汉坦病毒的RT‑PCR定量检测方法与流程

本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种汉坦病毒的rt-pcr定量检测方法。

背景技术：

我国是肾综合征出血热(hfrs)危害最为严重的国家，是由汉坦病毒感染引起。临床研究证实，“早发现、早休息、早治疗、就近治疗”是hfrs预后好坏的决定因素，必须把一切治疗措施立足点放在“早”上。因此，对病人的早期诊断对hfrs的治疗具有重要意义。传统的血清学方法，虽特异性强、敏感性高，但对hfrs的早期诊断还有一定局限性。采用病毒分离法，虽可提供病毒感染的直接证据，但由于汉坦病毒是较难分离的病毒，且分离的周期长，成功率不高，显然不适于临床快速诊断。病人感染汉坦病毒后，病毒随血液及白细胞散布全身，在各脏器组织中增殖，又将病毒颗粒释放到血液中，因此在发热期病人的外周血白细胞、血清、尿液，以及一些组织细胞中，均可检测到病毒抗原或病毒汉坦病毒。

人体的汉坦病毒载量与病理损伤之间有密切的关系，因此，对hfrs病人进行汉坦病毒定量研究，不仅对疾病的诊断和治疗有着重要的意义，并且对疾病的预后、流行病学调查等防治实践也有极为重要的意义。

应用rt-pcr技术可以在感染早期从病人血标本中检出汉坦病毒核酸，是较为理想的诊断方法。已知汉坦病毒的基因有l、m、s等3个片段构成，血清学研究表明，s片段编码的衣壳蛋白无论在抗原性还是遗传性方面都更为保守，具有很强的抗原性和免疫原性，然而现有技术中针对以s基因进行rt-pcr定性和定量检测汉坦病毒的技术较少，难以保证快速的定量检测，同时又存在灵敏度不够高的缺点，由此可见，能否基于现有技术中的不足，提供一种灵敏度更高，且能定量检测汉坦病毒的rt-pcr方法，成为本领域技术人员亟待解决的技术难题。

技术实现要素：

本发明针对上述技术问题，提出一种汉坦病毒的rt-pcr定量检测方法。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种汉坦病毒的rt-pcr定量检测方法，包括以下步骤：

步骤一：取汉坦病毒的s基因序列设计pcr扩增引物和探针，所述pcr扩增引物的上游引物如seqidno.1所示，下游引物如seqidno.2所示，引物探针如seqidno.3所示；

步骤二：取汉坦病毒以cos-1细胞作为宿主细胞并提取rna，取模板rna经逆转录后得到cdna产物，对cdna产物的s基因片段进行pcr扩增，所述pcr扩增的反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30秒，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min；所述cdna产物进行pcr扩增的反应体系包括：cdna产物、taqdna聚合酶、tris-hcl、kcl、mgcl2、dntps和步骤一所述pcr扩增引物；将pcr扩增产物连接至pmd18-t载体中，构建重组质粒并抽提，确定抽提的重组质粒的拷贝数，经稀释后获取多个以拷贝数为单位的浓度的标准品，取多个所述标准品采用实时荧光定量pcr程序进行扩增，所述实时荧光定量pcr程序的pcr扩增反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30秒，72℃延伸30s，45个循环；所述实时荧光定量pcr程序的pcr扩增反应体系包括：扩增基因、缓冲剂、mgcl2、脱氧核糖核苷三磷酸、taqdna聚合酶、水、步骤一所述pcr扩增引物和引物探针；经荧光检测得到ct值，以ct值和标准品的浓度值为坐标建立标准曲线；

步骤三：提取待测样品的rna，取模板rna经逆转录后采用实时荧光定量pcr程序对其进行扩增，经荧光检测得到待测样品的ct值，基于步骤二的标准曲线获取待测样品的汉坦病毒拷贝数。

作为优选：所述探针5’端所标记荧光基团为fam，3’端连接的淬灭基团为tamara。

作为优选：所述cdna产物进行pcr扩增的反应体系包括：5μlcdna产物、1utaqdna聚合酶、10mmtris-hcl、50mmkcl、1.5mmmgcl2、0.5mmdntps和步骤一所述10pmol上游引物、10pmol下游引物。作为优选：所述实时荧光定量pcr程序的pcr扩增反应体系包括：1μl扩增基因、1μl缓冲剂、3μlmgcl2、1μl浓度10mm的脱氧核糖核苷三磷酸、0.5μl浓度20pmol/μltaqdna聚合酶、33.5μl水、0.8μl的上游引物、0.8μl的下游引物和0.4μl的引物探针。其中所述扩增基因包括标准品和待测样品。

作为优选：所述步骤二中汉坦病毒以cos-1细胞作为宿主细胞并提取rna的方法包括以下步骤：取cos-1细胞置于离心管中，依次加入trizol、氯仿，混合均匀后，经离心处理，取上层液体，加入异丙醇，经混合、静止后离心处理，倒去上清液加入75％乙醇，颠倒洗涤，除去液体，加入depc-h2o溶解rna。

作为优选：所述逆转录的方法包括以下步骤：取模板rna和oligo进行反应，反应结束后静置并冷却，依次加入rnas-freeh2o、5倍浓度的m-mlv缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、核糖核酸酶抑制因子和逆转录酶。

作为优选：所述步骤二中构建重组质粒并抽提的方法包括以下步骤：向所述pcr扩增产物连接至pmd18-t载体的连接产物中加入感受态大肠杆菌，培养至氨苄霉素抗性克隆长出，挑取单克隆至添加有氨苄霉素的lb培养基板中培养，挑选出鉴定为阳性克隆的菌株经测序后得到重组质粒。

作为优选：所述步骤二中，对抽提的所述重组质粒进行测序验证，用紫外分光光度计测定a260/280值，计算重组质粒的浓度，并换算为拷贝数。

作为优选：所述重组质粒经稀释后分别得到浓度为1×10⁷拷贝数/μl的标准品、1×10⁶拷贝数/μl的标准品、1×10⁵拷贝数/μl的标准品和1×10⁴拷贝数/μl的标准品。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

本发明的一种汉坦病毒的rt-pcr定量检测方法建立标准曲线，应用实时荧光定量(rt-pcr)技术对汉坦病毒进行定量测定，建立起敏感特异的检测汉坦病毒载量的方法，结合其临床表现，分析病毒载量与病理损伤之间的关系，不仅可以判断疾病严重程度及预后，并且可以客观评价抗病毒治疗的效果，为临床治疗提供依据。本发明具有操作简单、反应时间短、成本低等优点，特别适用于在临床及科研学研究中的开展。

附图说明

图1为本发明实施例实时荧光定量pcr扩增曲线；

图2为本发明实施例实时荧光定量pcr标准曲线；

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种汉坦病毒的rt-pcr定量检测方法，包括以下步骤：

步骤一：取汉坦病毒的s基因序列设计pcr扩增引物和探针，所述pcr扩增引物的上游引物如seqidno.1所示，下游引物如seqidno.2所示，引物探针如seqidno.3所示；

步骤二：取汉坦病毒以cos-1细胞作为宿主细胞并提取rna，取模板rna经逆转录后得到cdna产物，对cdna产物的s基因片段进行pcr扩增，所述pcr扩增的反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30秒，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min；所述cdna产物进行pcr扩增的反应体系包括：cdna产物、taqdna聚合酶、tris-hcl、kcl、mgcl2、dntps和步骤一所述pcr扩增引物；将pcr扩增产物连接至pmd18-t载体中，构建重组质粒并抽提，确定抽提的重组质粒的拷贝数，经稀释后获取多个以拷贝数为单位的浓度的标准品，取多个所述标准品采用实时荧光定量pcr程序进行扩增，所述实时荧光定量pcr程序的pcr扩增反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30秒，72℃延伸30s，45个循环；所述实时荧光定量pcr程序的pcr扩增反应体系包括：扩增基因、缓冲剂、mgcl2、脱氧核糖核苷三磷酸、taqdna聚合酶、水、步骤一所述pcr扩增引物和引物探针；经荧光检测得到ct值，以ct值和标准品的浓度值为坐标建立标准曲线；

步骤三：提取待测样品的rna，取模板rna经逆转录后采用实时荧光定量pcr程序对其进行扩增，经荧光检测得到待测样品的ct值，基于步骤二的标准曲线获取待测样品的汉坦病毒拷贝数。

在一可选实施例中：所述探针5’端所标记荧光基团为fam，3’端连接的淬灭基团为tamara。

在一可选实施例中：所述cdna产物进行pcr扩增的反应体系包括：5μlcdna产物、1utaqdna聚合酶、10mmtris-hcl、50mmkcl、1.5mmmgcl2、0.5mmdntps和步骤一所述10pmol上游引物、10pmol下游引物。

在一可选实施例中：所述实时荧光定量pcr程序的pcr扩增反应体系包括：1μl扩增基因、1μl缓冲剂、3μlmgcl2、1μl浓度10mm的脱氧核糖核苷三磷酸、0.5μl浓度20pmol/μltaqdna聚合酶、33.5μl水、0.8μl的上游引物、0.8μl的下游引物和0.4μl的引物探针。

在一可选实施例中：所述步骤二中汉坦病毒以cos-1细胞作为宿主细胞并提取rna的方法包括以下步骤：取cos-1细胞置于离心管中，依次加入trizol、氯仿，混合均匀后，经离心处理，取上层液体，加入异丙醇，经混合、静止后离心处理，倒去上清液加入75％乙醇，颠倒洗涤，除去液体，加入depc-h2o溶解rna。

在一可选实施例中：所述逆转录的方法包括以下步骤：取模板rna和oligo进行反应，反应结束后静置并冷却，依次加入rnas-freeh2o、5倍浓度的m-mlv缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、核糖核酸酶抑制因子和逆转录酶。

在一可选实施例中：所述步骤二中构建重组质粒并抽提的方法包括以下步骤：向所述pcr扩增产物连接至pmd18-t载体的连接产物中加入感受态大肠杆菌，培养至氨苄霉素抗性克隆长出，挑取单克隆至添加有氨苄霉素的lb培养基板中培养，挑选出鉴定为阳性克隆的菌株经测序后得到重组质粒。

在一可选实施例中：所述步骤二中，对抽提的所述重组质粒进行测序验证，用紫外分光光度计测定a260/280值，计算重组质粒的浓度，并换算为拷贝数。

在一可选实施例中：所述重组质粒经稀释后分别得到浓度为1×10⁷拷贝数/μl的标准品、1×10⁶拷贝数/μl的标准品、1×10⁵拷贝数/μl的标准品和1×10⁴拷贝数/μl的标准品。

为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的一种汉坦病毒的rt-pcr定量检测方法，下面将结合具体实施例进行描述。

实施例1：

1、荧光定量pcr引物和探针设计：

根据汉坦病毒76-118株m14626的s基因序列设计一对pcr扩增引物和引物探针，所述pcr扩增引物和引物探针均由上海英骏生物技术有限公司合成，所述汉坦病毒76-118株m14626由青岛市疾病预防控制中心直接获取得到。所述pcr扩增引物的上游引物如seqidno.1所示，下游引物如seqidno.2所示，引物探针如seqidno.3所示。

2、感染汉坦病毒76-118株的cos-1传代培养的细胞进行rna抽提：

取传代细胞离心后置于离心管中，加入300μltrizol，再加入100μl氯仿，混匀器上震荡混匀5秒或颠倒混匀15次；13000rpm离心15分钟，吸取上层液体，加入等体积异丙醇，颠倒混匀室温静置10分钟，13000rpm离心10分钟，轻轻倒去上清；加入700μl75％乙醇，颠倒洗涤，13000rpm离心5分钟，轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，弃尽液体或4000rpm离心5秒，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量吸干液体，加入20μldepc-h2o溶解rna，得到模板rna。

3、细胞rna提取产物进行逆转录：

分别测量rna标本在260nm和280nm波长下的吸光度值od260和od280，通过计算od260/od280，确定rna纯度，结果显示所有rna标本od260/od280≥1.9，表明rna纯度较高，无dna和蛋白质污染；同时读取并记录各个rna样本浓度，取50ng进行rt-pcr反应，具体步骤如下：

反应管内先加入50ng模板rna和oligo(dt)，70℃，5分钟。立即置于冰上，使其迅速冷却。依次加入rnas-freeh2o，m-mlvrt5xbuffer，dntp，ribonucleaseinhibitor和m-mlvreverse，42℃1小时。95℃5分钟，然后立即冰浴，得到的产物即为逆转录cdna产物。

4、cdna产物的s基因片段的pcr反应：

上述反应cdna产物5μl，加入总体积50μl的反应体系中，其中含1utaqdna聚合酶(fermentas)、10mmtris-hcl(ph8.8)、50mmkcl、1.5mmmgcl2、0.5mmdntps和特异性引物(上下游引物)各10pmol。充分混匀后，放入pcr扩增仪反应。反应条件:94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30秒，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min。

5、pcr产物回收：

实验使用jibco胶回收试剂盒，方法参考试剂盒使用说明，如下:

a.配制1.0％的低熔点胶；

b.加样(50μl)后，100v电泳20-3omin；

c.切下目的片段至ep管，每管约100μl；

d.每管加入400μl(20mmtris，1mmedtaph8.0)的buffer；

e.65℃5min至胶溶解；

f.加等体积的氛抽提，15000rpm5min取上清；

g.加等体积的氯仿抽提，15000rpm5min取上清；

h.上清加入10μl3mnaacph5.2和2倍体积的无水alc混匀后-20℃

放置30min；

i.15000rpm10min沉淀用70％的alc洗一次；

j.充分弃液体，沉淀用适当体积的水溶解(20μl)。

6、pcr扩增产物连接至pmd18-t载体：取4μlpcr扩增产物、1μlpmd18-tveetor和5μlligasebuffer进行连接反应得到连接产物。

7、构建重组质粒并抽提：

取连接产物转化dh5α感受态细胞，具体步骤包括：取出冻存的dh5α(200μl/tube)，冰中溶解；取5μl连接液加入菌液中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃1min30sec，冰浴2min；加入500μllb37℃100rpm45min；取200μl涂布至amp板(100ug/ml)；37℃培养过夜，至amp抗性克隆长出，取单克隆至3mlamp/lb中37℃250rpm过夜；

抽提重组质粒：使用上海华舜生物工程有限公司的质粒dna纯化试剂盒,方法如下:

a.将2ml过夜培养的菌液至2ml离心管中，最高速离心30秒，弃尽上清

b.在细菌沉淀中加入250μls1液，振荡至彻底悬浮。

c.加入25oμls2溶液，立即温和的上下翻转离心管5-10次以混匀，使菌体充分裂解直至形成透亮的溶液。此步骤应在5分钟内完成。

d.加入400μl4℃预冷的s3溶液，温和并充分的翻转离心管5-10次以混匀，室温静置2分钟，最高速离心10分钟。

e.将上清倒入新的离心管中，再次最高速离心10分钟。

f.小心吸取上清转移到dna吸附柱中(吸附柱置于废液收集管中)，离心1分钟，弃滤液，并将吸附柱置于同一收集管中。

g.在吸附柱中加入500μlw1液，离心30秒，弃滤液，并将吸附柱置于同一收集管中。

h.在吸附柱中加入700μlw2液，离心30秒，弃滤液，并将吸附柱置于同一收集管中，重复一次。

i.最高速离心1分钟。

j.将吸附柱移入新的干净的1.5ml离心管中，在dna吸附膜中央加入60μl预热到60℃的去离子水，室温静置1分钟，最高速离心1分钟，即为质粒dna溶液。

对抽提的所述重组质粒进行测序验证，具体步骤为：将提取的质粒送往华大基因进行测序以验证重组质粒的目的片段是否准确。由测序结果可知t/a克隆序列正确。

8、各稀释度的标准品实时荧光定量pcr扩增：

用紫外分光光度计测定a260/280值，计算抽提的重组质粒的浓度，并换算为质粒拷贝数。拷贝数/μl＝质粒浓度×(6.02×1023)×(ng/μl×10^-9)/(dnalength×660)。通过插入片段大小及载体大小计算质粒拷贝数，将质粒定量以后稀释到1×10⁷，1×10⁶，1×10⁵，1×10⁴拷贝数/μl。取四个所述标准品采用实时荧光定量pcr程序进行扩增，绘制四个扩增曲线如图1所示；所述实时荧光定量pcr程序的pcr扩增反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30秒，72℃延伸30s，45个循环；所述实时荧光定量pcr程序的pcr扩增反应体系包括：1μl扩增基因，1μlbuffer10×(含mg2+20mm)，3μl的mgcl2+(25mm)，1μl浓度10mm的dntp，0.8μl上游引物，0.8μl下游引物，0.4μl的引物探针，0.5μl浓度20pmol/μl的taq酶(5u/μl)，33.5μl的h2o。所述扩增基因为各标准品所抽提的重组质粒。

经荧光检测得到ct值，以ct值和标准品的浓度值为坐标建立标准曲线，所述标准曲线如图2所示。所用仪器为安捷伦mx3000p型荧光定量pcr仪。

9、待测样品检测：

按照步骤2-3进行待测样品的rna提取得到模板rna，将模板rna进行逆转录，按照步骤10进行实时荧光定量pcr扩增，经荧光检测得到待测样品的ct值，基于步骤二的标准曲线获取待测样品的汉坦病毒拷贝数，其中实时荧光定量pcr程序的pcr扩增反应条件中，所述扩增基因为待测样品。

验证试验：

灵敏性测定：以1×10⁵，1×10⁴，1×10³，1×10²，1×10¹拷贝数/μl质粒作为模板，建立实时荧光定量pcr体系进行扩增，测定方法的灵敏性。试验的最低检测限为1×10¹拷贝数/μl。

重复性和特异性测定：以1×10⁵，1×10⁴，1×10³拷贝数/μl的标准品进行实时定量荧光pcr，每个标准品做3个平行管，检测试验的重复性。结果显示实验的变异系数小于1％。以hbv，hcv及不同汉坦病毒亚型为对照进行试验，测定实时荧光定量pcr的特异性。结果显示非汉坦病毒均无核酸扩增。

本实验根据76-118株s片段基因序列设计特异性引物，用pcr扩增目的片段，构建重组质粒，经确定拷贝数后作为标准品进行绝对定量分析，建立了稳定的实时荧光定量pcr反应体系，该方法灵敏度高，最低检测限为1×10¹拷贝数/μl，在拷贝1×10⁷～1×10³范围内具有良好的线性关系，其检测范围可达4个数量级，3份阳性模板3次检测的cv值均小于1％，表明该方法具有较高的重复性。用该方法检测其他常见病毒病原以及其他型汉坦病毒均无交叉反应，表明该方法具有良好的特异性。

本研究建立的汉坦病毒实时荧光定量rt-pcr检测方法快速，简便，灵敏度和特异性好，对于出血热病毒感染可在短时间内可作出定性和定量检测也可用于比较个体的病毒载量。

序列表

<110>青岛大学附属医院

<120>汉坦病毒的rt-pcr定量检测方法

<141>2017-09-30

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>1

atagccaggcagaaggtgag20

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>2

gcaatcctatctgccagtt19

<210>3

<211>24

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>3

acattaactgaccgagagggcgtt24