羊副结核分支杆菌的LAMP检测引物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，特别涉及一种羊副结核分支杆菌的lamp检测引物及其lamp检测试剂盒和lamp检测方法。
背景技术：
：副结核病(paratuberculosis)也叫副结核性肠炎，是由副结核分支杆菌(mycobacteriumparatuberculosis)引起反刍兽的一种慢性传染病，主要侵害牛羊，骆驼、马、鹿等也可感染，发病特点是慢性卡他性肠炎、顽固性腹泻、逐渐消瘦、肠黏膜增厚并形成皱褶，最后以肠紊乱或易感染其他病症而导致动物死亡。本病在全世界范围内流行，世界动物卫生组织(oie)将其列为必须通报的动物疫病，我国将该病定为二类动物疫病。特别是舍饲羊副结核发病率有明显上升趋势，给养羊业造成了巨大的经济损失。另外，该病尚无有效的治疗方法，最好的控制方法就是对畜群进行严格的检疫并及时淘汰阳性羊。为此，开展羊副结核分支杆菌的检测方法研究具有重要意义。目前，用于羊副结核病检测的方法很多，如琼脂扩散试验、皮内变态反应、补体结合反应和酶联免疫吸附试验等检测方法，但这些方法主要是检测抗体，而不能检测副结核分支杆菌。虽然基于pcr技术的检测方法也已建立，但pcr需要昂贵的仪器，而且操作繁琐。为此，急需建立一种敏感、准确、快速、简便的羊副结核分支杆菌检测方法。环介导的等温核酸扩增技术(lamp)是由t.notomi等人发明的新型核酸扩增技术，该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的dna聚合酶，在等温条件下可以高效、快速、高特异地扩增靶序列。近年来，国内外已将该技术广泛应用于病原体检测。非盈利的国际创新新诊断技术基金会(find)和与日本荣研化学株式会社利用lamp技术建立了肺结核快速检测系统；masakiimai等人利用lamp建立了禽流感病毒的实验室确诊体系；lamp还可以检测其它与动物相关的细菌，如侵入性大肠杆菌、沙门氏杆菌、副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、单核细胞增生性李斯特菌、猪肺炎支原体等。但是迄今为止，用于检测羊副结核分支杆菌的lamp引物与试剂盒在国内外均未见报道。技术实现要素：本发明的目的是提供一种特异性强、灵敏度高、检测快速方便的羊副结核分支杆菌的lamp检测引物及其lamp检测试剂盒和lamp检测方法。本发明的技术解决方案是：一种羊副结核分支杆菌的lamp检测引物，包括正向外引物f3、反向外引物b3、正向内引物fip、反向内引物bip、正向环引物lf，各引物序列具体如下：f3：5′-cctagactcgcggactctt-3′；b3：5′-cacgggtcacgtagaaacg-3′；fip：5′-cgggcatcgaagatcgctaccaattgtgacgtacgggctac-3′；bip：5′-tggtcgatatcggagctcctctgttccatcgacagctcagc-3′；lf：5′-cgaatgcgttctgcccca-3′。上述lamp检测引物在羊副结核分支杆菌的中的应用。一种羊副结核分支杆菌的lamp检测试剂盒，包含23μl检测溶液，所述的检测溶液包括：20mmtris·hcl、ph为8.8，10mmkcl，10mm(nh4)2so4，0.1％tween20，0.8m甜菜碱(betaine)，8mmmgso4，1.4mmdntpeach，8ubstdnapolymerase，钙黄绿素指示剂1μl，引物加入量为：5pmol正向外引物f3和5pmol反向外引物b3，40pmol正向内引物fip和40pmol反向内引物bip，5pmol正向环引物lf，最后用ddh2o补足至23μl；其中各引物具体序列如下：f3：5′-cctagactcgcggactctt-3′；b3：5′-cacgggtcacgtagaaacg-3′；fip：5′-cgggcatcgaagatcgctaccaattgtgacgtacgggctac-3′；bip：5′-tggtcgatatcggagctcctctgttccatcgacagctcagc-3′；lf：5′-cgaatgcgttctgcccca-3′。进一步的，所述钙黄绿素指示剂1μl包含有0.5mm钙黄绿素和10mm氯化锰。上述lamp检测试剂盒在羊副结核分支杆菌的中的应用。进一步的，包括提取待检微生物的dna，以提取的dna为模板，利用lamp试剂盒进行lamp；观察lamp反应溶液颜色变化，绿色表示检测为阳性，存在羊副结核分支杆菌，橙色表示检测为阴性，不存在羊副结核分支杆菌。进一步的，提取待检微生物的dna，取2μldna溶液，加入23μllamp试剂盒中的检测溶液进行lamp，lamp反应程序为：60℃～65℃，45min～55min，扩增产物进行颜色变化的观察。进一步的，lamp扩增条件为：63℃恒温50min。本发明提供了一种羊副结核分支杆菌的lamp检测方法及其专用引物与试剂盒。本发明的有益效果：1)高特异性：5条引物对羊副结核分支杆菌靶序列的6个特异区域的识别保证了lamp扩增的高度特异性，即lamp能从相差仅一个核苷酸的基因标本中找出相应的靶序列进行扩增；2)高灵敏度：灵敏度比普通pcr高100倍；3)结果鉴定简便：可通过肉眼观察结果(钙黄绿素显色)，也可以用电泳lamp产物判断结果；4)操作简单：只要将检测样品(靶核酸)和检测试剂一起放入60-65℃恒温水浴锅中50分钟后就可以判断结果；5)快速、高效扩增：整个lamp扩增反应一小时内即可完成，且检测下限可达1.02×102拷贝/μl，检测灵敏度高。综上所述，本发明可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到羊副结核分支杆菌，不需要复杂仪器，为羊副结核分支杆菌的检测提供了一个新的技术平台，可用于畜牧业生产单位筛查和检测羊副结核分支杆菌，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。附图说明图1为4套引物组合的lamp扩增电泳图；图中：1，dl2000dnamarker；2，阳性对照；3，阴性对照；4，mp1(阳性模板)；5，mp1(阴性模板)；6，mp2(阳性模板)；7，mp2(阴性模板)；8，mp3(阳性模板)；9，mp3(阴性模板)；10，mp4(阳性模板)；11，mp4(阴性模板)；2％琼脂糖凝胶，上样量0.5μl；图2为实施例1设计的4套引物组合lamp扩增的钙黄绿素指示剂染色结果；图中：1，mp1(阳性模板)；2，mp1(阴性模板)；3，mp2(阳性模板)；4，mp2(阴性模板)；5，mp3(阳性模板)；6，mp3(阴性模板)；7，mp4(阳性模板)；8，mp4(阴性模板)；9，阳性对照；10，阴性对照；自然光下拍摄；图3为本发明羊副结核分支杆菌lamp检测方法特异性的电泳检测结果；图中：1，dl2000dnamarker；2，本地分离菌；3，大肠杆菌；4，沙门氏杆菌；5，链球菌；6，葡萄球菌；7，阴性羊粪便；2％琼脂糖凝胶，上样量0.5μl；图4为本发明羊副结核分支杆菌lamp检测方法特异性的钙黄绿素指示剂染色检测结果；图中：1，dl2000dnamarker；2，本地分离菌；3，大肠杆菌；4，沙门氏杆菌；5，链球菌；6，葡萄球菌；7，阴性羊粪便；自然光下拍摄；图5为本发明羊副结核分支杆菌lamp检测方法灵敏度的电泳检测结果；图中：1.dl2000dnamarker；2.阴性对照；3.1.02×108拷贝/μl；4.1.02×107拷贝/μl；5.1.02×106拷贝/μl；6.1.02×105拷贝/μl；7.1.02×104拷贝/μl；8.1.02×103拷贝/μl；9.1.02×102拷贝/μl；2％琼脂糖凝胶，上样量0.5μl；图6为本发明羊副结核分支杆菌lamp检测方法灵敏度的钙黄绿素指示剂染色检测结果；图中：1，阴性对照；2，1.02×108拷贝/μl；3，1.02×107拷贝/μl；4，1.02×106拷贝/μl；5，1.02×105拷贝/μl；6，1.02×104拷贝/μl；7，1.02×103拷贝/μl；8，1.02×102拷贝/μl；图7为本发明羊副结核分支杆菌lamp检测方法灵敏度的pcr检测结果；图中：1.dl2000dnamarker；2.阴性对照；3.1.02×108拷贝/μl；4.1.02×107拷贝/μl；5.1.02×106拷贝/μl；6，1.02×105拷贝/μl；7，1.02×104拷贝/μl；8，1.02×103拷贝/μl；9，1.02×102拷贝/μl；2％琼脂糖凝胶，上样量3μl。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。具体实施方式实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1用于对羊副结核分支杆菌进行lamp检测的引物设计从美国基因数据库检索获得禽分枝杆菌副结核亚种序列(genbankaccessionno.ae016958)，进行同源性分析，获得羊副结核分支杆菌的特异性保守靶序列(map0862序列，genbankaccessionno.ae016958)，再根据该保守靶dna序列，设计用于对羊副结核分支杆菌进行lamp检测的引物，设计出4套引物(mp-1、mp-2、mp-3、mp-4)，经过实验对比，最终选取了由5条引物组成的引物组合mp-2，引物序列如表1所示。表1用于对羊副结核分支杆菌进行lamp检测的引物mp-2引物名称序列(5′-3′)f3cctagactcgcggactcttb3cacgggtcacgtagaaacgfipcgggcatcgaagatcgctaccaattgtgacgtacgggctacbiptggtcgatatcggagctcctctgttccatcgacagctcagclfcgaatgcgttctgcccca实施例2本发明羊副结核分支杆菌的lamp检测方法的建立用实施例1获得的用于对羊副结核分支杆菌进行lamp检测的五条引物组合mp2对羊副结核分支杆菌(本实验室分离保存病原)进行lamp检测，以获得最佳反应体系及反应条件，同时以其它3套引物(mp-1、mp-3、mp-4)为对照；mp-1:f3ggatacctcgcaacctccab3gacaggtagggaaacaacgtfipaggcacaccacgagagagttct-cgaagctcgctgaaggatgbiptggggtctgaggtgtctacaga-agatagagccgcgcaagalfgaaaagcgctagtgcccaalbtgcgttactgatgctggctmp-3:f3ctagccgcagagcttcgab3ccagcatcagtaacgcatctfiptccttcagcgagcttcgctg-agtgtgtggaaaacgtcaggbiptgttgggcactagcgcttttca-agaccccagggatcttagglbcagaactctctcgtggtgtgcmp-4:f3gcagagcttcgagatatcgcb3tcgtctatcccggatcgcfiptagtgcccaacatccttcagcg-cgtcaggtcagttggataccbipacagaactctctcgtggtgtgc-cgcatctgtagacacctcaglbctttcgaacggtcggcccta具体方法如下：一、最佳反应体系的确定在相同反应条件(置63℃恒温50min)下，反应体系中包括以下物质，以下为确定的最佳反应体系：1)以含羊副结核分支杆菌基因组dna(用血液/组织/细菌基因组dna试剂盒提取待件样品的核酸，该试剂盒由天根生化科技有限公司生产，货号：dp304)为模板，在实施例1获得的五条引物的引导下进行lamp扩增，其中，25μllamp反应体系包括：含羊副结核分支杆菌的基因组dna2μl，20mmtris·hcl(ph8.8)，10mmkcl，10mm(nh4)2so4，0.1％tween20，0.8m甜菜碱(betaine)，10mmmgso4，1.4mmdntpeach，8ubstdnapolymerase(购自荣研生物科技(中国)有限公司)，钙黄绿素指示剂1μl(含有0.5mm钙黄绿素和10mm氯化锰)，加入的引物量为：40pmolfip和40pmolbip，20pmollf，5pmolf3和5pmolb3；反应条件为置63℃恒温水浴锅中孵育50min。2)反应结束后进行结果判定：lamp产物0.5μl用2％琼脂糖凝胶电泳50min，出现明显连续条带表示待测样品中存在羊副结核分支杆菌，没有明显连续条带表示待测样品中不存羊副结核分支杆菌。或者根据反应液的颜色变化判断结果(原理：钙黄绿素是金属离子指示剂，能指示反应液中mg2+的变化)，绿色表示待测样品中存在羊副结核分支杆菌(阳性)，橙色表示待测样品中不存在羊副结核分支杆菌(阴性)。扩增产物的电泳变化结果如图1所示，由图1可以看出，mp-2的扩增效果最好，因此将mp-2引物组合定为本发明用于对羊副结核分支杆菌进行lamp检测的专用引物。在mp2引物组合的引导下，将本发明最佳的羊副结核分支杆菌的lamp检测体系定为(25μl)：待测物的基因组dna2μl，20mmtris·hcl(ph8.8)，10mmkcl，10mm(nh4)2so4，0.1％tween20，0.8m甜菜碱(betaine)，8mmmgso4，1.4mmdntpeach，8ubstdnapolymerase，钙黄绿素指示剂1μl，加入的引物量为：40pmolfip和40pmolbip，20pmollf，5pmolf3和5pmolb3。二、最佳反应条件的确定在步骤一确定的相同的反应体系下，在不同反应条件下对含羊副结核分支杆菌的基因组dna进行lamp检测，以确定最佳反应条件，具体方法包括以下步骤：1)以含羊副结核分支杆菌的基因组dna为模板，在实施例1获得的五条引物的引导下进行lamp扩增，其中，25μllamp反应体系包括：含羊副结核分支杆菌的基因组dna2μl，20mmtris·hcl(ph8.8)，10mmkcl，10mm(nh4)2so4，0.1％tween20，0.8m甜菜碱(betaine)，8mmmgso4，1.4mmdntpeach，8ubstdnapolymerase，钙黄绿素指示剂1μl，加入的引物量为：40pmolfip和40pmolbip，20pmollf，5pmolf3和5pmolb3。lamp的扩增条件为：置60℃、61℃、63℃和65℃，恒温50min。反应结束后，用与步骤一相同的方法进行结果判定。检测结果表明，本发明最佳的羊副结核分支杆菌lamp扩增条件为：置63℃恒温50min。2)结果判定实施例3本发明羊副结核分支杆菌的lamp检测方法的特异性、灵敏性检测一、本发明羊副结核分支杆菌的lamp检测方法的特异性检测阳性对照用本地分离菌lnmp16基因组作为模板，并用大肠杆菌，沙门氏菌、链球菌、葡萄球菌和阴性羊粪便基因组dna为模板。检测实施例2获得的最佳的羊副结核分支杆菌的lamp检测方法的特异性，反应体系和反应条件与实施例2相同。本发明羊副结核分支杆菌lamp检测方法特异性的电泳仪检测结果如图3所示(从左到右：本地分离菌，大肠杆菌，沙门氏杆菌，链球菌，葡萄球菌，阴性羊粪便)，从图中可以看出，只有羊副结核分支杆菌(分离菌株)发生了lamp反应，其余均未发生；本发明羊副结核分支杆菌lamp检测方法特异性的钙黄绿素指示剂染色检测结果如图4所示(从左到右：本地分离菌，大肠杆菌，沙门氏杆菌，链球菌，葡萄球菌，阴性羊粪便)，钙黄绿素指示剂染色方法和电泳检测方法的结果一致，表明本发明的羊副结核分支杆菌的lamp检测方法具有较高的特异性，可以特异性地检测到羊副结核分支杆菌。二、本发明羊副结核分支杆菌的lamp检测方法的灵敏度检测检测本发明lamp检测方法和普通pcr方法检测羊副结核分支杆菌的灵敏度，方法为：用本地分离羊副结核分支杆菌的map0862全基因质粒定量(1.02×1011拷贝/μl)，然后以10倍梯度(103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍)进行稀释使1-7模板中dna的拷贝分别为1.02×108拷贝/μl、1.02×107拷贝/μl、1.02×106拷贝/μl、1.02×105拷贝/μl、1.02×104拷贝/μl、1.02×103拷贝/μl、1.02×102拷贝/μl，再以经梯度稀释的dna为模板，分别用本发明的lamp检测方法与普通pcr方法(引物序列为f3和b3)进行灵敏度检测。本发明羊副结核分支杆菌lamp检测方法灵敏度的电泳检测结果如图5所示(模板拷贝分别为：1.02×108拷贝/μl、1.02×107拷贝/μl、1.02×106拷贝/μl、1.02×105拷贝/μl、1.02×104拷贝/μl、1.02×103拷贝/μl、1.02×102拷贝/μl)，本发明羊副结核分支杆菌lamp检测方法灵敏度的钙黄绿素指示剂颜色反应检测结果如图6所示(模板拷贝分别为：1.02×108拷贝/μl、1.02×107拷贝/μl、1.02×106拷贝/μl、1.02×105拷贝/μl、1.02×104拷贝/μl、1.02×103拷贝/μl、1.02×102拷贝/μl)，本发明羊副结核分支杆菌lamp检测方法灵敏度的pcr检测结果如图7所示(模板拷贝分别为：1.02×108拷贝/μl、1.02×107拷贝/μl、1.02×106拷贝/μl、1.02×105拷贝/μl、1.02×104拷贝/μl、1.02×103拷贝/μl、1.02×102拷贝/μl)，本发羊副结核分支杆菌的lamp检测方法可检测到1.02×102拷贝/μl，而普通pcr方法仅能检测到1.02×104拷贝/μl，而且钙黄绿素指示剂染色方法及电泳检测方法的结果一致，表明本发明羊副结核分支杆菌的lamp检测方法比普通pcr检测方法的灵敏度高100倍。实施例4、制备羊副结核分支杆菌的lamp检测试剂盒羊副结核分支杆菌的lamp检测试剂盒包含23μl检测溶液，所述的检测溶液包括：20mmtris·hcl、ph为8.8，10mmkcl，10mm(nh4)2so4，0.1％tween20，0.8m甜菜碱(betaine)，8mmmgso4，1.4mmdntpeach，8ubstdnapolymerase，钙黄绿素指示剂1μl，引物加入量为：5pmol正向外引物f3和5pmol反向外引物b3，40pmol正向内引物fip和40pmol反向内引物bip，5pmol正向环引物lf，最后用ddh2o补足至23μl；钙黄绿素指示剂1μl包含有0.5mm钙黄绿素和10mm氯化锰；其中各引物具体序列如下：f3：5′-cctagactcgcggactctt-3′；b3：5′-cacgggtcacgtagaaacg-3′；fip：5′-cgggcatcgaagatcgctaccaattgtgacgtacgggctac-3′；bip：5′-tggtcgatatcggagctcctctgttccatcgacagctcagc-3′；lf：5′-cgaatgcgttctgcccca-3′。提取待检微生物的dna，取2μldna溶液，加入23μllamp试剂盒中的检测溶液进行lamp，lamp反应程序为：63℃，50min，扩增产物进行颜色变化的观察。观察lamp反应溶液颜色变化，存在羊副结核分支杆菌，溶液颜色为绿色；不存在羊副结核分支杆菌，溶液颜色为橙色。本发明为羊副结核分支杆菌的检测提供了一个新的技术平台，具有简便、快速、准确、廉价、可视等优点，可用于畜牧业生产单位筛查和检测羊副结核分支杆菌，对羊副结核病的净化与控制具有重要意义。以上仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>锦州医科大学、辽宁省畜牧科学研究院<120>羊副结核分支杆菌的lamp检测引物及其lamp检测试剂盒和lamp检测方法<130>2017<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>1083<212>dna<213>人工序列<220><223>map0862序列<400>1atgcgcttcgtaaacggcaaaccgatctggagtccggtaaccgaggagctgcggagcgcg60gagttacctcttcgattgtggctgtctgcgaagcttccgaacgtcaagccctgtttcgcc120gagttccggaaagcaattcggcacagctgtatcgagccaccgacgggccttccgactggc180accgccggtgcggcatttgattacctgctgcggtacaggctaggggctgaagatcccgcc240gagctagcggtaatcggctcggcgcttacggatcagaagcgcgactggacttcgacggta300gtgaacctagccgcagagcttcgagatatcgcaagtgtgtggaaaacgtcaggtcagttg360gatacctcgcaacctccagcgaagctcgctgaaggatgttgggcactagcgcttttcaca420gaactctctcgtggtgtgcctttcgaacggtcggccctaagatccctggggtctgaggtg480tctacagatgcgttactgatgctggctccgcgatccgggatagacgatcttgcgcggctc540tatctgtcgagttcgaaaacgttgtttccctacctgtctgggcgtcgtggcactgtggtc600ctggggccgacgttcggagcatccatccctggtgacgctgatttgatcaagggaacgact660cttgtcgagttgaaggcaaccgtcgaccgtcgtcgccgtgacggcactccgcggtacagc720ctagactcgcggactctttatcaaattgtgacgtacgggctactggggcagaacgcattc780gggctgaatgaggtagcgatcttcgatgcccgctattctcatcttcaacgatggtcgata840tcggagctcctctgctcacttgcgggcgagagagtgtacgtcgctgagctgtcgatggaa900ctggatacgtttctacgtgacccgtgcgggtcacgggtacccaaccttgcgcgtgaggca960gctatgaggatcagcgccgaaggtgaactgcctgcgtctcggcgccgtcgtgatcggttt1020acgaggaagccaccggcgaagacaccaccatcaccgtcgaaggcaaatctgtggcgcgcc1080tga1083<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>f3引物序列<400>2cctagactcgcggactctt19<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>b3引物序列<400>3cacgggtcacgtagaaacg19<210>4<211>41<212>dna<213>人工序列<220><223>fip引物序列<400>4cgggcatcgaagatcgctaccaattgtgacgtacgggctac41<210>5<211>41<212>dna<213>人工序列<220><223>bip引物序列<400>5tggtcgatatcggagctcctctgttccatcgacagctcagc41<210>6<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>lf引物序列<400>6cgaatgcgttctgcccca18当前第1页12