一、技术领域
本发明属于肽合成技术领域，具体涉及一种合成苯丙氨酰-赖氨酸二肽的方法。
二、
背景技术：
短肽是由2-9个的氨基酸残基组成的链状化合物，许多短肽具有重要的生物学功能，是生物医药中的新成员，也广泛应用于食品、保健品和日化品等领域中。例如，天冬氨酰-苯丙氨酸二肽就是重要的肽类甜味剂，广泛应用于食品、化妆品等领域；又例如，苯丙氨酰-赖氨酸二肽，进入体内后经蛋白酶的分解，生成苯丙氨酸和赖氨酸，苯丙氨酸是必需氨基酸之一，是合成苯丙氨苄、甲酸溶肉瘤素等氨基酸类抗癌药物的中间体，也是生产肾上腺素、甲状腺素和黑色素的原料，在食品领域，苯丙氨酸是合成保健型二肽甜味剂阿斯巴甜的原料之一，在日化领域，苯丙氨酸则是作为吸收紫外线的成分，用于护肤品中；赖氨酸是谷物中的第一限制性氨基酸，具有提高智力、增进食欲、促进钙吸收和生长、提高记忆力和免疫力、增强体质等功效，是重要的营养型食品添加剂。因此研发新的合成短肽的方法和产品，具有重要的经济价值和应用推广前景。
现有合成二肽的方法，例如申请号为200610095100.2、名称为“肌肽类似物制备方法”的发明专利，该专利公开了一种肌肽类似物的酶促合成方法。具体方法是先用一定ph的磷酸盐缓冲溶液将按一定比例混合的底物l-丙氨酸、4，5-二羧酸咪唑及适量酶润湿，后加入10ml有机溶剂，在夹套反应器中磁力搅拌下恒温反应一段时间。该方法的缺陷是：选用四氢呋喃为非水反应溶剂，在该溶剂中，底物l-丙氨酸和4，5-二羧酸咪唑及缓冲溶液的溶解度极低，因此酶催化的效率低，难以实现工业化；而且四氢呋喃极度易燃、毒性极强，严重影响人体健康，对环境污染也大。
三、
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有非水介质中酶促合成短肽方法的不足之处，提供一种在有机介质乙二醇中利用生物酶催化剂，合成苯丙氨酰-赖氨酸二肽的方法。该方法采用的有机溶剂乙二醇结构类似于水，水分子可与其以任意比例混溶，因而对底物氨基酸和产物短肽的溶解度大，另外该酶促反应平衡偏向于短肽合成方向，因此可以高效率合成苯丙氨酰-赖氨酸二肽。该方法具有反应条件温和、操作简便、产率高、成本低、绿色无污染、合成的产物二肽纯度高和易分离纯化的特点，可应用于医药、食品、纺织等领域。
本发明的主要原理是：酶促反应非水介质是指不含水或含微量水分的有机溶剂，在该类介质中，生物催化剂酶在适宜条件下可保持催化反应的专一性并逆转反应方向，因此，非水酶促反应逐渐应用于有机合成、物质修饰等领域。乙二醇，又名甘醇，化学式为(hoch2)2，分子量62，为无色无臭、有甜味液体，能与水以任意比例混合，极性仅次于水和甲醇的有机溶剂。由于乙二醇分子量小，极性大，作为有机溶剂，可通过氢键将大量水分子束缚，从理论上分析，用在非水介质中酶催化反应时，一方面保持酶的催化活性，增大底物和产物的溶入量，促进反应平衡朝向生成产物方向，提升产物生成率；另一方面，可能扩散至酶的活性中心，以水分子的形式参与催化反应，因此，在乙二醇非水介质中可能发生高效率的酶催化反应。胰凝乳蛋白酶是一种蛋白质水解酶，在水溶液中专一催化芳香族氨基酸羧基参与形成的肽键，在非水有机介质中，在仍保持催化反应的专一性的基础上，逆转催化反应方向，变成催化合成芳香族氨基酸羧基参与形成的肽键。因此，以该酶为催化剂，在乙二醇非水介质中，以苯丙氨酸和赖氨酸为底物，可合成苯丙氨酰-赖氨酸二肽。
本发明的目的是这样实现的：一种合成苯丙氨酰-赖氨酸二肽的方法，以市售苯丙氨酸和赖氨酸为原料，以胰凝乳蛋白酶为催化剂，乙二醇为非水介质，通过制备苯丙氨酸和赖氨酸水溶液，制备乙二醇非水反应介质，制备苯丙氨酰-赖氨酸二肽反应液，制备净化荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽的树脂柱，制备苯丙氨酰-赖氨酸二肽洗脱液，制备苯丙氨酰-赖氨酸二肽冻干粉，制备回收苯丙氨酸和赖氨酸水溶液以及制备再生树脂柱的步骤，就制备出含量为95～98％的苯丙氨酰-赖氨酸二肽。其具体的工艺步骤如下：
(1)制备苯丙氨酸和赖氨酸水溶液
在搅拌下先后将适量市售苯丙氨酸和赖氨酸溶解于纯净水溶液中，就制备出苯丙氨酸浓度为0.3～1.0mol/l，赖氨酸浓度0.3～2.0mol/l的水溶液；再用稀氢氧化钠调节该水溶液的ph值为7.5～9.5，即制备出苯丙氨酸和赖氨酸水溶液，用于下步制备乙二醇非水反应介质。
(2)制备乙二醇非水反应介质
第(1)步完成后，将第(1)步制备的苯丙氨酸和赖氨酸水溶液与乙二醇溶液混合，其中苯丙氨酸和赖氨酸水溶液与乙二醇的体积之比为1∶5～25(l/l)，搅拌处理1～3h，即制备出乙二醇非水反应介质，用于下步制备苯丙氨酰-赖氨酸二肽反应液。
(3)制备苯丙氨酰-赖氨酸二肽反应液
第(2)步完成后，于搅拌下在第(2)步制备的乙二醇非水反应介质中加入活力为1000～1500u/mg的胰凝乳蛋白酶，其中加入胰凝乳蛋白酶的质量与苯丙氨酸和赖氨酸的总质量之比为1∶20～50(kg/kg)。然后控制温度为35～45℃，反应15～20h。反应完成后，升温到80～90℃，处理15～20min后抽滤，分别收集滤渣和滤液。对收集的滤液，即制备出苯丙氨酰-赖氨酸二肽反应液，用于下步制备净化荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽的树脂柱。对收集的滤渣，用纯净水反复洗涤，除去乙二醇后用于制备动物饲料添加剂。
(4)制备净化荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽的树脂柱
第(3)步完成后，先将第(3)步制备的苯丙氨酰-赖氨酸二肽反应液用纯净水稀释3～6倍，再用恒流泵泵入装有活化001×7阳离子交换树脂或d0011离子交换树脂的树脂柱，其中该树脂柱与第(3)步制备的苯丙氨酰-赖氨酸二肽反应液的体积之比为1∶30～60(l/l)，泵入该苯丙氨酰-赖氨酸二肽反应液的流速为该树脂柱体积(bv)的2～6倍。泵入该苯丙氨酰-赖氨酸二肽反应液完成后，分别收集荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸的树脂柱和卸载苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸的过柱液。对收集的荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸的树脂柱，泵入2～6bv的纯净水洗涤，洗涤完成后分别收集洗涤液和除去乙二醇的荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸的树脂柱。对收集的洗涤液，与收集的过柱液混合，用于制备回收乙二醇；对收集的除去乙二醇的荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸的树脂柱，即制备出净化荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽的树脂柱，用于下步制备苯丙氨酰-赖氨酸二肽洗脱液。
(5)制备苯丙氨酰-赖氨酸二肽洗脱液
第(4)步完成后，先向第(4)步制备的净化荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽的树脂柱中泵入0.1～0.5mol/l的氢氧化钠溶液，洗脱苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸，所述氢氧化钠溶液的泵入流速为2～4bv/h。分别收集第1.5～2.5bv、第3.5～4.5bv、第5.0～6.5bv的洗脱液和卸载苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸的树脂柱。对收集的该卸载树脂柱，用于第(8)步制备再生树脂柱；对收集的第1.5～2.5bv、第5.0～6.5bv的洗脱液，用于第(7)步制备回收苯丙氨酸和赖氨酸水溶液；对收集的第3.5～4.5bv的洗脱液，即制备出苯丙氨酰-赖氨酸二肽洗脱液，用于下步制备苯丙氨酰-赖氨酸二肽冻干粉。
(6)制备苯丙氨酰-赖氨酸二肽冻干粉
第(5)步完成后，将第(5)步制备的苯丙氨酰-赖氨酸二肽洗脱液泵入截留分子量为100～200da的纳滤器中，在表压为0.1～0.5mpa的压力下进行第一次纳滤，直至纳滤截留液与纳滤滤过液的体积之比达到1∶4～5(l/l)时停止纳滤，分别收集第一次纳滤滤过液和纳滤截留液。对收集的第一次纳滤截留液，再向其中加入纯净水至原体积，进行第二次纳滤，第二次纳滤的条件与第一次纳滤条件相同。第二次纳滤完成后，分别收集第二次纳滤滤过液和截留液。对收集的第二次纳滤滤过液，与第一次纳滤滤过液进行合并，用稀盐酸调节ph值为6.5～7.0后，泵入废水处理池进行生化处理，达标后排放；对收集的第二次纳滤截留液，置于低温冰箱中在-40～-20℃的条件下预冻6～12h，再转移至真空冷冻干燥机中，在温度为-50～-40℃、真空度为20～50pa的条件下进行冷冻干燥24～36h，即制备出苯丙氨酰-赖氨酸二肽冻干粉，其总收得率以苯丙氨酸计达到85～92％，该冻干粉中苯丙氨酰-赖氨酸二肽含量为95～98％。
(7)制备回收苯丙氨酸和赖氨酸水溶液
第(5)步完成后，将第(5)步收集的第1.5～2.5bv和第5.0～6.5bv的洗脱液进行合并，先泵入反渗透器中，在表压为0.5～0.8mpa的条件下进行反渗透浓缩，直至无反渗透滤过液出现时止。分别收集反渗透滤过液和反渗透截留液，对收集的反渗透滤过液，用于洗涤再生树脂柱；对收集的反渗透截留液，再装入截留分子量为100da的透析袋中，用纯净水进行透析6～10h，其中纯净水的体积为反渗透截留液体积的10～20倍。透析完成后，分别收集透析袋内液和透析袋外液。对收集的透析袋外液，用稀盐酸调节ph值为6.5～7.0后送至生化处理池进行净化，达标后排放；对收集的透析袋内液，即制备出回收苯丙氨酸和赖氨酸水溶液，调节其中的苯丙氨酸和赖氨酸浓度后可用于下批次第(1)步制备苯丙氨酸和赖氨酸水溶液。
(8)制备再生树脂柱
第(5)步完成后，向第(5)步收集的卸载苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸的树脂柱中泵入纯净水进行洗涤，直至洗涤液ph值达到7.5～8.5时止。分别收集洗涤后的树脂柱和洗涤液，对收集的洗涤后的树脂柱，即制备出再生树脂柱，可用于下批次进行荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸处理；对收集的洗涤液，泵入生化处理池进行处理，达标后排放。
本发明采用上述技术方案后，主要有以下特点：
1、本发明方法在乙二醇非水介质中用酶作为催化剂合成苯丙氨酰-赖氨酸二肽，具有条件温和，专一性强，合成效率高，无副反应等优势，苯丙氨酰-赖氨酸二肽总收得率以苯丙氨酸计达到85～92％，冻干粉中苯丙氨酰-赖氨酸二肽含量为95～98％。
2、本发明过程中的原料均得到回用，废液进行了生化处理，达标后排放，无“三废”产生，是典型的绿色生产工艺。
3、制备的苯丙氨酰-赖氨酸二肽可广泛用于医药、纺织、食品等领域，具有巨大的社会价值和经济效益。
四、具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步说明本发明。
实施例1
一种合成苯丙氨酰-赖氨酸二肽的方法，其具体工艺步骤如下：
(1)制备苯丙氨酸和赖氨酸水溶液
在搅拌下先后将适量市售苯丙氨酸和赖氨酸溶解于纯净水溶液中，就制备出苯丙氨酸浓度为0.3mol/l，赖氨酸浓度0.3mol/l的水溶液；再用稀氢氧化钠调节该水溶液的ph值为7.5，即制备出苯丙氨酸和赖氨酸水溶液，用于下步制备乙二醇非水反应介质。
(2)制备乙二醇非水反应介质
第(1)步完成后，将第(1)步制备的苯丙氨酸和赖氨酸水溶液与乙二醇溶液混合，其中苯丙氨酸和赖氨酸水溶液与乙二醇的体积之比为1∶5(l/l)，搅拌处理1h，即制备出乙二醇非水反应介质，用于下步制备苯丙氨酰-赖氨酸二肽反应液。
(3)制备苯丙氨酰-赖氨酸二肽反应液
第(2)步完成后，于搅拌下在第(2)步制备的乙二醇非水反应介质中加入活力为1000u/mg的胰凝乳蛋白酶，其中加入胰凝乳蛋白酶的质量与苯丙氨酸和赖氨酸的总质量之比为1∶20(kg/kg)。然后控制温度为35℃，反应15h。反应完成后，升温到80℃，处理15min后抽滤，分别收集滤渣和滤液。对收集的滤液，即制备出苯丙氨酰-赖氨酸二肽反应液，用于下步制备净化荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽的树脂柱。对收集的滤渣，用纯净水反复洗涤，除去乙二醇后用于制备动物饲料添加剂。
(4)制备净化荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽的树脂柱
第(3)步完成后，先将第(3)步制备的苯丙氨酰-赖氨酸二肽反应液用纯净水稀释3倍，再用恒流泵泵入装有活化001×7阳离子交换树脂的树脂柱，其中该树脂柱与第(3)步制备的苯丙氨酰-赖氨酸二肽反应液的体积之比为1∶30(l/l)，泵入该苯丙氨酰-赖氨酸二肽反应液的流速为该树脂柱体积(bv)的2倍。泵入该苯丙氨酰-赖氨酸二肽反应液完成后，分别收集荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸的树脂柱和卸载苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸的过柱液。对收集的荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸的树脂柱，泵入2bv的纯净水洗涤，洗涤完成后分别收集洗涤液和除去乙二醇的荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸的树脂柱。对收集的洗涤液，与收集的过柱液混合，用于制备回收乙二醇；对收集的除去乙二醇的荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸的树脂柱，即制备出净化荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽的树脂柱，用于下步制备苯丙氨酰-赖氨酸二肽洗脱液。
(5)制备苯丙氨酰-赖氨酸二肽洗脱液
第(4)步完成后，先向第(4)步制备的净化荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽的树脂柱中泵入0.1mol/l的氢氧化钠溶液，洗脱苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸，所述氢氧化钠溶液的泵入流速为2bv/h。分别收集第1.5～2.5bv、第3.5～4.5bv、第5.0～6.5bv的洗脱液和卸载苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸的树脂柱。对收集的该卸载树脂柱，用于第(8)步制备再生树脂柱；对收集的第1.5～2.5bv、第5.0～6.5bv的洗脱液，用于第(7)步制备回收苯丙氨酸和赖氨酸水溶液；对收集的第3.5～4.5bv的洗脱液，即制备出苯丙氨酰-赖氨酸二肽洗脱液，用于下步制备苯丙氨酰-赖氨酸二肽冻干粉。
(6)制备苯丙氨酰-赖氨酸二肽冻干粉
第(5)步完成后，将第(5)步制备的苯丙氨酰-赖氨酸二肽洗脱液泵入截留分子量为100da的纳滤器中，在表压为0.1mpa的压力下进行第一次纳滤，直至纳滤截留液与纳滤滤过液的体积之比达到1∶4(l/l)时停止纳滤，分别收集第一次纳滤滤过液和纳滤截留液。对收集的第一次纳滤截留液，再向其中加入纯净水至原体积，进行第二次纳滤，第二次纳滤的条件与第一次纳滤条件相同。第二次纳滤完成后，分别收集第二次纳滤滤过液和截留液。对收集的第二次纳滤滤过液，与第一次纳滤滤过液进行合并，用稀盐酸调节ph值为6.5后，泵入废水处理池进行生化处理，达标后排放；对收集的第二次纳滤截留液，置于低温冰箱中在-40℃的条件下预冻6h，再转移至真空冷冻干燥机中，在温度为-50℃、真空度为20pa的条件下进行冷冻干燥24h，即制备出苯丙氨酰-赖氨酸二肽冻干粉，其总收得率以苯丙氨酸计达到85～92％，该冻干粉中苯丙氨酰-赖氨酸二肽含量为95～98％。
(7)制备回收苯丙氨酸和赖氨酸水溶液
第(5)步完成后，将第(5)步收集的第1.5～2.5bv和第5.0～6.5bv的洗脱液进行合并，先泵入反渗透器中，在表压为0.5mpa的条件下进行反渗透浓缩，直至无反渗透滤过液出现时止。分别收集反渗透滤过液和反渗透截留液，对收集的反渗透滤过液，用于洗涤再生树脂柱；对收集的反渗透截留液，再装入截留分子量为100da的透析袋中，用纯净水进行透析6h，其中纯净水的体积为反渗透截留液体积的10倍。透析完成后，分别收集透析袋内液和透析袋外液。对收集的透析袋外液，用稀盐酸调节ph值为6.5后送至生化处理池进行净化，达标后排放；对收集的透析袋内液，即制备出回收苯丙氨酸和赖氨酸水溶液，调节其中的苯丙氨酸和赖氨酸浓度后可用于下批次第(1)步制备苯丙氨酸和赖氨酸水溶液。
(8)制备再生树脂柱
第(5)步完成后，向第(5)步收集的卸载苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸的树脂柱中泵入纯净水进行洗涤，直至洗涤液ph值达到7.5时止。分别收集洗涤后的树脂柱和洗涤液，对收集的洗涤后的树脂柱，即制备出再生树脂柱，可用于下批次进行荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸处理；对收集的洗涤液，泵入生化处理池进行处理，达标后排放。
实施例2
一种合成苯丙氨酰-赖氨酸二肽的方法，其具体工艺步骤如下：
(1)制备苯丙氨酸和赖氨酸水溶液
在搅拌下先后将适量市售苯丙氨酸和赖氨酸溶解于纯净水溶液中，就制备出苯丙氨酸浓度为0.6mol/l，赖氨酸浓度1.2mol/l的水溶液；再用稀氢氧化钠调节该水溶液的ph值为8.5，即制备出苯丙氨酸和赖氨酸水溶液，用于下步制备乙二醇非水反应介质。
(2)制备乙二醇非水反应介质
第(1)步完成后，将第(1)步制备的苯丙氨酸和赖氨酸水溶液与乙二醇溶液混合，其中苯丙氨酸和赖氨酸水溶液与乙二醇的体积之比为1∶15(l/l)，搅拌处理2h，即制备出乙二醇非水反应介质，用于下步制备苯丙氨酰-赖氨酸二肽反应液。
(3)制备苯丙氨酰-赖氨酸二肽反应液
第(2)步完成后，于搅拌下在第(2)步制备的乙二醇非水反应介质中加入活力为1200u/mg的胰凝乳蛋白酶，其中加入胰凝乳蛋白酶的质量与苯丙氨酸和赖氨酸的总质量之比为1∶35(kg/kg)。然后控制温度为40℃，反应18h。反应完成后，升温到85℃，处理18min后抽滤，分别收集滤渣和滤液。对收集的滤液，即制备出苯丙氨酰-赖氨酸二肽反应液，用于下步制备净化荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽的树脂柱。对收集的滤渣，用纯净水反复洗涤，除去乙二醇后用于制备动物饲料添加剂。
(4)制备净化荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽的树脂柱
第(3)步完成后，先将第(3)步制备的苯丙氨酰-赖氨酸二肽反应液用纯净水稀释5倍，再用恒流泵泵入装有活化d0011离子交换树脂的树脂柱，其中该树脂柱与第(3)步制备的苯丙氨酰-赖氨酸二肽反应液的体积之比为1∶50(l/l)，泵入该苯丙氨酰-赖氨酸二肽反应液的流速为该树脂柱体积(bv)的4倍。泵入该苯丙氨酰-赖氨酸二肽反应液完成后，分别收集荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸的树脂柱和卸载苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸的过柱液。对收集的荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸的树脂柱，泵入4bv的纯净水洗涤，洗涤完成后分别收集洗涤液和除去乙二醇的荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸的树脂柱。对收集的洗涤液，与收集的过柱液混合，用于制备回收乙二醇；对收集的除去乙二醇的荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸的树脂柱，即制备出净化荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽的树脂柱，用于下步制备苯丙氨酰-赖氨酸二肽洗脱液。
(5)制备苯丙氨酰-赖氨酸二肽洗脱液
第(4)步完成后，先向第(4)步制备的净化荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽的树脂柱中泵入0.3mol/l的氢氧化钠溶液，洗脱苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸，所述氢氧化钠溶液的泵入流速为3bv/h。分别收集第1.5～2.5bv、第3.5～4.5bv、第5.0～6.5bv的洗脱液和卸载苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸的树脂柱。对收集的该卸载树脂柱，用于第(8)步制备再生树脂柱；对收集的第1.5～2.5bv、第5.0～6.5bv的洗脱液，用于第(7)步制备回收苯丙氨酸和赖氨酸水溶液；对收集的第3.5～4.5bv的洗脱液，即制备出苯丙氨酰-赖氨酸二肽洗脱液，用于下步制备苯丙氨酰-赖氨酸二肽冻干粉。
(6)制备苯丙氨酰-赖氨酸二肽冻干粉
第(5)步完成后，将第(5)步制备的苯丙氨酰-赖氨酸二肽洗脱液泵入截留分子量为200da的纳滤器中，在表压为0.3mpa的压力下进行第一次纳滤，直至纳滤截留液与纳滤滤过液的体积之比达到1∶4.5(l/l)时停止纳滤，分别收集第一次纳滤滤过液和纳滤截留液。对收集的第一次纳滤截留液，再向其中加入纯净水至原体积，进行第二次纳滤，第二次纳滤的条件与第一次纳滤条件相同。第二次纳滤完成后，分别收集第二次纳滤滤过液和截留液。对收集的第二次纳滤滤过液，与第一次纳滤滤过液进行合并，用稀盐酸调节ph值为6.8后，泵入废水处理池进行生化处理，达标后排放；对收集的第二次纳滤截留液，置于低温冰箱中在-30℃的条件下预冻9h，再转移至真空冷冻干燥机中，在温度为-45℃、真空度为35pa的条件下进行冷冻干燥30h，即制备出苯丙氨酰-赖氨酸二肽冻干粉，其总收得率以苯丙氨酸计达到85～92％，该冻干粉中苯丙氨酰-赖氨酸二肽含量为95～98％。
(7)制备回收苯丙氨酸和赖氨酸水溶液
第(5)步完成后，将第(5)步收集的第1.5～2.5bv和第5.0～6.5bv的洗脱液进行合并，先泵入反渗透器中，在表压为0.6mpa的条件下进行反渗透浓缩，直至无反渗透滤过液出现时止。分别收集反渗透滤过液和反渗透截留液，对收集的反渗透滤过液，用于洗涤再生树脂柱；对收集的反渗透截留液，再装入截留分子量为100da的透析袋中，用纯净水进行透析8h，其中纯净水的体积为反渗透截留液体积的15倍。透析完成后，分别收集透析袋内液和透析袋外液。对收集的透析袋外液，用稀盐酸调节ph值为6.8后送至生化处理池进行净化，达标后排放；对收集的透析袋内液，即制备出回收苯丙氨酸和赖氨酸水溶液，调节其中的苯丙氨酸和赖氨酸浓度后可用于下批次第(1)步制备苯丙氨酸和赖氨酸水溶液。
(8)制备再生树脂柱
第(5)步完成后，向第(5)步收集的卸载苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸的树脂柱中泵入纯净水进行洗涤，直至洗涤液ph值达到8.0时止。分别收集洗涤后的树脂柱和洗涤液，对收集的洗涤后的树脂柱，即制备出再生树脂柱，可用于下批次进行荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸处理；对收集的洗涤液，泵入生化处理池进行处理，达标后排放。
实施例3
一种合成苯丙氨酰-赖氨酸二肽的方法，其具体工艺步骤如下：
(1)制备苯丙氨酸和赖氨酸水溶液
在搅拌下先后将适量市售苯丙氨酸和赖氨酸溶解于纯净水溶液中，就制备出苯丙氨酸浓度为1.0mol/l，赖氨酸浓度2.0mol/l的水溶液；再用稀氢氧化钠调节该水溶液的ph值为9.5，即制备出苯丙氨酸和赖氨酸水溶液，用于下步制备乙二醇非水反应介质。
(2)制备乙二醇非水反应介质
第(1)步完成后，将第(1)步制备的苯丙氨酸和赖氨酸水溶液与乙二醇溶液混合，其中苯丙氨酸和赖氨酸水溶液与乙二醇的体积之比为1∶25(l/l)，搅拌处理3h，即制备出乙二醇非水反应介质，用于下步制备苯丙氨酰-赖氨酸二肽反应液。
(3)制备苯丙氨酰-赖氨酸二肽反应液
第(2)步完成后，于搅拌下在第(2)步制备的乙二醇非水反应介质中加入活力为1500u/mg的胰凝乳蛋白酶，其中加入胰凝乳蛋白酶的质量与苯丙氨酸和赖氨酸的总质量之比为1∶50(kg/kg)。然后控制温度为45℃，反应20h。反应完成后，升温到90℃，处理20min后抽滤，分别收集滤渣和滤液。对收集的滤液，即制备出苯丙氨酰-赖氨酸二肽反应液，用于下步制备净化荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽的树脂柱。对收集的滤渣，用纯净水反复洗涤，除去乙二醇后用于制备动物饲料添加剂。
(4)制备净化荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽的树脂柱
第(3)步完成后，先将第(3)步制备的苯丙氨酰-赖氨酸二肽反应液用纯净水稀释6倍，再用恒流泵泵入装有活化001×7阳离子交换树脂的树脂柱，其中该树脂柱与第(3)步制备的苯丙氨酰-赖氨酸二肽反应液的体积之比为1∶60(l/l)，泵入该苯丙氨酰-赖氨酸二肽反应液的流速为该树脂柱体积(bv)的6倍。泵入该苯丙氨酰-赖氨酸二肽反应液完成后，分别收集荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸的树脂柱和卸载苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸的过柱液。对收集的荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸的树脂柱，泵入6bv的纯净水洗涤，洗涤完成后分别收集洗涤液和除去乙二醇的荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸的树脂柱。对收集的洗涤液，与收集的过柱液混合，用于制备回收乙二醇；对收集的除去乙二醇的荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸的树脂柱，即制备出净化荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽的树脂柱，用于下步制备苯丙氨酰-赖氨酸二肽洗脱液。
(5)制备苯丙氨酰-赖氨酸二肽洗脱液
第(4)步完成后，先向第(4)步制备的净化荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽的树脂柱中泵入0.5mol/l的氢氧化钠溶液，洗脱苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸，所述氢氧化钠溶液的泵入流速为4bv/h。分别收集第1.5～2.5bv、第3.5～4.5bv、第5.0～6.5bv的洗脱液和卸载苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸的树脂柱。对收集的该卸载树脂柱，用于第(8)步制备再生树脂柱；对收集的第1.5～2.5bv、第5.0～6.5bv的洗脱液，用于第(7)步制备回收苯丙氨酸和赖氨酸水溶液；对收集的第3.5～4.5bv的洗脱液，即制备出苯丙氨酰-赖氨酸二肽洗脱液，用于下步制备苯丙氨酰-赖氨酸二肽冻干粉。
(6)制备苯丙氨酰-赖氨酸二肽冻干粉
第(5)步完成后，将第(5)步制备的苯丙氨酰-赖氨酸二肽洗脱液泵入截留分子量为100da的纳滤器中，在表压为0.5mpa的压力下进行第一次纳滤，直至纳滤截留液与纳滤滤过液的体积之比达到1∶5(l/l)时停止纳滤，分别收集第一次纳滤滤过液和纳滤截留液。对收集的第一次纳滤截留液，再向其中加入纯净水至原体积，进行第二次纳滤，第二次纳滤的条件与第一次纳滤条件相同。第二次纳滤完成后，分别收集第二次纳滤滤过液和截留液。对收集的第二次纳滤滤过液，与第一次纳滤滤过液进行合并，用稀盐酸调节ph值为7.0后，泵入废水处理池进行生化处理，达标后排放；对收集的第二次纳滤截留液，置于低温冰箱中在-20℃的条件下预冻12h，再转移至真空冷冻干燥机中，在温度为-40℃、真空度为50pa的条件下进行冷冻干燥36h，即制备出苯丙氨酰-赖氨酸二肽冻干粉，其总收得率以苯丙氨酸计达到85～92％，该冻干粉中苯丙氨酰-赖氨酸二肽含量为95～98％。
(7)制备回收苯丙氨酸和赖氨酸水溶液
第(5)步完成后，将第(5)步收集的第1.5～2.5bv和第5.0～6.5bv的洗脱液进行合并，先泵入反渗透器中，在表压为0.8mpa的条件下进行反渗透浓缩，直至无反渗透滤过液出现时止。分别收集反渗透滤过液和反渗透截留液，对收集的反渗透滤过液，用于洗涤再生树脂柱；对收集的反渗透截留液，再装入截留分子量为100da的透析袋中，用纯净水进行透析10h，其中纯净水的体积为反渗透截留液体积的20倍。透析完成后，分别收集透析袋内液和透析袋外液。对收集的透析袋外液，用稀盐酸调节ph值为7.0后送至生化处理池进行净化，达标后排放；对收集的透析袋内液，即制备出回收苯丙氨酸和赖氨酸水溶液，调节其中的苯丙氨酸和赖氨酸浓度后可用于下批次第(1)步制备苯丙氨酸和赖氨酸水溶液。
(8)制备再生树脂柱
第(5)步完成后，向第(5)步收集的卸载苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸的树脂柱中泵入纯净水进行洗涤，直至洗涤液ph值达到8.5时止。分别收集洗涤后的树脂柱和洗涤液，对收集的洗涤后的树脂柱，即制备出再生树脂柱，可用于下批次进行荷载苯丙氨酰-赖氨酸二肽、苯丙氨酸以及赖氨酸处理；对收集的洗涤液，泵入生化处理池进行处理，达标后排放。