理，才能使其表面孔闭合，进而制得闭合孔结构的微球。因此，开孔和闭孔多孔微球的结合通常需要多个步骤完成。为了便于实际生产和应用中制备大量的不同孔结构的多孔微球，就需要研究出更加简单可行的方法。

技术实现要素：

针对以上现有技术中的问题，本发明的目的在于提供一种简单的可一步完成的结构可控的多孔聚合物微球制备方法及其应用，该方法简单易行，反应经一步即可完成，可用于大规模生产，并且制备的微球可用于构筑生物医用材料，如凝胶贴片、支架材料，并将其用于皮肤修复及骨组织修复。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

一种结构可控的多孔聚合物微球制备方法，将环糊精溶液与聚乙二醇溶液混合后，加入到plga的二氯甲烷溶液中，超声得到水/油乳化液，将水/油乳化液加入到pva溶液中，超声得到水/油/水乳化液，将水/油/水乳化液在室温下搅拌后，水洗，冷冻干燥得到多孔聚合物微球。

本发明进一步的改进在于，环糊精溶液是将环糊精加入到水中制得，环糊精溶液的浓度为3～15mg/ml；环糊精为α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精中的任意一种；

聚乙二醇溶液是将聚乙二醇加入到水中制得，聚乙二醇溶液的浓度为50～150mg/ml；聚乙二醇的摩尔质量为2000～50000g；

plga的二氯甲烷溶液是将plga加入到二氯甲烷中制得，plga的二氯甲烷溶液的质量浓度为50～300mg/ml；

pva溶液是将pva加入到水中制得，pva溶液的质量浓度为5～20mg/ml；pva的摩尔质量为15000～120000g。

本发明进一步的改进在于，环糊精为α-环糊精。

本发明进一步的改进在于，超声的功率为10～100w，超声的时间为10～60s；搅拌的时间为1～48h；

环糊精、聚乙二醇、plga与pva的质量比为0.656:7.25:100:100。

本发明进一步的改进在于，搅拌的时间为3h。

本发明进一步的改进在于，搅拌的时间为24h。

一种多孔聚合物微球在制备用于修复皮肤的凝胶贴片中的应用。

本发明进一步的改进在于，用于修复皮肤的凝胶贴片的制备方法如下：

将环糊精溶液与聚乙二醇溶液混合后，加入到plga的二氯甲烷溶液中，超声得到水/油乳化液，将水/油乳化液加入到pva溶液中，超声得到水/油/水乳化液，将水/油/水乳化液在室温下搅拌3h后，水洗，冷冻干燥，得到闭孔结构的多孔聚合物微球；

将环糊精溶液与聚乙二醇溶液混合后，加入到plga的二氯甲烷溶液中，超声得到水/油乳化液，将水/油乳化液加入到pva溶液中，超声得到水/油/水乳化液，将水/油/水乳化液在室温下搅拌24h后，水洗，冷冻干燥，得到开孔结构的多孔聚合物微球；

分别取闭孔结构的多孔聚合物微球和开孔结构的多孔聚合物微球分散在海藻酸钠溶液中，然后均匀铺展在载玻片上，再将滴加氯化钙溶液，用另一块载玻片压制，得到凝胶贴片；其中，闭孔结构的多孔聚合物微球、开孔结构的多孔聚合物微球与海藻酸钠溶液的比为10mg：10mg：300μl。

本发明进一步的改进在于，用于修复皮肤的凝胶贴片的制备方法如下：

将环糊精溶液与聚乙二醇溶液混合后，加入到plga的二氯甲烷溶液中，超声得到水/油乳化液，将水/油乳化液加入到pva溶液中，超声得到水/油/水乳化液，将水/油/水乳化液在室温下搅拌3h后，水洗，冷冻干燥，得到闭孔结构的多孔聚合物微球；

将闭孔结构的多孔聚合物微球分散在去离子水中，加入白介素，在冰浴下搅拌24h后冻干燥，得到装载有白介素的微球；其中，闭孔结构的多孔聚合物微球、去离子水与白介素的比为20mg：5ml：10mg；

取上述装载有白介素的微球分散在海藻酸钠溶液中，然后均匀铺展在载玻片上，再滴加氯化钙溶液，用另一块载玻片压制30min，得到凝胶贴片；其中，装载有白介素的微球与海藻酸钠溶液的比为20mg：300μl。

本发明进一步的改进在于，将褪黑素溶于聚乙二醇溶液中，再与环糊精溶液混合均匀，加入到plga的二氯甲烷溶液中，超声，形成水/油乳化液；将上述水/油乳化液加入到pva溶液中，超声得到水/油/水乳化液，将此乳化液在室温下搅拌3h，水洗，冷冻干燥，得到含褪黑素的内部多孔的聚合物微球；其中，褪黑素与聚乙二醇的比为10mg：7.25mg；

取含褪黑素的内部多孔的聚合物微球分散在海藻酸钠溶液中，然后均匀铺展在载玻片上，再滴加氯化钙溶液，用另一块载玻片压制，得到凝胶贴片；其中，含褪黑素的内部多孔的聚合物微球与海藻酸钠溶液的比为20mg：300μl。

本发明进一步的改进在于，将环糊精溶液与聚乙二醇溶液混合后，加入到plga的二氯甲烷溶液中，超声得到水/油乳化液，将水/油乳化液加入到pva溶液中，超声得到水/油/水乳化液，将水/油/水乳化液在室温下搅拌3h后，水洗，冷冻干燥，得到闭孔结构的多孔聚合物微球；将闭孔结构的多孔聚合物微球分散在去离子水中，加入白介素，在冰浴下搅拌24h后冻干燥，得到装载有白介素的微球；其中，闭孔结构的多孔聚合物微球、去离子水与白介素的比为20mg：5ml：10mg；

将褪黑素溶于聚乙二醇溶液中，再与环糊精溶液混合均匀，加入到plga的二氯甲烷溶液中，超声，形成水/油乳化液；将上述水/油乳化液加入到pva溶液中，超声得到水/油/水乳化液，将此乳化液在室温下搅拌3h，水洗，冷冻干燥，得到含褪黑素的内部多孔的聚合物微球；其中，褪黑素与聚乙二醇的比为10mg：7.25mg；

分别将装载有白介素的微球与含褪黑素的内部多孔的聚合物微球分散在海藻酸钠溶液中，然后均匀铺展在载玻片上，再滴加氯化钙溶液，用另一块载玻片压制，得到凝胶贴片；其中，装载有白介素的微球、含褪黑素的内部多孔的聚合物微球与海藻酸钠溶液的比为10mg：10mg：300μl。

本发明进一步的改进在于，闭孔结构的多孔聚合物微球与开孔结构的多孔聚合物微球的总和、装载有白介素的微球以及含褪黑素的内部多孔的聚合物微球与海藻酸钠溶液的比为10mg～40mg：500μl。

本发明进一步的改进在于，海藻酸钠质量浓度为10～30mg/ml。

本发明进一步的改进在于，氯化钙浓度为0.2～0.8mol/l。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果：

1.本发明采用的聚合物微球基质plga(聚乳酸-羟基乙酸)，来源广泛，生物相容性好，可降解，且降解产物无毒，适用于生物医学领域中，本发明以plga作为多孔微球基底，结合双乳化法与溶胶-凝胶法，通过控制乳化液熟化时间，经过一步反应制备出了具有不同孔结构的多孔微球，并且制得的多孔聚合物微球粒度是微米级，平均粒径为2～5μm，分散度和球形度均好。本发明中搅拌的时间长短可以控制多孔聚合物微球的孔结构，搅拌时间短的话，微球表面没有孔，搅拌时间长的话，微球表面有孔。

2.本发明采用双乳化法与溶胶凝胶法相结合的方法，通过控制乳化液熟化时间，仅用一步反应就制备出了具有不同孔结构的多孔聚合物微球，制备方法简单，易于实现工业化生产。

3.本发明反应周期短，产率高，能有效提高工作效率。

4.本发明在操作过程中不产生有机废液，是一种绿色环保的制备方法。

5.本发明无需用到大型昂贵的仪器设备，生产成本低。

6.本发明制备的不同结构的多孔微球有许多用途，如作为生物分子载体用于组织器官的再生，作为抗菌药物载体以提高抗菌药物的抗菌能力等等。在生物医用材料构筑方面的应用，如制备用于皮肤修复的凝胶贴片，对于皮肤修复有较好的效果。

附图说明

图1是实施例2提供的闭合孔结构的多孔微球。

图2为图1中的局部放大图。

图3是实施例4提供的开孔结构的多孔微球。

图4为图3中的局部放大图。

图5是实施例11与实施例12提供的闭合孔结构的多孔微球和开孔结构的多孔微球对fitc-bsa的释放曲线。

图6是实施例17提供的小鼠伤口愈合情况图。

图7是实施例17提供的小鼠创伤面愈合率统计图。

图8是实施例17提供的吞噬细胞迁移分化的效果图。

图9是实施例17提供的cd206阳性巨噬细胞数量统计图。

图10是实施例17提供的血管内皮生长因子(vegf)数量统计值。

图11是实施例17提供的血管紧张素ⅱ(angⅱ)数量统计值。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但不限于此。

本发明涉及一步法制备不同结构的聚合物微球及以此聚合物微球为基础的生物医用材料的构筑和应用。

一种结构可控的多孔聚合物微球制备方法，将环糊精加入到水中，得到环糊精溶液，将聚乙二醇(peg)加入到水中，得到聚乙二醇溶液，将环糊精溶液与聚乙二醇溶液混合后，加入到plga(聚乳酸-羟基乙酸)的二氯甲烷溶液中，超声得到水/油乳化液，将水/油乳化液加入到聚乙烯醇(pva)的溶液中，在10～100w下超声10～60s，得到水/油/水乳化液，将水/油/水乳化液在室温下搅拌1～48h后，水洗3～5次，冷冻干燥，得到多孔聚合物微球。

所述的环糊精为α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精中的任意一种。

优选的，所述的环糊精为α-环糊精。环糊精溶液的浓度为3～10mg/ml。

所述的聚乙二醇(peg)摩尔质量为2000～50000g，聚乙二醇溶液的浓度为50～90mg/ml。

所述的plga的二氯甲烷溶液的质量浓度为5％～30％。

所述的pva摩尔质量为15000～120000g，聚乙烯醇的溶液的质量浓度为0.5％～2％。

本发明制得的多孔聚合物微球粒度是微米级，平均粒径为2～5μm。分散度和球形度均好。

本发明的实施例1-17中使用的plga摩尔质量为64000g，乳酸/羟基乙酸＝50/50；使用的pva摩尔质量为25000g，醇解度为88％；peg摩尔质量为2000g，环糊精为α-环糊精。

实施例1

称取100mg的plga溶于1ml二氯甲烷中，配制10％(w/v)的plga的二氯甲烷溶液。称取13.12mgα-环糊精溶于1ml水中，配制13.12mg/ml的α-环糊精溶液；称取145mgpeg-2000溶于1ml水中，配制145mg/ml的peg溶液。取2gpva溶于200ml水中，配制1％(w/v)的pva溶液。

取50μl13.12mg/ml的α-环糊精溶液与50μl145mg/ml的peg溶液混合均匀，加入到1ml10％(w/v)的plga的二氯甲烷溶液中，以15w功率超声20s，形成水/油乳化液；将上述水/油乳化液加入到10ml1％(w/v)的pva溶液中，超声得到水/油/水乳化液。将此乳化液在室温下200～600r/min缓慢搅拌1h，水洗3次，冷冻干燥，得到多孔聚合物微球。此条件下得到的微球表面无孔而内部有孔，内部孔较少且孔分散不均匀。

实施例2

称取100mg的plga溶于1ml二氯甲烷中，配制10％(w/v)的plga的二氯甲烷溶液。称取13.12mgα-环糊精溶于1ml水中，配制13.12mg/ml的α-环糊精溶液；称取145mgpeg-2000溶于1ml水中，配制145mg/ml的peg溶液。取2gpva溶于200ml水中，配制1％(w/v)的pva溶液。

取50μl13.12mg/ml的α-环糊精溶液与50μl145mg/ml的peg溶液混合均匀，加入到1ml10％(w/v)的plga的二氯甲烷溶液中，以15w功率超声20s，形成水/油乳化液；将上述水/油乳化液加入到10ml1％(w/v)的pva溶液中，超声得到水/油/水乳化液。将此乳化液在室温下200～600r/min下缓慢搅拌3h，水洗3次，冷冻干燥，即得到多孔聚合物微球。微球的扫描电镜如图1和图2。由图1和图2可知乳化液熟化3h得到的微球表面无孔而内部有孔，即为闭孔结构，微球粒径在5μm左右。

实施例3

称取100mg的plga溶于1ml二氯甲烷中，配制10％(w/v)的plga的二氯甲烷溶液。称取13.12mgα-环糊精溶于1ml水中，配制13.12mg/ml的α-环糊精溶液；称取145mgpeg-2000溶于1ml水中，配制145mg/ml的peg溶液。取2gpva溶于200ml水中，配制1％(w/v)的pva的二氯甲烷溶液。

取50μl13.12mg/ml的α-环糊精溶液与50μl145mg/ml的peg溶液混合均匀，加入到1ml10％(w/v)的plga溶液中，以15w功率超声20s，形成水/油乳化液；将上述水/油乳化液加入到10ml1％(w/v)的pva溶液中，超声得到水/油/水乳化液。将此乳化液在室温下200～600r/min下缓慢搅拌12h，水洗3次，冷冻干燥，得到多孔聚合物微球。此条件下得到的微球表面无孔而内部有孔，孔径较大。

实施例4

称取100mg的plga溶于1ml二氯甲烷中，配制10％(w/v)的plga的二氯甲烷溶液。称取13.12mgα-环糊精溶于1ml水中，配制13.12mg/ml的α-环糊精溶液；称取145mgpeg-2000溶于1ml水中，配制145mg/ml的peg溶液。取2gpva溶于200ml水中，配制1％(w/v)的pva的二氯甲烷溶液。

取50μl13.12mg/ml的α-环糊精溶液与50μl145mg/ml的peg溶液混合均匀，加入到1ml10％(w/v)的plga溶液中，以15w功率超声20s，形成水/油乳化液；将上述水/油乳化液加入到10ml1％(w/v)的pva溶液中，超声得到水/油/水乳化液。将此乳化液在室温下200～600r/min下缓慢搅拌24h，水洗3次，冷冻干燥，即得到多孔聚合物微球。微球的扫描电镜如图3和图4。由图3和图4可知，乳化液熟化24h得到的微球为开孔结构，即微球表面与内部都有孔，微球粒径在5μm左右。

实施例5

称取100mg的plga溶于1ml二氯甲烷中，配制10％(w/v)的plga的二氯甲烷溶液。称取13.12mgα-环糊精溶于1ml水中，配制13.12mg/ml的α-环糊精溶液；称取145mgpeg-2000溶于1ml水中，配制145mg/ml的peg溶液。取2gpva溶于200ml水中，配制1％(w/v)的pva的二氯甲烷溶液。

取50μl13.12mg/ml的α-环糊精溶液与50μl145mg/ml的peg溶液混合均匀，加入到1ml10％(w/v)的plga溶液中，以15w功率超声20s，形成水/油乳化液；将上述水/油乳化液加入到10ml1％(w/v)的pva溶液中，超声得到水/油/水乳化液。将此乳化液在室温下200～600r/min下缓慢搅拌36h，水洗3次，冷冻干燥，得到多孔聚合物微球。

实施例6

称取100mg的plga溶于1ml二氯甲烷中，配制10％(w/v)的plga的二氯甲烷溶液。称取13.12mgα-环糊精溶于1ml水中，配制13.12mg/ml的α-环糊精溶液；称取145mgpeg-2000溶于1ml水中，配制145mg/ml的peg溶液。取2gpva溶于200ml水中，配制1％(w/v)的pva的二氯甲烷溶液。

取50μl13.12mg/ml的α-环糊精溶液与50μl145mg/ml的peg溶液混合均匀，加入到1ml10％(w/v)的plga溶液中，以15w功率超声20s，形成水/油乳化液；将上述水/油乳化液加入到10ml1％(w/v)的pva溶液中，超声得到水/油/水乳化液。将此乳化液在室温下200-600r/min下缓慢搅拌48h，水洗3次，冷冻干燥，得到多孔聚合物微球。

实施例7

称取25mg的plga溶于1ml二氯甲烷中，配制2.5％(w/v)的plga的二氯甲烷溶液。称取13.12mgα-环糊精溶于1ml水中，配制13.12mg/ml的α-环糊精溶液；称取145mgpeg-2000溶于1ml水中，配制145mg/ml的peg溶液。取2gpva溶于200ml水中，配制1％(w/v)的pva溶液。

取50μl13.12mg/ml的α-环糊精溶液与50μl145mg/ml的peg溶液混合均匀，加入到1ml10％(w/v)的plga的二氯甲烷溶液中，以15w功率超声20s，形成水/油乳化液；将上述水/油乳化液加入到10ml1％的pva溶液中，超声得到水/油/水乳化液。将此乳化液在室温下200～600r/min下缓慢搅拌3h，水洗3次，冷冻干燥，即得到多孔聚合物微球。

实施例8

称取25mg的plga溶于1ml二氯甲烷中，配制2.5％(w/v)的plga的二氯甲烷溶液。称取13.12mgα-环糊精溶于1ml水中，配制13.12mg/ml的α-环糊精溶液；称取145mgpeg-2000溶于1ml水中，配制145mg/ml的peg溶液。取2gpva溶于200ml水中，配制1％(w/v)的pva溶液。

取50μl13.12mg/ml的α-环糊精溶液与50μl145mg/ml的peg溶液混合均匀，加入到1ml10％(w/v)的plga的二氯甲烷溶液中，以15w功率超声20s，形成水/油乳化液；将上述水/油乳化液加入到10ml1％(w/v)的pva溶液中，超声得到水/油/水乳化液。将此乳化液在室温下200～600r/min下缓慢搅拌24h，水洗3次，冷冻干燥，即得到多孔聚合物微球。

实施例9

称取100mg的plga溶于1ml二氯甲烷中，配制10％(w/v)的plga的二氯甲烷溶液。称取13.12mgα-环糊精溶于1ml水中，配制13.12mg/ml的α-环糊精溶液；称取145mgpeg-2000溶于1ml水中，配制145mg/ml的peg溶液。取2gpva溶于200ml水中，配制1％(w/v)的pva溶液。

取50μl13.12mg/ml的α-环糊精溶液与50μl145mg/ml的peg的二氯甲烷溶液混合均匀，加入到1ml10％(w/v)的plga溶液中，以50w功率超声20s，形成水/油乳化液；将上述水/油乳化液加入到10ml1％(w/v)的pva溶液中，超声得到水/油/水乳化液。将此乳化液在室温下200～600r/min下缓慢搅拌3h，水洗3次，冷冻干燥，即得到多孔聚合物微球。

实施例10

称取100mg的plga溶于1ml二氯甲烷中，配制10％(w/v)的plga的二氯甲烷溶液。称取13.12mgα-环糊精溶于1ml水中，配制13.12mg/ml的α-环糊精溶液；称取145mgpeg-2000溶于1ml水中，配制145mg/ml的peg溶液。取2gpva溶于200ml水中，配制1％(w/v)的pva溶液。

取50μl13.12mg/ml的α-环糊精溶液与50μl145mg/ml的peg溶液混合均匀，加入到1ml10％(w/v)的plga的二氯甲烷溶液中，以50w功率超声20s，形成水/油乳化液；将上述水/油乳化液加入到10ml1％(w/v)的pva溶液中，超声得到水/油/水乳化液。将此乳化液在室温下200-600r/min下缓慢搅拌24h，水洗3次，冷冻干燥，即得到多孔聚合物微球。

实施例11闭孔结构的多孔微球的长效释放能力测试：

称取100mg的plga溶于1ml二氯甲烷中，配制10％(w/v)的plga的二氯甲烷溶液。称取13.12mgα-环糊精溶于1ml水中，配制13.12mg/ml的α-环糊精溶液；称取145mgpeg-2000溶于1ml水中，配制145mg/ml的peg溶液。取2gpva溶于200ml水中，配制1％(w/v)的pva溶液。

取5mg异硫氰酸荧光素标记的牛血清蛋白(fitc-bsa)溶于50μl145mg/ml的peg溶液，再与50μl13.12mg/ml的α-环糊精溶液混合均匀，加入到1ml10％(w/v)的plga的二氯甲烷溶液中，以15w功率超声20s，形成水/油乳化液；将上述水/油乳化液加入到10ml1％(w/v)的pva溶液中，超声得到水/油/水乳化液。将此乳化液在室温下缓慢搅拌3h，水洗3次，冷冻干燥，即得到多孔聚合物微球。

取10mg微球分散在5mlph＝7.4的磷酸盐缓冲液(pbs)中，在第0，1，3……30天，取出2ml，离心，测上清液的荧光强度。从图5的测试结果表明，在第25天时，微球释放了fitc-bsa总量的90％。这说明此法制备的闭孔结构的多孔微球具有长效释放能力。

实施例12开孔结构的多孔微球的长效释放能力测试：

称取100mg的plga溶于1ml二氯甲烷中，配制10％(w/v)的plga的二氯甲烷溶液。称取13.12mgα-环糊精溶于1ml水中，配制成13.12mg/ml的α-环糊精溶液；称取145mgpeg-2000溶于1ml水中，配制145mg/ml的peg溶液。取2gpva溶于200ml水中，配制1％(w/v)的pva溶液。

取50μl13.12mg/ml的α-环糊精溶液与50μl145mg/ml的peg溶液混合均匀，加入到1ml10％(w/v)的plga的二氯甲烷溶液中，以15w功率超声20s，形成水/油乳化液；将上述水/油乳化液加入到10ml1％(w/v)的pva溶液中，超声得到水/油/水乳化液。将此乳化液在室温下200-600r/min下缓慢搅拌24h，水洗3次，分散在5ml水中，加入5mgfitc-bsa(异硫氰酸标记的牛血清蛋白)，搅拌24h，离心，重新分散在水中，冷冻干燥，得到开孔结构的微球。取10mg开孔结构的微球分散在5mlph＝7.4的pbs缓冲液中，在第0，1，3，5，7天取出2ml离心，并将上清液测荧光，测试后再将上清液与离心后的固体超声后再放入到pbs缓冲液中。由图5的分析结果可知，在第5天时，微球释放量达到了总量的90％。

由此可见，本方法制备的两种不同孔结构的多孔微球具有不同的释放性能。

实施例13

取6mg海藻酸钠溶解在300μl去离子水中，分别取实施例2和实施例4中制备的微球各10mg，将其分散在海藻酸钠溶液中。将上述分散液均匀铺展在载玻片上，再将300μl0.5mol/l的氯化钙溶液滴加于其上，用另一块载玻片轻轻压制30min，得到凝胶贴片1。将此整块的凝胶贴片裁割为直径约50dm的圆形贴片，备用。

实施例14

将实施例2中制备的微球分散在5ml去离子水中，加入10mg白介素(il-4)，在冰浴下搅拌24h后冻干燥，得到装载有白介素的微球，备用。

取6mg海藻酸钠溶解在300μl去离子水中，取20mg上述装载有白介素的微球分散在此海藻酸钠溶液中。将此分散液均匀铺展在载玻片上，再将300μl0.5mol/l的氯化钙溶液滴加于其上，用另一块载玻片轻轻压制30min，得到凝胶贴片2。将此整块的凝胶贴片裁割为直径约50dm的圆形贴片，备用。

实施例15

称取100mg的plga溶于1ml二氯甲烷中，配制10％(w/v)的plga的二氯甲烷溶液。称取13.12mgα-环糊精溶于1ml水中，配制13.12mg/ml的α-环糊精溶液；称取145mgpeg-2000溶于1ml水中，配制145mg/ml的peg溶液。取2gpva溶于200ml水中，配制1％(w/v)的pva溶液。

取10mg褪黑素溶于50μl145mg/ml的peg溶液，再与50μl13.12mg/ml的α-环糊精溶液混合均匀，加入到1ml10％(w/v)的plga的二氯甲烷溶液中，以15w功率超声20s，形成水/油乳化液；将上述水/油乳化液加入到10ml1％(w/v)的pva溶液中，超声得到水/油/水乳化液。将此乳化液在室温下200-600r/min下缓慢搅拌3h，水洗3次，冷冻干燥，即得到含褪黑素的内部多孔的聚合物微球。

取6mg海藻酸钠溶解在300μl去离子水中，取20mg含褪黑素的内部多孔的聚合物微球分散在此海藻酸钠溶液中。将此分散液均匀铺展在载玻片上，再将一定体积0.5mol/l的氯化钙溶液滴加于其上，用另一块载玻片轻轻压制30min，得到凝胶贴片3。将此整块的凝胶贴片裁割为直径约50dm的圆形贴片，备用。

实施例16

取6mg海藻酸钠溶解在300μl去离子水中，分别取实施例14与实施例15中装有白介素和褪黑素的微球各10mg，将其全部分散在海藻酸钠溶液中。将上述分散液均匀铺展在载玻片上，再将一定体积0.5mol/l的氯化钙溶液滴加于其上，用另一块载玻片轻轻压制30min，得到凝胶贴片4。将此整块的凝胶贴片裁割为直径约50dm的圆形贴片，备用。

实施例17

分别取实施例13、14、15、16中的凝胶贴片1、凝胶贴片2、凝胶贴片3和凝胶贴片4处理小鼠伤口，拍照记录小鼠的伤口愈合情况，并计算其愈合率。结果如图6和图7所示。图4结果表明，用实施例16的凝胶贴片处理小鼠伤口后，小鼠伤口愈合情况最好，即在il-4与褪黑素的共同作用下，小鼠伤口愈合效果最好。在处理小鼠伤口7天后，检测其m2阳性巨噬细胞数量，检测结果如图8和图9所示。结果表明，il-4对促进巨噬细胞向m2阳性巨噬细胞分化起主要作用。并在7天后检测血管内皮生长因子(vegf)与血管紧张素ⅱ(angⅱ)含量,检测结果如图10和图11所示。结果表明褪黑素对于促进血管形成起到主要作用。

本发明制得的不同孔结构的多孔聚合物微球可用于装载不同种类的生物分子。实施例16将这两种微球结合起来作为生物分子载体，既能对其起到保护作用，又可以选择性地释放出组织和器官再生不同阶段所需要的生物分子。

实施例18

环糊精溶液是将环糊精加入到水中制得，环糊精溶液的浓度为3mg/ml；其中，环糊精为γ-环糊精；

聚乙二醇溶液是将聚乙二醇加入到水中制得，聚乙二醇溶液的浓度为50mg/ml；聚乙二醇的摩尔质量为2000g；

plga的二氯甲烷溶液是将plga加入到二氯甲烷中制得，plga的二氯甲烷溶液的浓度为50mg/ml。

pva溶液是将pva加入到水中制得，pva溶液的质量浓度为5mg/ml；pva的摩尔质量为120000g。

将环糊精溶液与聚乙二醇溶液混合后，加入到plga的二氯甲烷溶液中，超声得到水/油乳化液，将水/油乳化液加入到pva溶液中，10w下超声60s得到水/油/水乳化液，将水/油/水乳化液在室温下搅拌3h后，水洗，冷冻干燥得到多孔聚合物微球；其中，环糊精、聚乙二醇、plga与pva的质量比为0.656:7.25:100:100。

实施例19

环糊精溶液是将环糊精加入到水中制得，环糊精溶液的浓度为15mg/ml；其中，环糊精为β-环糊精；

聚乙二醇溶液是将聚乙二醇加入到水中制得，聚乙二醇溶液的浓度为150mg/ml；聚乙二醇的摩尔质量为10000g；

plga的二氯甲烷溶液是将plga加入到二氯甲烷中制得，plga的二氯甲烷溶液的浓度为200mg/ml。

pva溶液是将pva加入到水中制得，pva溶液的质量浓度为20mg/ml；pva的摩尔质量为75000g。

将环糊精溶液与聚乙二醇溶液混合后，加入到plga的二氯甲烷溶液中，超声得到水/油乳化液，将水/油乳化液加入到pva溶液中，100w下超声10s得到水/油/水乳化液，将水/油/水乳化液在室温下搅拌24h后，水洗，冷冻干燥得到多孔聚合物微球；其中，环糊精、聚乙二醇、plga与pva的质量比为0.656:7.25:100:100。

实施例20

环糊精溶液是将环糊精加入到水中制得，环糊精溶液的浓度为8mg/ml；其中，环糊精为γ-环糊精；

聚乙二醇溶液是将聚乙二醇加入到水中制得，聚乙二醇溶液的浓度为100mg/ml；聚乙二醇的摩尔质量为50000g；

plga的二氯甲烷溶液是将plga加入到二氯甲烷中制得，plga的二氯甲烷溶液的浓度为300mg/ml。

pva溶液是将pva加入到水中制得，pva溶液的质量浓度为15mg/ml；pva的摩尔质量为15000g。

将环糊精溶液与聚乙二醇溶液混合后，加入到plga的二氯甲烷溶液中，超声得到水/油乳化液，将水/油乳化液加入到pva溶液中，50w下超声30s得到水/油/水乳化液，将水/油/水乳化液在室温下搅拌8h后，水洗，冷冻干燥得到多孔聚合物微球；其中，环糊精、聚乙二醇、plga与pva的质量比为0.656:7.25:100:100。

本发明中闭孔结构的多孔聚合物微球与开孔结构的多孔聚合物微球的总和、装载有白介素的微球以及含褪黑素的内部多孔的聚合物微球与海藻酸钠溶液的比可以为10mg～40mg：500μl，本发明中仅以10mg：500μl为例进行说明。本发明中海藻酸钠浓度可以为10～30mg/ml，本发明中仅以20mg/ml为例进行说明。本发明中氯化钙浓度可以为0.2～0.8mol/l，本发明中仅以0.5mol/l为例进行说明。