一种可用于制备止血材料的凝胶多肽的制作方法

本发明提供一种用于制备止血材料的凝胶多肽，所提供的多肽能有效的止血，属于医用材料制备技术领域。

背景技术：

在日常生活中，由于外伤、手术等情况下导致大量出血的状况，如果不及时止血，可能会引起感染和创伤加剧，因此控制出血是急救和创伤治疗的重要步骤。合适的止血材料能明显缩短手术时间，对创伤或术后恢复至关重要。在选择止血材料时应当多方面综合考虑，包括出血部位，术腔形态大小，不同渗出血情况的填塞要求，不同止血材料的止血机制，与机体的相容性，患者的凝血功能和经济条件等。

统计结果显示受伤或术后无法控制的出血是造成死亡的主要原因，而可吸收止血材料在各种外科手术中，可以直接减少机体失血从而有效维持血容量，避免全身凝血药物使用所带来的不良反应，从而减少输血及手术时间；减少术后渗出、降低并发症，因此可吸收止血材料的应用与研发就受到各国医学界和产业界的高度重视。目前国内外已上市的可吸收止血材料有纤维蛋白胶、明胶海绵、氧化纤维素、改性淀粉、微纤维胶原、壳聚糖及藻酸钙纤维等。其中明胶海绵的创面组织附着力较差，容易破裂和脱落，对于较大的出血其止血效果欠佳；而微纤维胶原、胶原海绵等也和纤维蛋白胶、明胶一样属于异种动物蛋白制品，存在免疫原性和病毒传播的危险；氧化纤维素较疏松，被机体吸收快，但可能导致再出血，且其产生的高酸性环境会通过一种弥漫性化学机理引起神经损伤；壳聚糖、羧甲基壳聚糖、海藻酸、改性淀粉等属于天然多糖，在生产上存在批次稳定性差、质控困难等问题。因此，开发安全性更好，止血效果更佳的止血材料势在必行。

技术实现要素：

本发明提供一种可用于制备止血材料的凝胶多肽，在与血液接触后就能形成凝胶状态，具有快速止血功能，可与目前常用的止血材料一起使用。

本发明首先提供一种多肽，所述的多肽的氨基酸序列为seqidno:1-4；

本发明所提供的多肽用于制备止血制品，所述的止血制品为止血溶液；

一种止血溶液，所述的止血溶液中含有药理有效浓度的多肽；

所述的药理有效浓度，是多肽的浓度不低于20mg/ml；

所述的溶液中还包含有其它的止血材料。

本发明所提供的多肽具有良好的凝血效果，在与血液相接触的时形成凝胶从而有效止血。该多肽生物可降解、生物相容性良好。可用于制备不同形态的止血制品。

附图说明

图1：p1多肽的原子力显微镜(afm)图和原子力显微镜(tem)图；其中1为afm图，2为tem图；

图2：大鼠肝创面止血实验图，其中1为多肽溶液处理前；2为处理后。

具体实施方式

首先对本发明所涉及的术语及方法进行描述：

1、氨基酸：氨基酸根据其酸性基团(羧基)和碱性基团(氨基，胍基，咪唑基)的多寡而分为酸性氨基酸，碱性氨基酸和中性氨基酸。酸性氨基酸有天冬氨酸和谷氨酸。碱性氨基酸有精氨酸，赖氨酸和组氨酸。中性氨基酸：就是除了酸性氨基酸和碱性氨基酸外的氨基酸。其中20种氨基酸的中文名、三字母和单字母对照如下：

甘氨酸glyg；丝氨酸gers；丙氨酸glaa；苏氨酸thrt；缬氨酸valv；异亮氨酸ilei；亮氨酸leul；酪氨酸tyry；苯丙氨酸phef；组氨酸hish；脯氨酸prop；天冬氨酸aspd；甲硫氨酸metm；谷氨酸glue；色氨酸trpw；赖氨酸lysk；半胱氨酸cysc；精氨酸argr。

其中极性带正电荷的氨基酸的碱性氨基酸有三种：赖氨酸(lysk)、精氨酸(argr)、组氨酸(hish)；

极性带负电荷的酸性氨基酸有两种：天冬氨酸(aspd)、谷氨酸(glue)。

2、凝血酶原时间(prothrombintime,pt)，简称pt，是指在缺乏血小板的血浆中加入过量的组织因子(兔脑渗出液)后，凝血酶原转化为凝血酶，导致血浆凝固所需的时间。

3、活化部分凝血活酶时间(aptt)：是内源性凝血系统的一个较为敏感的筛选试验，反映内源性凝血是否正常。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：多肽的设计及合成

申请人设计并筛选了离子互补型的短肽，使筛选获得的多肽具有自组装的推动力和导向作用。其中自组装的推动力指的是分子间的非共价键作用力的协同作用，它为肽分子自组装提供能量后盾；而自组装的导向作用则指的是肽分子空间结构的几何互补性，只有肽分子的空间结构互补，其才能够在空间尺寸和方向上实现堆积和重排。

为了实现设计的多肽与血液结合产生自主装的效果，申请人设计自组装肽含有酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基作为极性氨基酸，并且通过非极性氨基酸残基的插入位置及数量来控制多肽能够在与血液接触时形成纤维/凝胶状结构。

申请人设计了不同类型的多肽，并通过凝血活性的测定来筛选能用于止血的多肽。用于筛选的多肽的氨基酸序列如下：

p1：krhkrhaadede(seqidno:1)、

p2、krhaakrhaadesde(seqidno:2)、

p3、kasrasiieadkead(seqidno:3)、

p4、kasraskaiieadkseadk(seqidno:4)。

合成时多肽的n端进行乙酰化修饰，c端进行氨基化修饰；合成的纯度为95.5％。合成的初始样品为白色冻干粉。

实施例2：凝血活性的测定

为了评价所设计的多肽的体外凝血性能，采用活化部分凝血活酶时间(aptt)和凝血酶原时间(pt)来进行分析测试：活化部分凝血酶原时间(aptt)和凝血酶原时间(pt)的测定采用商品化的试剂盒。

血液样品的制备：

首先用戊巴比妥钠溶液(0.3μl/100mg)麻醉sd大鼠，从大鼠股动脉处抽取血液，然后通过3.8％枸橼酸钠抗凝剂对其进行抗凝处理，在37℃、3000r/min的条件下离心制得贫血小板血浆。

多肽溶液的制备：

精密称量后的短肽冻干粉末加入到超纯水中配制成浓度500mg/ml的母液，密封并避光储存在4℃冰箱中备用，后续使用时将其稀释成相应浓度的溶液。

aptt的测试步骤如下：在试管内加入贫血小板血浆、钙离子溶液和aptt试剂，在37℃下恒温5min，然后加入多肽溶液，放入aptt试管中，通过仪器开始读数。

pt的测试步骤如下：

将贫血小板血浆和pt试剂分别在37℃下恒温5min，然后一同加入pt试管中，并加入多肽溶液，开始采集数据。每个样品重复3次，结果取平均值(表1)。

表1：四种多肽的凝血测定结果

凝血实验结果表明，四种多肽中，p3和p4相比于其它三种多肽，能显著缩短pt的时间，表明p4凝血途径的效果优于其它多肽；而aptt上没有明显的差异。选用氨基酸序列为seqidno:4的p4多肽进行后续的研究。

实施例3：

对氨基酸序列为seqidno:4的多肽进行原子力显微镜(afm)的检测：

将20μl的多肽溶液置于新解离的云母片上，静置15s后，用100μl超纯水沿液滴边缘冲洗3次。30℃室温静置，待云母片自然干燥后，afm进行观察。afm参数设置为轻敲模式，扫描区域为2μm×2μm，扫描频率是1.0hz；扫描探针(model：arrowuhfaud)参数：弹性系数(k)为6(1.5～21.0)n/m，材质si，无涂层，尖端半径为(10±2)nm。

对氨基酸序列为seqidno:4的多肽进行透射电子显微镜(tem)的检测：

将30μl的多肽溶液滴在封口膜上，然后将300目的镀碳铜网贴放在样品上约30秒，用干净的镊子取出铜网，并用滤纸吸干铜网周围多余的液体静置晾干，然后将吸附有两亲性短肽的铜网一面贴附在2％的乙酸双氧铀溶液液滴(同样品溶液相同放置在封口膜上)上进行负染约1分钟，用镊子取出铜网将多余的液体用滤纸吸干静置晾干。采用jeoljem-2100uhr型电子显微镜观测形貌，加速电压为200kv

其结果显示，通过原子力显微镜和透射电子显微镜观察到的多肽溶液自组装成纳米纤维，并进而自组装形成纳米纤维网(图1)。

实施例4大鼠创伤修改实验

将sd大鼠购回驯养后，将sd大鼠肌肉暴露出来，找出大鼠腿部静脉，制造出血点，在伤口处使用p4多肽溶液，每隔15s观察一次，至出血点渗血完毕，观察结果表明p4多肽的止血时间为19±3s，好于p4多肽的32±5s；而p1和p2多肽的止血时间为1min以上；上述结果也与凝血活性测定的结果相对应。

选取体重200g左右的健康雄性wistar大鼠做肝创面止血实验，于大鼠的腹中线作一长约3cm纵行切口，暴露大鼠的肝脏，用无菌纱布将肝脏中叶隔离，用刀片在肝脏中叶纵向切开一长1cm，深0.5cm的切口，用脱脂棉立即擦去血液，将浓度为40mg/ml的p4多肽溶液覆盖到创面上，覆盖无菌纱布，观察创面出血的情况，直到伤口不再出血为止，记录出血时间为15s,表明p4多肽具有非常快的凝血活性(图2)。

本发明所提供的多肽可以与目前常用的其它止血材料配合使用来制备止血制品。

序列表

<110>青岛大学医学院附属医院

<120>一种可用于制备止血材料的凝胶多肽

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>12

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

lysarghislysarghisalaalaaspgluaspglu

1510

<210>2

<211>15

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

lysarghisalaalalysarghisalaalaaspgluseraspglu

151015

<210>3

<211>15

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

lysalaserargalaserileileglualaasplysglualaasp

151015

<210>4

<211>19

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

lysalaserargalaserlysalaileileglualaasplysserglu

151015

alaasplys